西藏沙棘莖尖組織快繁技術(shù)初步研究

宋維秀，昂毛吉，朋毛卓瑪

（青海大學農(nóng)牧學院，西寧 810016）

西藏沙棘莖尖組織快繁技術(shù)初步研究

宋維秀，昂毛吉，朋毛卓瑪

（青海大學農(nóng)牧學院，西寧 810016）

本文以幼嫩莖尖為外植體，對西藏沙棘進行了組織培養(yǎng)成苗技術(shù)研究。結(jié)果表明，西藏沙棘莖尖生長最適宜的基本培養(yǎng)基為1/2 MS；莖尖生長最佳生長調(diào)節(jié)劑濃度配比為：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.l mg/L；蔗糖濃度為2.0 mg/L時西藏沙棘莖尖生長苗高均值最大，達到2.82 cm。莖尖在增殖生長過程之中，適當?shù)霓D(zhuǎn)接周期能改善芽苗枯死現(xiàn)象。轉(zhuǎn)接周期為15 d時，芽苗枯死率最低為16.33%；當轉(zhuǎn)接周期延長至30 d時，芽苗枯死率明顯升高，達到52.67%。

西藏沙棘；莖尖；外植體；組織快繁

西藏沙棘（Hippophae thibetana），胡頹子科沙棘屬小灌木，集中分布于青海、西藏、四川等地，具有獨特經(jīng)濟價值和水土保持作用的高寒地區(qū)鄉(xiāng)土造林樹種［1］。因其適宜干燥寒冷風大的高原氣候特點，一般植株矮小，分布于海拔5 000 m以上高寒地區(qū)的植株高僅6～8 cm，且對土壤水分要求不嚴，不僅在潮濕的陰坡有分布，在土壤干旱的小陽坡地也有分布，其水平根系發(fā)達，萌蘗力強［2］。

西藏沙棘繁育主要通過種子和枝條扦插進行繁殖［3］，而有性繁殖難以保持其種性，用無性繁殖技術(shù)通過枝條扦插繁殖成苗率也比較低，且扦插繁育多代后年齡效應(yīng)明顯，易受病毒侵染。這些繁殖技術(shù)都成為西藏沙棘良種繁育推廣的障礙［4-5］。實踐證明，組織快繁技術(shù)已經(jīng)成為苗木規(guī)模化生產(chǎn)、開展基因遺傳育種、保存種質(zhì)資源研究的高效途徑之一［6-7］。迄今為止，西藏沙棘組織快繁技術(shù)國內(nèi)外尚未見研究報道，因此對西藏沙棘進行組織快繁技術(shù)研究具有一定的理論與實踐意義。本文以西藏沙棘莖尖為外植體，研究分析不同培養(yǎng)基種類、蔗糖濃度、生長調(diào)節(jié)劑（6-BA）濃度與生長素（NAA）濃度配比、轉(zhuǎn)接周期等對莖尖生長的影響，為西藏沙棘組織培養(yǎng)提供一定的理論和實踐基礎(chǔ)。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

試驗材料來源于青海省湟源縣大石崖村，2013 年3月將野生西藏沙棘苗移栽至大田馴化，2013年10月將其移栽至花盆，并置于實驗室培養(yǎng)。

1.2 設(shè)計方法

1.2.1 外植體處理

經(jīng)過盆栽后，選擇西藏沙棘長勢較好的枝條，剪取1～2 cm帶有腋芽的莖尖，放入容器杯中依次用自來水、肥皂水、蒸餾水清洗。沖洗完畢后，將材料置于超凈工作臺上，接著用70%的酒精消毒10 s，再用0.1%HgC12溶液滅菌5～6 min，最后用無菌水沖洗4～5次。

1.2.2 基本培養(yǎng)條件

參照相關(guān)的文獻資料［8］，各試驗中培養(yǎng)溫度均為（25±2）℃，相對濕度70%～80%，培養(yǎng)基pH值5～6，瓊脂粉2.25 g，每日光照12～14 h，光照強度1 000～5 000 1x，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，每處理15瓶，每瓶接種2～3個莖尖。

1.2.3 培養(yǎng)基篩選

參照西藏沙棘組織培養(yǎng)技術(shù)，以WPM、1/4MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基［5］，每處理接種15瓶，25 d后觀察西藏沙棘嫩莖生長狀況。以西藏沙棘莖尖生長均值為試驗指標，采用單因素對比試驗，篩選出最適宜于西藏沙棘莖尖生長的培養(yǎng)基。

1.2.4 生長調(diào)節(jié)劑篩選

按西藏沙棘組織培養(yǎng)中比較適宜的生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度梯度配比［4］，在篩選出的基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的生長素組合，6-BA設(shè)置4個水平，分別為：0、0.5、1.0、2.0 mg/L；NAA設(shè)置3個水平，分別為：0、0.1、0.5 mg/L；20 d后觀察芽苗生長狀況。每處理均為15瓶，每瓶接種3～5個生長健壯的莖尖，選擇出適宜的6-BA和NAA濃度配比。

1.2.5 蔗糖濃度篩選

蔗糖在植物組織培養(yǎng)基中起到能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑的作用，在適宜的培養(yǎng)基中加入不同濃度的蔗糖（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L），每種處理接種5～6瓶，20 d后觀察苗高的生長狀況，統(tǒng)計頂芽增高均值，通過頂芽增高生長的影響，確定最佳的蔗糖濃度。

1.2.6 轉(zhuǎn)接周期試管苗生長的影響

在芽苗生長過程中，不同轉(zhuǎn)接周期會對芽苗的生長有很大影響。為了克服轉(zhuǎn)接周期對芽苗枯死的影響，試驗以1/2MS為基本培養(yǎng)基，將培養(yǎng)周期分為20、25、30、40 d 4個不同時間周期，每處理轉(zhuǎn)接5～6瓶，以芽苗枯死率為試驗指標，觀察不同的培養(yǎng)周期對芽苗枯死率的影響。

芽苗枯死率（%）=枯死的芽苗個數(shù)/接種數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Exce1和DPS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基篩選

組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的篩選很重要。本試驗在參照以往沙棘組織培養(yǎng)基篩選實驗，分別選用了WPM、1/2MS、1/4MS 3種濃度的基本培養(yǎng)基［9］，不添加任何植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，蔗糖濃度為20%，20 d后觀察西藏沙棘莖尖生長狀況，試驗結(jié)果見表1。

表1 基本培養(yǎng)基對西藏沙棘莖尖苗高生長統(tǒng)計表

從表1中可以看出，1/2MS 培養(yǎng)基中沙棘莖尖生長健壯，芽色嫩綠，莖尖高均值最大，為2.82 cm；1/4MS培養(yǎng)基沙棘莖尖生長狀態(tài)一般；WPM培養(yǎng)基中沙棘莖尖長勢最差。1/2MS 培養(yǎng)基中沙棘莖尖高均值與1/4MS培養(yǎng)基沙棘莖尖高均值達到了5%顯著水平，但與WPM培養(yǎng)基沙棘莖尖高均值達到了極顯著差異。由此可見，西藏沙棘莖尖組織培養(yǎng)過程中，1/2MS為較適宜的基本培養(yǎng)基。

對莖尖高生長均值進行新復極差法分析，見表2。從表2中可以看出，不同的培養(yǎng)基對莖尖生長的F值等于101.407，對應(yīng)的相同概率值P=0.000 1＜0.01，說明不同培養(yǎng)基對苗高有極顯著差異。

表2 基本培養(yǎng)基對西藏沙棘莖尖生長方差分析表

2.2 不同濃度 6-BA與NAA的不同組合對西藏沙棘莖尖高生長的影響

莖尖經(jīng)過一段時間的生長必須要轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中才能更好地繼續(xù)生長，在增殖過程中，合適的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及其組合，可以大大提高芽的增殖數(shù)量，擴大繁殖系數(shù)［10］。分析不同濃度6-BA與NAA的不同組合對西藏沙棘莖尖高生長的影響，并進行方差分析和多重比較，結(jié)果見表3～表6。

表3 不同濃度的6-BA與NAA組合對西藏沙棘莖尖高生長的影響

表4 不同濃度6-BA與NAA組合對西藏沙棘莖尖高生長的方差分析

表5 不同濃度6-BA對西藏沙棘莖尖高生長的多重比較

表6 不同濃度NAA對西藏沙棘莖尖高生長的多重比較

從表4中方差分析結(jié)果可以看出，不同濃度的6-BA、NAA對西藏沙棘莖尖增殖影響差異極顯著，說明6-BA與NAA配合有交互作用。

用新復極差法進行進一步多重比較表明，F(xiàn)值等于11.129 0，對應(yīng)的相同的概率值P=0.038 36＜0.05的顯著水平，極差法測驗結(jié)果表明，A1pha0.05（24）=0.210 4，A因素概率值 4.650 0，B因素概率值5.666 7，A×B均方差4.733 3大于臨界值0.210 4。因此得出：6-BA的適宜濃度為1.0 mg/L；NAA的適合濃度為0～0.1 mg/L；兩因素進行交互分析得出1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA為莖尖生長調(diào)節(jié)劑的最佳組合。

2.3 蔗糖濃度對西藏沙棘莖尖高生長的影響

從表7可以看出，蔗糖濃度為2.0 mg/L時，苗高均值最大，為7.3 cm。經(jīng)多重比較得出，蔗糖濃度為2.0 mg/L時與其他3個蔗糖濃度存在極顯著差異，由此可見，2.0 mg/L的蔗糖濃度對苗高的生長最為適宜。

表7 不同蔗糖濃度對西藏沙棘莖尖高生長的影響

對苗高均值進一步進行方差分析（表8），可以看出，不同的蔗糖濃度對苗高生長的F值等于28.330對應(yīng)的相同的概率值為P=0.000 4＜0.01，說明不同濃度的蔗糖對苗高生長有極顯著差異。

表8 不同蔗糖濃度對西藏沙棘莖尖高生長均值方差分析

2.4 轉(zhuǎn)接周期對克服芽苗枯死現(xiàn)象的影響

在西藏沙棘組織培養(yǎng)的整個過程中，不斷出現(xiàn)芽苗逐漸變褐、干枯、繼而死亡的現(xiàn)象。為了盡可能避免這一現(xiàn)象的發(fā)生，試驗以1/4MS為基本培養(yǎng)基，將外植體的轉(zhuǎn)接周期分為15 d、20 d、25 d、30 d，統(tǒng)計芽苗枯死狀況，試驗結(jié)果見表9。

表9 培養(yǎng)周期對西藏沙棘芽苗枯死率的影響

從表9可以看出，轉(zhuǎn)接周期為15 d時，芽苗枯死率最低，為16.33%，與其他轉(zhuǎn)接周期相比，存在極顯著性差異。用Duncan新復極差法對轉(zhuǎn)接周期對西藏沙棘芽苗枯死率進行方差分析（見表10），結(jié)果表明，不同的培養(yǎng)周期對芽苗枯死率的F值343.412 0對應(yīng)的P=0.000 1＜0.01，存在極顯著性差異，由此可見，縮短轉(zhuǎn)接周期，加快轉(zhuǎn)接頻率有助于改善芽苗的生長狀況，能夠在一定程度上克服芽苗的枯死現(xiàn)象。

表10 西藏沙棘芽苗枯死狀況方差分析表

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

西藏沙棘莖尖生長最適宜的基本培養(yǎng)基1/2 MS；莖尖生長中生長調(diào)節(jié)劑6-BA與生長素NAA濃度配比最佳組合為：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；當培養(yǎng)基中蔗糖濃度為2.0 mg/L時西藏沙棘莖尖生長高均值最大，達到2.82 cm； 莖尖的轉(zhuǎn)接周期為15 d時，芽苗枯死率最低；轉(zhuǎn)接周期超過30 d時，芽苗枯死率最高，達到52.67%。

3.2 討論

沙棘組織快繁技術(shù)已經(jīng)很成熟，運用也很廣泛，但對于青海省野生西藏沙棘組織培養(yǎng)技術(shù)研究國內(nèi)外尚未見報道，西藏沙棘的組織培養(yǎng)技術(shù)還在摸索階段，還有大量的工作要做。

西藏沙棘作為高寒地區(qū)經(jīng)濟樹種之一，雖然資源豐富，資源品質(zhì)優(yōu)良，但野生資源引種開發(fā)難度大。因此在西藏沙棘組織培養(yǎng)中外植體的選取顯得至關(guān)重要，不同時間取材對外植體的誘導效果不同。從各種研究中可以看出，沙棘組織培養(yǎng)中外植體的取材時間最好選擇在萌動和發(fā)育早期［10］。在適當?shù)臅r期選擇適當?shù)耐庵搀w，才能培養(yǎng)出更好的幼苗，從而進行大規(guī)模繁育，在西藏沙棘莖尖的組織培養(yǎng)過程中，消毒和滅菌環(huán)節(jié)也很重要，它們是組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)［11］，關(guān)系到芽苗的正常生長。

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（責任編輯：楊婷婷）

Preliminary Study on Rapid Propagation Techniques with on stem-tip tissue Hippophae thibetana

SONG Weixiu，ANG Maoji，PENG Maozhuoma
（College of Agriculture&Animal Husbandry，Qinghai University，Xining 810016，Qinghai，China）

In this paper young and tender stem tips were used as explants to study tissue culture techniques for growing seedlings of Hippophae thibetana.The results showed that the optimal basic culture medium is 1/2 MS；the optimal growth regulator concentration ratio for Hippophae thibetana stem tips growth is 6-BA1.0mg.L-l+NAA0.lmg.L-l；The mean stem-tip height increment reached maximum of 2.82 cm with sucrose concentration of 2.0mg.L-1；In the stem-tip proliferation process，appropriate switching cycles could lessen dieback of bud seedlings；The dieback rate reached minimum of 16.33%with the replanting interval of 15d and increased significantly to 52.67%when the replanting interval extended to 30 d.

Hippophae thibetana；Stem tips；Explants；Rapid propagation with tissue culture techniques

S793.6

A

2095-0152（2016）03-0023-04

2016-03-16

2016-04-26

青海大學中青年基金項目“青海省野生西藏沙棘生物化學特性及組織快繁技術(shù)研究”（編號：2012-QNY-Z）。

宋維秀（1973-），女，副教授，主要從事林木種苗理論與技術(shù)研究。E-mail：songweixiu2003@sina.com