原料藥國際注冊中基因毒性雜質(zhì)的法規(guī)解讀

王睿睿

摘 要 遺傳毒素是一類極富挑戰(zhàn)性的雜質(zhì)，并已被證明即便在低濃度條件下依然具有毒性。因此美國和歐盟的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)以及人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（ICH）都特別指定了它們在原料藥和成品藥中的限量。通過解析原料藥在美國和歐盟注冊中涉及到的關(guān)于基因毒性雜質(zhì)控制的法規(guī)，為中國制藥企業(yè)提供相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)以推動中國藥品出口事業(yè)的增長。

關(guān)鍵詞 原料藥 雜質(zhì) 基因毒性

中圖分類號：R951 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C 文章編號：1006-1533（2016）15-0063-05

Introduction to regulations for genotoxic impurities in API registration

WANG Ruirui*

（Spectrum China Ltd.， Shanghai 201611， China）

ABSTRACT Genotoxic toxin is a very challenging impurity， which has been proved to be toxic even at low level. Thus ICH and other competent authorities in US and EU have established limitation for genotoxic impurities in active pharmaceutical ingredients （API） and finished dosage form. The US and EU regulations concerned with genotoxic impurities are elaborated so as to provide some technical advices for Chinese drug manufacturers and make progress for the business of drug exportation.

KEY WORDS active pharmaceutical ingredients （API）； impurity； genotoxicity

1 藥品中的雜質(zhì)的定義及分類

藥品中的雜質(zhì)定義為無任何療效、且可能引起副作用的物質(zhì)。因此，必須控制雜質(zhì)水平，以確保藥品的安全性達(dá)到人用要求。雜質(zhì)會影響藥品的安全性和研發(fā)時間，例如，藥物開發(fā)中，如果必須采用多種手段進(jìn)行雜質(zhì)表征，并將其去除至可接受水平，所需時間將會顯著增加。根據(jù)人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（ICH）指南，原料藥相關(guān)的雜質(zhì)可分為三個主要類別：有機(jī)雜質(zhì)、無機(jī)（元素）雜質(zhì)以及殘留溶劑。在這三類中，遺傳毒性雜質(zhì)是一種特例，既便在低濃度條件下也有著重大的安全風(fēng)險。這是因?yàn)樗鼈兛赡芫哂兄峦蛔冃?，可能?dǎo)致DNA損傷，從而增加罹患癌癥的風(fēng)險。

原料藥中的雜質(zhì)來源包括以下幾個方面：①原料及其污染物；②試劑和催化劑；③溶劑；④中間體；⑤降解產(chǎn)物；

為保護(hù)患者，需要將藥物的雜質(zhì)水平降到可接受的安全限度內(nèi)，因此各國都已相繼制定了雜質(zhì)控制指南，這些指南都專注于利用規(guī)定限度控制藥品中的雜質(zhì)含量，其中由ICH與美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）制定的指南較權(quán)威且影響大。例如，ICH Q3A通過制定雜質(zhì)的報告、鑒定和認(rèn)證閾值以監(jiān)管新原料藥中的雜質(zhì)[1]。ICH Q3B是其同等的新藥雜質(zhì)指南[2]。ICH Q3C和 ICH Q3D分別控制殘留溶劑與重金屬元素雜質(zhì)的限量[3-4]。

已經(jīng)正式生效的ICH M7是ICH專家工作組制定的一本關(guān)于藥物中DNA反應(yīng)性雜質(zhì)的指南[5]，包括如何根據(jù)結(jié)構(gòu)活性分析來評估藥品中雜質(zhì)的潛在基因毒性，如何確定關(guān)鍵毒性閾值（毒性關(guān)注閾值TTC）。此外，還論述了一些特別復(fù)雜的問題和情景，例如，為什么潛在基因毒性物質(zhì)具有相似的分子結(jié)構(gòu)，可能相同的反應(yīng)機(jī)理還不能合并用于TTC的計(jì)算。另一個問題是指南試圖對不同TTC值進(jìn)行澄清，這依賴于使用藥品的時間長度。

2 基因毒性雜質(zhì)的定義

ICH S2（R1）指南中，將遺傳毒性定義為“一個廣泛的術(shù)語，指的是遺傳物質(zhì)中的任意有害變化，而不考慮誘發(fā)該變化的機(jī)制” [6]。而遺傳毒性雜質(zhì)定義為“經(jīng)過適當(dāng)遺傳毒性試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，例如，?xì)菌基因突變（Ames）試驗(yàn)，證實(shí)具有遺傳毒性的雜質(zhì)”。潛在遺傳毒性雜質(zhì)（potential genotoxic impurity）定義為“具有遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，但未經(jīng)實(shí)驗(yàn)測試模型驗(yàn)證” [7]。

3 有關(guān)基因毒性雜質(zhì)的研究

3.1 在基因毒性雜質(zhì)來源方面的研究

Szekely等[8]提供了較詳細(xì)的分析，列出了具有基因毒性行為的警示結(jié)構(gòu)及與其有關(guān)的各種化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)被現(xiàn)代的制藥開發(fā)及生產(chǎn)廠商普遍使用。同時還將這些基因毒性雜質(zhì)按照化學(xué)反應(yīng)中起到的不同作用進(jìn)行分類：①來源于反應(yīng)物的結(jié)構(gòu)有鹵代烷、二羥基硫酸鹽、環(huán)氧化合物、肼、四甲基哌啶氧化物、芳香胺、硼酸；②來源于副反應(yīng)的結(jié)構(gòu)有：磺酸酯、鹵代烷、乙酰胺。

3.2 在基因毒性雜質(zhì)分析方面的研究

Liu等[9]報道了關(guān)于藥物中遺傳毒性雜質(zhì)痕量分析的研究進(jìn)展。這篇文章從行業(yè)角度闡述了化學(xué)品開發(fā)中經(jīng)常遇到的不同結(jié)構(gòu)類型遺傳毒性雜質(zhì)的分析。

Elder等[10]描述了活性藥成分（API）和藥品中肼類、酰肼類和腙類遺傳毒性雜質(zhì)的分析。尤其值得注意的是其中使用了多種技術(shù)，包括色譜和光譜，且樣品大多進(jìn)行了衍生化處理。

Elder等[11]報道了API 中芐基鹵類及其它相關(guān)活性有機(jī)鹵化物等潛在遺傳毒性雜質(zhì)的分析，并對分離技術(shù)進(jìn)行了分類，包括配有不同檢測器（質(zhì)譜等）的氣相色譜和高效液相色譜，以及薄層色譜和毛細(xì)管電泳。

3.3 在基因毒性雜質(zhì)去除方面的研究

Robinson[12]提出了一些遵守監(jiān)管指南的控制策略，并對每種方法進(jìn)行舉例說明：①重新設(shè)計(jì)原料藥合成途徑，以避免引入有問題的雜質(zhì)；②修改相關(guān)工藝參數(shù)，以去除此類雜質(zhì)或?qū)⑵浣档椭敛伙@著的水平；③加深工藝?yán)斫?，以證明特定的遺傳毒性雜質(zhì)不會生產(chǎn)或可被有效去除；④進(jìn)行毒性研究，以論證可以雜質(zhì)在設(shè)定的低濃度下不具有危害性。Szekely等[8]提出了在很多實(shí)際情況下，具有反應(yīng)活性和合成用途的反應(yīng)物及中間體很可能會與DNA發(fā)生反應(yīng)，而且這類化合物在藥物開發(fā)階段很難避免使用以控制或者降低基因毒性雜質(zhì)，尤其是在工藝放大的階段更難實(shí)現(xiàn)，因此，目前普遍采用的策略為對基因毒性雜質(zhì)的預(yù)防，即關(guān)于除去或者降低關(guān)鍵合成步驟中的基因毒性雜質(zhì)的濃度。他們還分別從兩個方面討論去除基因毒性雜質(zhì)的方法：①改變合成反應(yīng)條件，包括改變反應(yīng)組分的比例；變換反應(yīng)組分的添加順序；改變起始物料的質(zhì)量或者制備方法；采用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念控制基因毒性雜質(zhì)等；②優(yōu)化API純化過程，包括調(diào)整諸如反應(yīng)度、溶解度、蒸發(fā)度和電離度等沖洗因子和分離技術(shù)。

4 基因毒性雜質(zhì)研究指南

業(yè)界和各國的監(jiān)管機(jī)構(gòu)都已制定了特別針對遺傳毒性雜質(zhì)的指南（表1）

其中與原料藥注冊密切相關(guān)的指南為①PhRMA意見書；②EMA雜質(zhì)限度及其問答指南；③FDA行業(yè)指南（草案）；④ICH M7。

4.1 PhRMA意見書

2004年P(guān)hRMA成立了一個工作小組來討論遺傳毒性雜質(zhì)，成果以意見書的形式公開發(fā)表[13]。

由于這份意見書的制定和EMA相關(guān)官方指南的制定舉措同時進(jìn)行，結(jié)果導(dǎo)致方法有部分重疊。例如PhRMA文件使用了EMA草案中毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）的概念，而EMA最終版指南中推薦了由PhRMA工作小組提出的分期TTC方法。因此，這兩個文件在方法和側(cè)重點(diǎn)上互為補(bǔ)充。

PhRMA文件引入了兩個重要的創(chuàng)新理念：

1）遺傳毒性雜質(zhì)的五級分類系統(tǒng) ①已知具有基因毒性（突變性）和致癌性的雜質(zhì)，包括已知的動物致癌物和人類致癌物，其遺傳毒性機(jī)制有可靠數(shù)據(jù)支持。雜質(zhì)的遺傳毒性本質(zhì)可由已發(fā)表的化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)加以證明。②已知具有基因毒性（突變性），但致癌性未知的雜質(zhì)，包括基于常規(guī)遺傳毒性試驗(yàn)證實(shí)有致突變性的雜質(zhì)。③具有警示結(jié)構(gòu)，但與API結(jié)構(gòu)無關(guān)，同時和具有未知的基因毒性（突變性）潛力的結(jié)構(gòu)也無關(guān)，包括功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)與遺傳毒性相關(guān)的雜質(zhì)。然而，這些基團(tuán)還未作為單獨(dú)化合物進(jìn)行檢驗(yàn)，而是基于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和使用基礎(chǔ)知識的構(gòu)效關(guān)系（SAR）專家系統(tǒng)對其進(jìn)行鑒定。這些警示性的功能基團(tuán)不存在于API的結(jié)構(gòu)中。有一些結(jié)構(gòu)被廣泛認(rèn)為具有與DAN反應(yīng)的活性，如致突變作用。Müller等[13]提出的能與DNA發(fā)生反應(yīng)的一些警示結(jié)構(gòu)（圖1）。④含有與API相關(guān)的警示結(jié)構(gòu)及與API結(jié)構(gòu)相同的警示功能基團(tuán)的雜質(zhì)。⑤無警示結(jié)構(gòu)或未表現(xiàn)潛在遺傳毒性。迄今為止，這項(xiàng)策略已基本上成為業(yè)內(nèi)大多遺傳毒性雜質(zhì)相關(guān)風(fēng)險評估的標(biāo)準(zhǔn)。

2）臨床實(shí)驗(yàn)材料的分期TTC概念 分期TTC意味著可以根據(jù)劑量和臨床試驗(yàn)的持續(xù)時間對其進(jìn)行調(diào)整，使得劑量增加時TTC降低，持續(xù)時間較短時TTC提高（表2）。根本原因在于臨床試驗(yàn)的用藥持續(xù)時間有限，且總體暴露量相對較低。初始TTC保守的風(fēng)險評估意味著該方法對絕大多數(shù)物質(zhì)（強(qiáng)致癌物質(zhì)除外）具有很高的安全系數(shù)。分期TTC值應(yīng)適用于開發(fā)中的所有階段以及每一個化合物，以防多種遺傳毒性雜質(zhì)同時存在。這個概念的一個例外是強(qiáng)效致癌物。

兩個概念的引入旨在為行業(yè)在新藥開發(fā)階段提供一些靈活性和風(fēng)險減輕策略。同時，分期TTC方法也是EMA和FDA遺傳毒性雜質(zhì)指南的一個基本要素[7，14-15]。

4.2 EMA指南

EMA作為監(jiān)管機(jī)構(gòu)先驅(qū)，推行了處理遺傳毒性雜質(zhì)的詳細(xì)指南。制定草案的任務(wù)由專利藥品委員會（CPMP），如今稱為人用藥品委員會（CHMP）的安全工作組（SWP）承擔(dān)。SWP委員會認(rèn)為具有潛在遺傳毒性的雜質(zhì)是一個特例，沒有涵蓋在Q3A和Q3B指南中，因此當(dāng)初為了彌補(bǔ)ICH指南中雜質(zhì)控制部分的空缺，特別是針對那些可能異常強(qiáng)效的潛在雜質(zhì)，例如潛在遺傳毒性雜質(zhì)。委員會建議在ICH限度中加入基于風(fēng)險的安全因素，這與Q3C中使用的殘留溶劑方法類似。為征詢公眾意見，在2002年發(fā)表第一版草案，標(biāo)題為遺傳毒性雜質(zhì)限度意見書。并在2004年發(fā)表完整版。從這次發(fā)表以后，歐洲藥品管理局的官方縮略名由EMEA變更為EMA。2006年6月，EMA的CHMP發(fā)布了遺傳毒性雜質(zhì)限量指南的最終版。CHMP安全工作組發(fā)布了一些問答文件進(jìn)一步解釋說明，極大地完善了該指南。文件適用于新原料藥中的遺傳毒性雜質(zhì)，也適用于一些現(xiàn)有活性物質(zhì)的新應(yīng)用，在這些應(yīng)用中，與已獲得授權(quán)的含有相同活性物質(zhì)的產(chǎn)品相比，其合成路線、工藝控制和雜質(zhì)分析的評估不能合理保證未引入新的或更高水平的遺傳毒性雜質(zhì)。在目前情況下將一個化合物歸類為遺傳毒性物質(zhì)，一般意味著以可能直接損傷DNA的物質(zhì)為重點(diǎn)的體外或體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)，得出了陽性結(jié)果。并在充分的后續(xù)試驗(yàn)中，評估了獨(dú)立的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)聯(lián)性。

指南建議將遺傳毒性雜質(zhì)分為具有充分（試驗(yàn)）證據(jù)證明其閾值相關(guān)機(jī)理的雜質(zhì)和無充分（試驗(yàn)）證據(jù)證明其閾值相關(guān)機(jī)理的雜質(zhì)。并建議將相關(guān)實(shí)驗(yàn)限定于特定雜質(zhì)，這些雜質(zhì)基于化學(xué)反應(yīng)知識、分子結(jié)構(gòu)、原材料中的雜質(zhì)類型和含量，以及現(xiàn)有的遺傳毒性數(shù)據(jù)，可合理預(yù)測其具有遺傳毒性。

具有充分證據(jù)證明其閾值相關(guān)機(jī)理的遺傳毒性數(shù)據(jù)雜質(zhì)將按照ICH Q3C（R3）中的2類溶劑的方法進(jìn)行處理。該方法計(jì)算“每日允許暴露量（PDE）”。根據(jù)最相關(guān)動物研究中的“未觀察到的作用的劑量”或替代性的“觀察到最低作用的劑量”，并結(jié)合多種不確定因素所得。

4.3 FDA指南草案

2008年12月，美國FDA發(fā)布了行業(yè)指南草案，原料藥和成品藥中的遺傳毒性和致癌性雜質(zhì)-推薦方法。FDA指南針對已知或可疑的潛在遺傳毒性和致癌雜質(zhì)的安全認(rèn)證提供了具體建議。指南描述了許多用以表征及減少患者暴露于遺傳毒素和致癌性雜質(zhì)導(dǎo)致的潛在癌癥風(fēng)險的方法。這些方法與EMA指南相似，包括三個步驟：①改變合成和/或純化路線，使相關(guān)雜質(zhì)生產(chǎn)最少，和/或最大程度去除相關(guān)雜質(zhì)；②將相關(guān)雜質(zhì)的日最大暴露指標(biāo)1.5 mg作為總體目標(biāo)；③進(jìn)一步表征遺傳毒性和致癌性風(fēng)險，以更好地支持適當(dāng)?shù)碾s質(zhì)限量指標(biāo)，無論是上限值還是下限值。

FDA指南使用與EMA指南相同或相似的方法；但是，他們也有一些關(guān)鍵區(qū)別（表3）。

4.4 ICH M7

已經(jīng)生效的ICH M7 題為：ICH M7為限制在藥物中具有DNA活性（誘變性）雜質(zhì)進(jìn)行的評估和控制以限制潛在的致癌風(fēng)險。該指南與現(xiàn)行的EMA指南相似，特別是警示結(jié)構(gòu)、Ames試驗(yàn)、TTC概念的應(yīng)用及風(fēng)險評估的相關(guān)部分。此外，它還討論了其他問題，例如怎樣處理具有相似作用機(jī)理的多種結(jié)構(gòu)相關(guān)遺傳毒性物質(zhì)，以及在計(jì)算TTC時是否應(yīng)對它們求和。

5 結(jié)論

以上是原料藥在美國和歐盟注冊中所涉及到的關(guān)于基因毒性雜質(zhì)控制的法規(guī)，在實(shí)際申報注冊中，申請人應(yīng)該指明涉及到的所有具有基因毒性或有致癌性的化學(xué)物質(zhì)，如所用試劑、中間體、副產(chǎn)品等。制藥企業(yè)應(yīng)該根據(jù)現(xiàn)有的生產(chǎn)技術(shù)，采用合理的生產(chǎn)方法。如果在合成路線、起始物料方面沒有更好的選擇，則需要提供一個正當(dāng)?shù)睦碛桑褪俏镔|(zhì)中能引起基因毒性和致癌性的結(jié)構(gòu)部分在化學(xué)合成是不可避免的。

假如基因毒性雜質(zhì)被認(rèn)為是不可避免的，那么應(yīng)該采取技術(shù)手段盡可能地減少基因毒性雜質(zhì)在產(chǎn)品中的含量，使其符合安全的需要或使其降低到一個合理的水平。對于活性中間體、反應(yīng)物、以及其它化合物的化學(xué)穩(wěn)定性都應(yīng)該進(jìn)行評估。并采用合理的分析方法去檢測和量化這些雜質(zhì)的殘留量。

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