巴氏醋酸桿菌滬釀1.01對液體保藏中醋酸脅迫的生理應答

馬新鳳，陳義倫*，周波，李超男，吳慧，黃穎倩，張玉環(huán)，郭莎莎

1(山東農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271018) 2(山東農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山東 泰安，271018)

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巴氏醋酸桿菌滬釀1.01對液體保藏中醋酸脅迫的生理應答

馬新鳳1，陳義倫1*，周波2，李超男1，吳慧1，黃穎倩1，張玉環(huán)1，郭莎莎1

1(山東農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271018) 2(山東農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山東 泰安，271018)

以AcetobacterpasteurianusHuniang 1.01為試驗菌株，采用不同醋酸酸度保藏液保藏醋酸菌，每周檢測活菌數(shù)、酸度、乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)、乙醛脫氫酶(Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)活性及細胞多糖含量隨保藏時間的變化，通過顯微鏡觀察醋酸菌細胞形態(tài)，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析細胞膜脂肪酸成分的變化。結(jié)果表明，活菌數(shù)先緩慢后快速地減少，脫氫酶系活性呈現(xiàn)波動變化狀態(tài)，酸度變化幅度很小，呈平緩上升趨勢；隨著酸度的過度上升，活菌數(shù)、ADH、ALDH活性降低，醋酸菌的生長和產(chǎn)酸代謝活動受到抑制，細胞形態(tài)由規(guī)則的橢圓形變?yōu)椴灰?guī)則的長棒桿狀，細胞多糖含量增加，細胞膜不飽和脂肪酸的相對含量顯著提高。初步斷定AcetobacterpasteurianusHuniang 1.01主要依靠改變乙醇呼吸鏈酶活力、細胞形態(tài)、細胞膜脂肪酸組分，增加細胞莢膜多糖的分泌和細胞膜的流動性等機制的協(xié)同作用來適應液體保藏過程中醋酸脅迫產(chǎn)生的不良環(huán)境。

巴氏醋酸桿菌滬釀1.01；液體保藏；酸度；生長；細胞形態(tài)；細胞膜脂肪酸

醋酸菌(Acetobacter)屬于變形菌綱，醋桿菌科，嚴格好氧[1]，被廣泛用于食醋釀造工業(yè)[2]。醋酸菌是重要的微生物資源，選育的醋酸菌必須保持其優(yōu)良性狀才不至于降低生產(chǎn)性能，能長期在生產(chǎn)中使用。目前，食醋工業(yè)生產(chǎn)中醋酸菌大多采用固體斜面保藏法，食醋生產(chǎn)廠家主要依靠頻繁傳代的培養(yǎng)方法來保證醋酸菌活性[3]，此法保藏的醋酸菌菌種退化快，易變異。依據(jù)德國制醋“種醋不分，醋種同源”[4]的理論，發(fā)酵醋液、醋醅是良好的醋酸菌種來源，也是有利于醋酸菌保藏的一種方法，采用液體方式保藏醋酸菌簡易實用，但保藏的醋酸菌不可避免的暴露于醋酸的壓力下，低濃度醋酸無法抑制菌體的生長和代謝活動，高濃度醋酸容易經(jīng)過細胞膜滲透到細胞質(zhì)中，對菌體生長及代謝產(chǎn)生不利影響。

目前研究表明，醋酸菌的耐醋酸機制包括：(1)ABC轉(zhuǎn)運子機制：aatA是一個與細菌耐酸性有關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運子，廣泛存在于多種醋酸菌中，Nakano等[5]證實，aatA的功能可能是作為醋酸的外排泵。(2)醋酸過氧化機制：主要是在乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶AarC的作用下氧化醋酸并使其進入乙醛酸循環(huán)途徑來實現(xiàn)的[6]。(3)醋酸耐受相關(guān)蛋白的表達：醋酸能夠誘導包括分子伴侶GrpE、GroES和GroEL等的表達[7]，ATP依賴的轉(zhuǎn)運蛋白ClpB[8]等也與醋酸耐受性相關(guān)。(4)基因與酶調(diào)控機制：當胞內(nèi)醋酸濃度需要降低時，aarA、aarB、aarC三個aar基因協(xié)同形成一個不同于傳統(tǒng)TCA的完整循環(huán)[9]。以上探究的耐酸機制都是相對獨立的，醋酸菌耐酸機理應該是一個有機協(xié)調(diào)的整體。因此，酸度對醋酸菌生理的整體影響需深入研究闡明。本文研究了液體保藏巴氏醋酸桿菌對醋酸形成的脅迫環(huán)境在脫氫酶系、細胞形態(tài)、菌體生長和生理調(diào)節(jié)方面的影響，探討了巴氏醋酸桿菌在液體保藏過程中的耐酸機制，以期為提高食醋及醋酸飲料液態(tài)保藏菌種性能和標準化生產(chǎn)提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌種

AcetobacterpasteurianusHuniang 1.01(ApH.1.01)，為本實驗室研究用菌株，由山東大學微生物系提供。

1.1.2培養(yǎng)基

醋酸菌增殖培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母粉1 g，KH2PO40.05 g，MgSO40.05 g，蒸餾水100 mL，pH 5.5，無水乙醇3.5 mL，在培養(yǎng)基滅菌后冷卻至60 ℃以下后加入。

醋酸菌液體保藏培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母粉1 g，蒸餾水100 mL，pH 5.5，無水乙醇3.5 mL，在培養(yǎng)基滅菌后冷卻至60 ℃以下后加入。

醋酸菌平板培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母粉1 g，CaCO32 g，瓊脂1.8 g，蒸餾水100 mL，pH自然，無水乙醇3.5 mL，在培養(yǎng)基滅菌后冷卻至60 ℃以下后加入。

1.2儀器與設備

T6紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；QLYMPUS奧林巴斯CX21生物顯微鏡，上海茸研儀器有限公司；TGL-20bR高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；GCMS-TQ8030三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.3試驗方法

1.3.1菌種活化

向已滅菌冷卻的100 mL醋酸菌增殖培養(yǎng)基中加入3.5 mL無水乙醇，從斜面試管保藏的ApH 1.01醋酸菌刮下2環(huán)接入其中，30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)20 h，活化2次，使其中的菌體濃度達到108CFU/mL以上。

1.3.2生長曲線的繪制

取26個裝有液體保藏培養(yǎng)基容量為250 mL的三角瓶，每瓶含液量100 mL，分別加入5 mL二次活化菌液，30 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)，從0～72 h每隔6 h取出2個，測定OD600值，取平均值，繪制生長曲線，確定收種時間，同時測定此時間的具體活菌數(shù)。

1.3.3酸度對菌體生長和生理代謝的影響

選10個1 000 mL的錐形瓶，裝入液體保藏培養(yǎng)基400 mL，滅菌冷卻后加入14 mL無水乙醇，移接二次活化液10%的體積分數(shù)至其中，30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)至收種時間后進行活菌計數(shù)，測定酸度、乙醇濃度、細胞多糖含量、ADH、ALDH活性，根據(jù)測定結(jié)果分別調(diào)整酸度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 g/L，乙醇的體積分數(shù)全部調(diào)整為3%，為減少空氣含量轉(zhuǎn)移250 mL至250 mL已滅菌錐形瓶，換上滅菌橡皮塞，包裹封口，置4 ℃冰箱保藏。每周取出，測定其活菌數(shù)、酸度、ADH活性、ALDH活性、細胞多糖含量，計算醋酸菌存活率，連續(xù)測定4周，第4周時用顯微鏡觀察不同酸度下的細胞形態(tài)，采用氣質(zhì)聯(lián)用測定細胞膜脂肪酸的成分。

1.4分析方法

1.4.1活菌數(shù)

稀釋涂布平板計數(shù)法。

1.4.2總酸

GB/T 12456—2008 食品中總酸的測定。

1.4.3乙醇濃度的測定

GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法。

1.4.4ADH、ALDH活性的測定

參照Wood氏法[10]。取Mellvaine緩沖液0.5 mL(pH4.0)，體積分數(shù)為10%的TritonX-100溶液0.1 mL，1 mol/L乙醇(乙醛)溶液0.1 mL，發(fā)酵液0.2 mL，0.1 mol/L鐵氰化鉀溶液0.1 mL于25 mL的比色管中，25 ℃保溫5 min，加入硫酸鐵-Dupanol溶液0.5 mL，蒸餾水3.5 mL混合后，25 ℃條件下放置20 min(同時作空白對照)后，紫外分光光度計測定OD660值。在上述條件下，每分鐘催化氧化1 μmol乙醇(乙醛)為1個酶活力單位。

1.4.5顯微鏡分析

濕墨汁法[11-12]。取3 mL菌液于離心管中，6 000 r/min離心8 min，去掉上清液，得到濕菌泥，加1滴過濾之后的墨汁于潔凈載玻片上，挑少量菌泥與之充分混合，將一潔凈蓋玻片蓋于混合液上，然后在蓋玻片上放一濾紙，向下輕壓以吸去多余的混合液，鏡檢。

1.4.6細胞多糖含量[13]

苯酚-硫酸法。取3 mL菌液于離心管中，11 500 r/min離心12 min，收集沉淀，沉淀中加入3 mL 質(zhì)量分數(shù)為3%的EDTA溶液，混勻，11 500 r/min離心12 min，上清液用孔徑為0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液為待測的多糖樣品，取1 mL濾液，加質(zhì)量分數(shù)為5%的苯酚1 mL，搖勻，加濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置20 min，490 nm測其OD值。

1.4.7氣質(zhì)聯(lián)用測定細胞膜脂肪酸成分

(1)細胞膜脂肪酸的提取及甲酯化。將樣品于4 ℃ 6 000 r/min離心15 min，得濕菌體，并用無菌生理鹽水反復洗滌2次并離心。在上述洗滌后的菌泥中加入1 mL濃度為1 mol/L的甲醇鈉溶液，劇烈振蕩1 min，加入1 mL正己烷溶液，振蕩20 s[14]，6 000 r/min離心15 min后，取上清液，有機系濾頭過濾，待測。

(2)GC-MS操作條件。色譜條件：Rtx-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm，進樣口溫度250 ℃，起始柱溫100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至150 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至225 ℃，保持5 min；載氣：高純氦氣；載氣流速：1.0 mL/min；進樣方式：不分流；進樣量：1 μL；接口溫度：230 ℃。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描模式：Scan，掃描質(zhì)量范圍50～600 m/z，溶劑延遲2 min。

(4)脂肪酸質(zhì)量分數(shù)計算[15]。醋酸菌菌株細胞膜脂肪酸的峰面積總和認為是100%，根據(jù)每種脂肪酸峰面積占總峰面積的比例計算細胞膜脂肪酸的相對質(zhì)量分數(shù)，即：某種脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)=某脂肪酸峰面積/脂肪酸峰面積總和×100%。

1.4.8數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel、Origin8.5軟件進行處理和分析。

2　結(jié)果與分析

2.1醋酸菌生長曲線與醇/酸轉(zhuǎn)化規(guī)律

由圖1可知，醋酸菌依次經(jīng)歷生長延滯期(0～6 h)、對數(shù)生長期(6～18 h)、穩(wěn)定期(18～48 h)、衰亡期(48～72 h)4個階段，該菌最大比生長速率為0.1 h-1。由圖2可知，醋酸菌產(chǎn)醋酸過程大致分3個階段，即高速積累期(0～48 h)，平緩增長期(48～60 h)，同化消耗期(60 h～)。發(fā)酵至18 h，即對數(shù)生長期后期，菌體生長旺盛且菌體量未達到最大，適于收種。此時酸度約6.41 g/L，乙醇的體積分數(shù)約1.97%，活菌數(shù)約1.79×108CFU/mL。

圖1　ApH 1.01的生長曲線Fig.1　The growth curve of ApH 1.01

圖2　ApH 1.01的醇/酸轉(zhuǎn)化曲線Fig.2　Alcohol and acidity metabolism curves of ApH 1.01

2.2酸度對醋酸菌生長與生理代謝的影響

2.2.1保藏過程中活菌數(shù)的變化

當酸度超過6 g/L時，保藏第3周活菌數(shù)已小于106CFU/mL，選取前7個梯度作圖。如圖3所示，在保藏第1周內(nèi)活菌數(shù)均下降緩慢，之后呈現(xiàn)快速下降趨勢。對比得知，在保藏期間，酸度太低太高都不利于醋酸菌存活，尤其是高酸度下后期保藏過程中活菌數(shù)急劇減少，酸度2 g/L時活菌數(shù)高于其他，較適于醋酸菌保藏。

圖3　保藏過程中活菌數(shù)變化曲線Fig.3　Curves of the living bacterium change during the preservation

2.2.2保藏過程中酸度的變化

由圖4可以看出，整個保藏過程酸度為0、1 g/L時增速較大，其他酸度下呈平緩上升趨勢，變化幅度很小。表明，在保藏過程中低酸度無法抑制醋酸菌產(chǎn)酸代謝活動。

圖4　保藏過程中酸度變化曲線Fig.4　Curves of acidity change during the preservation

2.2.3保藏過程中ADH、ALDH活性的變化

由圖5可知，1周內(nèi)ADH、ALDH活性迅速下降，而后呈波動上升的變化趨勢。酸度越低，ADH、ALDH活性越高，醋酸菌代謝活動越旺盛。酸度2 g/L的醋酸菌保藏液ADH、ALDH活性處于中間，變化平穩(wěn)，進一步驗證2 g/L的酸度能夠在保藏期間起到抑制醋酸菌代謝活動的作用。目前，對于乙醇氧化體系在醋酸菌耐酸中的作用機制還沒徹底探明，但有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)高酸菌的ADH對高濃度的醋酸耐受能力更好[16]。乙醇呼吸鏈的活躍運行有利于形成膜內(nèi)外質(zhì)子梯度和生成ATP，細胞的能量水平可能決定了巴氏醋酸桿菌耐醋酸能力的高低。

圖5　保藏過程中ADH、ALDH活性變化曲線Fig.5　Curves of activity change of ADH and ALDH during the preservation

2.2.4保藏過程中菌體形態(tài)的變化

如圖6所示，低酸度下細胞形態(tài)為規(guī)則的橢圓形，隨著酸度的升高，開始出現(xiàn)棒桿狀的細胞，無論酸度高低，胞外都有明顯的莢膜產(chǎn)生。酸度升至9 g/L時，因受醋酸毒害作用細胞長度進一步增加，呈現(xiàn)不規(guī)則的長棒桿狀。

2.2.5保藏過程中細胞多糖含量的變化

莢膜在多元醇生產(chǎn)菌中較為常見，主要成分是多糖，由圖7可知，整個保藏過程細胞多糖含量呈上升趨勢，酸度越高，菌體細胞越長，細胞表面積越大，產(chǎn)生的胞外莢膜多糖越多，有利于阻止外界環(huán)境中的醋酸穿過周質(zhì)空間進入細胞內(nèi)，減少對細胞的毒害，這既表明了莢膜是該菌在保藏過程中抵御醋酸不良環(huán)境的必要屏障，又與顯微鏡下細胞形態(tài)的相應變化相吻合。ANDRéS-BARRAO等[17]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中莢膜多糖的分泌量是減少的，與本試驗研究保藏過程中的變化不同，可能是菌株為適應發(fā)酵與保藏不同過程、不同環(huán)境而做出的自我調(diào)節(jié)不同導致的。

2.2.6細胞膜脂肪酸組分的變化

除了調(diào)節(jié)莢膜多糖的合成，一些極端微生物通過改變細胞膜不飽和脂肪酸的比例增加膜的流動性來

圖6　保藏過程中菌體細胞形態(tài)的變化Fig.6　Morphologic changes of cells during the preservation

抵抗不利的生存環(huán)境[18]。由圖8和表1可知， 該菌膜脂肪酸主要成分是癸酸(C10∶0)、月桂酸(C12∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1)、硬脂酸(C18∶0)、十九碳烯酸(C19∶1)。不同酸度下細胞膜脂肪酸的種類一樣，相對含量存在差異。由圖9可知，不同酸度下，油酸(C18∶1)占總脂肪酸的比例最大，其次是棕櫚酸(C16∶0)。隨著酸度的升高，總不飽和脂肪酸(C16∶1、C18∶1和C19∶1)的相對含量變大，增加了膜的流動性，長鏈脂肪酸(C14∶0、C16∶0和C18∶0)的相對含量明顯降低，中鏈脂肪酸(C10∶0、C12∶0)的含量輕微降低。總之，隨著酸度的升高，ApH 1.01細胞膜的單不飽和脂肪酸的含量上升，而飽和脂肪酸的含量下降。亓正良等[2]報道了相似的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中隨醋酸積累，膜不飽和脂肪酸比例上升。

圖7　保藏過程中細胞多糖含量變化曲線Fig.7　Curves of cellular polysaccharides change during the preservation

1-癸酸(7.325)；2-月桂酸(11.527)；3-肉豆蔻酸(16.473)；4-棕櫚油酸(20.547)；5-棕櫚酸(21.028)；6-油酸(24.778)；7-硬脂酸(25.11)；8-十九碳烯酸(26.939)圖8　ApH 1.01細胞膜脂肪酸GC-MS總離子流圖(TIC)Fig.8　Total ion chromatogram(TIC)of fatty acids in cell membrane of ApH 1.01

出峰順序脂肪酸特征離子保留時間/min1癸酸74871431867.3252月桂酸748717121411.5273肉豆蔻酸748719924216.4734棕櫚油酸558319423620.5475棕櫚酸748714322721.0286油酸558318026424.7787硬脂酸748725529825.118十九碳烯酸558319427826.939

圖9　ApH 1.01細胞膜脂肪酸的相對含量Fig.9　Membrane fatty acids change of ApH 1.01

3　小結(jié)

試驗結(jié)果表明，隨著保藏時間的延長，ApH 1.01活菌數(shù)先緩慢減少，后快速下降，脫氫酶系活性呈現(xiàn)波動變化狀態(tài)，酸度變化幅度很小，呈平緩上升趨勢，細胞多糖含量增加。隨著酸度的過度升高，醋酸菌的存活性、產(chǎn)酸代謝活動和乙醇呼吸鏈酶活性受到了抑制；細胞形態(tài)由規(guī)則的橢圓形變?yōu)椴灰?guī)則的長棒桿狀；莢膜多糖的含量增多，表明莢膜是巴氏醋酸桿菌抵御醋酸不良環(huán)境的必要屏障；膜不飽和脂肪酸的質(zhì)量百分比變大，有利于增加細胞膜的流動性，適應外界不良環(huán)境。酸度2 g/L較利于液體保藏的醋酸菌存活。據(jù)此推測AcetobacterpasteurianusHuniang 1.01主要依靠改變乙醇呼吸鏈酶活力、細胞形態(tài)、細胞膜脂肪酸組分，增加細胞莢膜多糖的分泌和細胞膜的流動性等機制的協(xié)同作用來適應液體保藏過程中醋酸脅迫產(chǎn)生的不良環(huán)境。

食醋企業(yè)應先探索生產(chǎn)用的各菌株在不同酸度、酒精度下的活性等生理狀態(tài)，以及最適保藏溫度等，針對不同的菌株采取不同的保藏措施，而不是所有的醋酸菌都采用同一種保藏方法，從而提高液態(tài)保藏菌種的性能，延長保藏期限，減小菌種變異幾率，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。

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Physiological response to acetic acid stress of theAcetobacterpasteuranusHN 1.01 during liquid-preservation

MA Xin-feng1, CHEN Yi-lun1*, ZHOU Bo2, LI Chao-nan1, WU Hui1,HUANG Ying-qian1, ZHANG Yu-huan1, GUO Sha-sha1

1(College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China) 2(College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)

The preservation liquid with different acidity was used to preserveAcetobacterpasteurianusHuniang 1.01, a tested acetic acid bacteria. The changes of survival, dehydrogenase activity, acidity, content of cell polysaccharide with the preservation time prolonged were detected. Cell morphological changes were observed with light microscope and alteration of fatty acid components of cell membrane would be also analyzed by Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). On the whole, as the extension of preservation time, the living bacteria number slowly declined at first and then decreased rapidly, while the dehydrogenase activity fluctuated. Acidity changed slightly and rose smoothly. With the excessive increasing of acidity, the growth and metabolic activity of acetic acid bacteria were restrained through the decreased survival rate and dehydrogenase activity. Cell morphology changed from regular oval-shape to irregular long rod-shape. The content of capsular polysaccharide increased. Ratio of unsaturated fatty acids to saturated fatty acids was increased obviously. On the basis of the results obtained from the experiment, it could deduced thatAcetobacterpasteurianusHuniang 1.01 mainly relied on the cooperation of changes of activity of alcohol respiratory chain, cell morphology, membrane fatty acids, extracellular capsular polysaccharide and membrane fluidity to tolerate acetic acid environment．

AcetobacterpasteuranusHuniang 1.01; liquid-preservation; acidity; growth; cell morphology; membrane fatty acids

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601008

碩士研究生(陳義倫教授為通訊作者，E-mail: cylun@ sdau. edu. cn)。

山東省自主創(chuàng)新成果專項(2014ZZCX07301)資助

2015-09-01，改回日期：2015-10-14