共聚物接枝蛋白離子交換色譜介質(zhì)制備及性能

張素玲，楊葳，余林玲，白姝，孫彥，史清洪

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共聚物接枝蛋白離子交換色譜介質(zhì)制備及性能

張素玲，楊葳，余林玲，白姝，孫彥，史清洪

（天津大學(xué)化工學(xué)院生物化工系，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300354）

高容量蛋白質(zhì)色譜介質(zhì)是色譜過程高效化的材料基礎(chǔ)和重要前提。采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）技術(shù)，以甲基丙烯酸3-磺酸丙酯鉀和甲基丙烯酸甲酯（MMA）為單體化合物合成了多種無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)，并對(duì)其蛋白質(zhì)吸附性能進(jìn)行研究。單體總濃度一定情況下共聚物接枝色譜介質(zhì)孔道半徑（pore）隨MMA濃度升高而增大，反映出接枝共聚物鏈漸趨塌陷的特征。蛋白質(zhì)吸附結(jié)果表明，溶菌酶吸附容量取決于介質(zhì)的離子交換容量；而抗體吸附容量則與pore及相應(yīng)的聚合物層厚度變化密切相關(guān)。隨著聚合物層厚度的增大，聚合物層對(duì)抗體的空間排阻作用增強(qiáng)，抗體吸附容量下降。此外，引入MMA優(yōu)化共聚物分子鏈可顯著提高蛋白質(zhì)吸附量，在SEP-S30/M30介質(zhì)中抗體和溶菌酶的飽和吸附量分別達(dá)到237 mg·g-1和380 mg·g-1。無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)孔道內(nèi)聚合物層厚度和蛋白質(zhì)吸附也受無機(jī)鹽濃度調(diào)控。

共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)；原子轉(zhuǎn)移自由基聚合；蛋白質(zhì)；吸附；高容量；抗體

引 言

蛋白質(zhì)離子交換色譜介質(zhì)是蛋白質(zhì)色譜技術(shù)的核心構(gòu)件和技術(shù)創(chuàng)新的物質(zhì)基礎(chǔ)，開發(fā)高容量的蛋白質(zhì)離子交換色譜介質(zhì)成為色譜過程高效化的重要前提。

20世紀(jì)90年代起，以POROS灌注介質(zhì)[1]、超大孔色譜介質(zhì)[2-3]和整體柱介質(zhì)[4-5]為代表的新型色譜材料相繼問世。上述色譜介質(zhì)的共同特征是引入微米級(jí)對(duì)流孔道強(qiáng)化色譜介質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)的傳質(zhì)速率，實(shí)現(xiàn)對(duì)介質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的更有效利用，提高蛋白質(zhì)結(jié)合容量。但傳統(tǒng)色譜介質(zhì)中蛋白質(zhì)的結(jié)合僅發(fā)生在介質(zhì)孔道的表面，飽和吸附容量受限于介質(zhì)的比表面積[6]。HyperD[7]和Fractogel EMD[8]等雜化色譜介質(zhì)通過引入聚丙烯酰胺凝膠或聚合物分子在介質(zhì)孔道內(nèi)構(gòu)建“腳手架”，修飾于聚丙烯酰胺凝膠或聚合物分子上的色譜配基分布于整個(gè)孔道空間而非僅限于孔道表面，由此提供了更多的有效結(jié)合位點(diǎn)，顯著提升了蛋白質(zhì)的飽和吸附容量。作為此類介質(zhì)的一個(gè)成功范例，Sepharose XL離子交換色譜介質(zhì)是將葡聚糖分子接枝在瓊脂糖凝膠粒子上，繼而偶聯(lián)離子交換配基，在介質(zhì)孔道內(nèi)獲得三維的配基分布[9]。Ljunglof等研究表明SP Sepharose XL的Fab抗體飽和吸附容量和動(dòng)態(tài)吸附容量（dynamic binding capacity, DBC）分別可達(dá)295 mg·ml-1和180 mg·ml-1 [10]，并在其綜述中對(duì)截至2011年的聚合物接枝離子交換色譜介質(zhì)的研究進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)[9]。近來，Yu等[11-13]報(bào)道了聚乙烯亞胺直接接枝的瓊脂糖離子交換色譜介質(zhì)的制備方法，其牛血清白蛋白的飽和吸附容量達(dá)到274 mg·ml-1。鑒于介質(zhì)孔道的空間位阻作用和聚合物分子多分散性及其在介質(zhì)孔道內(nèi)的多位點(diǎn)結(jié)合屬性，前述介質(zhì)孔道內(nèi)聚合物接枝過程和接枝聚合物層特性都是難以控制的。本課題組公開了利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）技術(shù)在瓊脂糖色譜介質(zhì)表面接枝單體化合物甲基丙烯酸3-磺酸丙酯鉀（SPM）制備鏈結(jié)構(gòu)可控的聚合物接枝離子交換色譜介質(zhì)的方法[14]，該介質(zhì)的溶菌酶飽和吸附容量高達(dá)413 mg·ml-1。但上述介質(zhì)的抗體飽和吸附容量隨接枝聚合物鏈長度增大而急劇下降至32 mg·ml-1。

為了獲得高抗體吸附容量的聚合物接枝離子交換色譜介質(zhì)，本課題組引入甲基丙烯酸甲酯（MMA），通過其與單體化合物SPM摻雜合成了不同配基分布密度的無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)，系統(tǒng)地研究了離子交換色譜介質(zhì)中聚合物鏈長和配基分布密度對(duì)溶菌酶和抗體離子吸附行為的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

瓊脂糖凝膠Sepharose Fast Flow，購于通用醫(yī)療公司（Uppsala, Sweden）；抗體（來源于牛血清，≥99%，w約155×103）、溶菌酶（來源于雞蛋白，≥90%，w約14.3×103）、-溴異丁酰溴（BIBB）、MMA和SPM，Sigma-Aldrich公司（St. Louis, USA）試劑；,′-二甲基甲酰胺（DMF），購于天津大學(xué)江天化工科技開發(fā)公司；三乙胺（TEA）、溴化亞銅（CuBr）、溴化銅（CuBr2）和2,2′-聯(lián)吡啶（Bpy），購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所?；瘜W(xué)試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)的合成

無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)的合成工藝如圖1所示。瓊脂糖凝膠Sepharose Fast Flow置于G3漏斗中，經(jīng)蒸餾水反復(fù)沖洗并抽干后，稱取15 g抽干介質(zhì)，并將溶劑置換為DMF。處理好的介質(zhì)轉(zhuǎn)入250 ml三口燒瓶，依次加入95 ml DMF和3 ml TEA后，置于冰浴中攪拌均勻。將含20%（體積分?jǐn)?shù)）BIBB的12.5 ml DMF溶液置于恒壓漏斗中，逐滴加入三口燒瓶，滴加結(jié)束后升溫至30℃，反應(yīng)12 h。產(chǎn)物依次經(jīng)DMF、乙醇和去離子水清洗后，得到溴化Sepharose Fast Flow介質(zhì)，記為SEP-Br。

SEP-Br介質(zhì)的共聚物接枝反應(yīng)在100 ml錐形瓶中進(jìn)行。稱取3g SEP-Br介質(zhì)，轉(zhuǎn)移至裝有50 ml 50%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液的錐形瓶中，然后依次加入SPM、MMA、Bpy和CuBr2?；瘜W(xué)試劑的加入量見表1。上述的錐形瓶連續(xù)通入純氮30 min后，迅速加入CuBr，并繼續(xù)通入純氮30 min以完全排空氧氣。錐形瓶密封后置于25℃水浴搖床中，在170 r·min-1下反應(yīng)4 h，然后錐形瓶敞口暴露于空氣中，直至溶液變?yōu)槟G色。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)0.1 mol·L-1EDTA溶液清洗除去Cu2+，再依次用大量乙醇和去離子水清洗，獲得不同種類的無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)，用于蛋白質(zhì)吸附行為的實(shí)驗(yàn)研究。

表1 聚合物接枝離子交換色譜介質(zhì)制備單體用量和介質(zhì)性質(zhì)參數(shù) Table 1 SPM and MMA contents in synthesis of random copolymer-grafted cation-exchangers and properties of cation-exchangers

1.2.2 共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)的表征

無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)、溴化SEP-Br介質(zhì)和Sepharose Fast Flow的紅外光譜采用Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀(MA, USA)測定。測試樣品采用冷凍干燥24 h獲得。色譜介質(zhì)的粒徑采用Mastersizer2000U 粒徑分析儀（Malvern instruments, UK）測定。測定過程重復(fù)3次，得到色譜介質(zhì)的平均粒徑p。共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)的離子交換容量IC采用酸堿滴定法測定[15]。

色譜介質(zhì)的平均孔道半徑pore是以不同分子量的葡聚糖為探針，采用逆體積排阻色譜(iSEC)方法測量[11,16]。待測色譜介質(zhì)填充于TricornTM5/50色譜柱中，柱高控制在5.5 cm±0.2 cm。色譜柱用20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）平衡至少15個(gè)柱體積（CV），直至示差檢測器(RID)的信號(hào)穩(wěn)定并調(diào)零。葡聚糖溶液同樣采用20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液制備后，在0.25 ml·min-1流速下上樣20 μl。上樣結(jié)束后，采用同一緩沖液沖洗色譜柱，記錄不同葡聚糖的保留體積R。

利用式（1）計(jì)算出不同分子量溶質(zhì)的分配系數(shù)D

式中，0為色譜柱空隙體積，ml，由分子量為521×103的葡聚糖分子測得；T為色譜柱總體積，ml，由葡萄糖分子測得。

iSEC實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單一圓柱孔模型擬合，得到介質(zhì)的孔道半徑pore

式中，s為不同溶質(zhì)分子半徑，nm，用黏性半徑η表示；glu為葡萄糖分子半徑，nm。

1.2.3 蛋白質(zhì)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)在25 ml錐形瓶中進(jìn)行[17]。離子交換色譜介質(zhì)經(jīng)蒸餾水清洗并抽濾后，用吸附緩沖液平衡不少于12 h。在本研究中，溶菌酶靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)采用20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)為吸附緩沖液，抗體靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)采用20 mmol·L-1醋酸鹽緩沖液(pH 5.0)為吸附緩沖液。平衡后的色譜介質(zhì)經(jīng)G3漏斗抽干后，稱取0.05 g介質(zhì)，分別置于25 ml錐形瓶中，隨后向錐形瓶中加入5 ml不同濃度的蛋白質(zhì)溶液。錐形瓶置于25℃水浴搖床中，在170 r·min-1下振蕩24 h后取出，在4000 r·min-1下離心5 min收集上清液。最后，以吸附緩沖液為參比，在280 nm下測定上清液中蛋白質(zhì)濃度。

根據(jù)式(3)，求得蛋白質(zhì)的吸附量

式中，0為蛋白質(zhì)溶液初始濃度，mg·ml-1；為蛋白質(zhì)溶液體積，ml；為蛋白質(zhì)吸附量，mg·g-1；為色譜介質(zhì)濕重，g。

靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Langmuir吸附等溫線[式(4)]擬合，可得到蛋白質(zhì)飽和吸附量m和解離常數(shù)d

1.2.4 蛋白質(zhì)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

蛋白質(zhì)在色譜介質(zhì)上的吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)采用間歇攪拌法測定[18]，具體實(shí)驗(yàn)方法如下：100 ml蛋白質(zhì)溶液置于100 ml三口圓底燒瓶中，并插入半月形攪拌槳后，燒瓶置于25℃水浴中，在100 r·min-1條件下勻速攪拌至恒溫。燒瓶內(nèi)蛋白質(zhì)溶液在蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)下以25 ml·min-1的流速經(jīng)孔徑2 μm的不銹鋼濾頭流入U(xiǎn)V-900紫外檢測器的檢測池，在280 nm下測定蛋白質(zhì)濃度，檢測池流出的溶液返回?zé)恐?。本研究中，溶菌酶濃度? mg·ml-1，抗體濃度為0.3 mg·ml-1。當(dāng)吸光度值穩(wěn)定后，稱取0.22 g經(jīng)吸附緩沖液平衡并抽濾后的介質(zhì)加入三口燒瓶中，在線測量蛋白質(zhì)溶液吸光度值隨時(shí)間變化情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用本課題組此前建立的有效孔擴(kuò)散模型分析[11]，求解得到蛋白質(zhì)在離子交換色譜介質(zhì)中的有效孔擴(kuò)散系數(shù)e。

1.2.5 動(dòng)態(tài)吸附容量測定

蛋白質(zhì)的DBC采用迎頭分析法，在?KTA FPLC快速液相色譜系統(tǒng)中測定[15, 19]。在本研究中，溶菌酶的穿透實(shí)驗(yàn)色譜流動(dòng)相為含有不同濃度NaCl的20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 8.0），抗體的穿透實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相為含有不同濃度NaCl的20 mmol·L-1醋酸鹽緩沖液（pH 5.0）；原料液為溶于色譜流動(dòng)相的濃度0為2.0 mg·ml-1的蛋白質(zhì)溶液。填充在Tricorn5/50色譜柱中的色譜介質(zhì)經(jīng)流動(dòng)相平衡至少10個(gè)柱體積后，溶菌酶溶液以1 ml·min-1的流速、抗體溶液以0.2 ml·min-1的流速向色譜柱內(nèi)連續(xù)輸入，直至蛋白質(zhì)在色譜柱出口處完全穿透。蛋白質(zhì)穿透體積（10，ml）根據(jù)色譜柱出口處蛋白質(zhì)濃度達(dá)到原料液濃度10%時(shí)的色譜進(jìn)料體積；色譜柱死體積（0，ml）為蛋白非保留條件下的穿透體積。

抗體的DBC（10，mg·ml-1）可根據(jù)式（5）計(jì)算

式中，B為色譜介質(zhì)填充體積，ml。

本研究的介質(zhì)的動(dòng)態(tài)吸附容量均重復(fù)5次，以評(píng)估合成色譜介質(zhì)的實(shí)用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)的表征

本研究合成的無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)的粒徑見表1。可以看出，離子交換色譜介質(zhì)的平均粒徑介于92～103 μm之間，而且與合成過程中單體化合物無明確的關(guān)聯(lián)。此外，離子交換色譜介質(zhì)的平均粒徑與本課題組此前測定的Sepharose Fast Flow平均粒徑（92 μm±2 μm）相當(dāng)[14]。這說明接枝過程對(duì)瓊脂糖凝膠Sepharose Fast Flow結(jié)構(gòu)沒有顯著的影響。

Sepharose Fast Flow、SEP-Br和共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)SEP-S/M的紅外光譜如圖2所示?？梢钥闯?，SEP-Br的IR光譜[圖2(b)]的1729 cm-1波數(shù)下存在BIBB分子羰基的不對(duì)稱振動(dòng)吸收峰，而Sepharose Fast Flow的IR光譜[圖2(a)]對(duì)應(yīng)波數(shù)處并無此吸收峰，這表明BIBB固定在Sepharose Fast Flow上。因單體化合物MMA和SPM均含有羰基基團(tuán)，故圖2(c)中共聚物接枝色譜介質(zhì)SEP-S30/M60的1729 cm-1波數(shù)下羰基吸收峰顯著增強(qiáng)，并在610 cm-1和523 cm-1波數(shù)下出現(xiàn)了磺酸基的伸縮振動(dòng)峰。IR光譜結(jié)果表明單體化合物SPM和MMA通過ATRP方法已經(jīng)成功接枝于Sepharose Fast Flow表面。

本研究制備的離子交換色譜介質(zhì)的IC結(jié)果亦列于表1。IC結(jié)果顯示，單體化合物總濃度一定條件下，隨著單體化合物SPM的增大，共聚物分子鏈上SPM配基密度增大，離子交換色譜介質(zhì)的IC值升高。IC的最大值（456 μmol·g-1）出現(xiàn)在SEP-S60介質(zhì)上，為SEP-S06/M54介質(zhì)IC值的7.2倍。在單體化合物SPM濃度一定的情況下，單體化合物MMA用量由0增至9 μmol時(shí)，表1中IC值僅在214～263 μmol·g-1之間變化。這說明引入MMA對(duì)離子交換色譜介質(zhì)IC的影響是有限的。

表1列出了本研究合成的聚合物接枝離子交換色譜介質(zhì)的pore。本研究測得Sepharose Fast Flow的pore為19.8 nm±1.4 nm。對(duì)比接枝前、后色譜介質(zhì)pore的變化可知介質(zhì)孔道因聚合物接枝而變小。單體化合物總濃度一定的條件下，SEP-S60具有最小的pore（12.8 nm）。這歸因于SEP-S60中聚合物鏈上較高的SPM配基密度引發(fā)聚合物鏈間強(qiáng)烈的靜電排斥作用。由此，聚合物分子鏈向孔道中心充分伸展，聚合物層厚度增大，介質(zhì)pore減小。隨著MMA的引入，共聚物鏈間的靜電排斥作用逐漸減弱，分子鏈的柔性增加。這引起分子鏈塌陷，漸趨卷曲線團(tuán)狀[20]，直接的表現(xiàn)就是色譜介質(zhì)的pore增大。MMA含量高的兩種介質(zhì)SEP-S06/M54和SEP-S12/ M48具有最大的pore（表1），說明兩種介質(zhì)孔道內(nèi)的共聚物鏈的塌陷最為顯著。當(dāng)SPM濃度一定時(shí)，隨著MMA濃度的升高，單體化合物總濃度提高，因此接枝的共聚物具有更長的分子鏈。表1結(jié)果顯示介質(zhì)的pore由16.6 nm逐步降至9.3 nm。

2.2 離子交換配基密度對(duì)蛋白質(zhì)吸附的影響

圖3給出了初始蛋白質(zhì)濃度為5 mg·ml-1條件下溶菌酶和抗體在不同IC值的共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)內(nèi)的吸附量?？梢钥闯?，SEP-S60介質(zhì)上溶菌酶吸附量最大，抗體吸附量最小。這與本課題組此前的結(jié)果一致[14]。接枝過程中MMA的引入也對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量產(chǎn)生了顯著影響。圖3顯示，SEP-S06/M54和SEP-S12/M48介質(zhì)上溶菌酶和抗體的吸附量均較小，與非接枝離子交換色譜介質(zhì)SP Sepharose FF的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)[14, 21]。SP Sepharose FF的IC值通常在200 μmol·ml-1左右[10]，遠(yuǎn)高于本研究中SEP-S06/M54和SEP-S12/M48介質(zhì)的63～81 μmol·g-1。兩者相近的蛋白質(zhì)吸附量與其在IC值上的差異反映出共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)中孔道內(nèi)三維的配基空間分布在蛋白質(zhì)吸附上的優(yōu)勢。

隨著IC的增大，溶菌酶和抗體的吸附量顯著提高。在SEP-S24/M36中，溶菌酶和抗體的吸附量均達(dá)到220 mg·g-1以上。該吸附量也高于溶菌酶在Fractogel EMD介質(zhì)上的吸附量[22]，屬于典型的蛋白質(zhì)多層吸附。這也從蛋白質(zhì)吸附角度印證了SEP-S24/M36介質(zhì)中離子交換配基呈現(xiàn)空間分布的特征。當(dāng)IC進(jìn)一步增大至228 μmol·g-1及以上時(shí)，溶菌酶吸附量再次階躍提升，在SEP-S30/M30、SEP-S36/M24和SEP-S48/M12中達(dá)到382～440 mg·g-1。與IC值增大相對(duì)應(yīng)的是，此時(shí)pore并未發(fā)生改變（表1）。這意味著介質(zhì)孔道內(nèi)聚合物層中離子交換配基密度增加，可視為溶菌酶吸附量在SEP-S30/M30、SEP-S36/M24和SEP-S48/ M12介質(zhì)中升高的直接原因。在上述介質(zhì)IC值增大的同時(shí)，介質(zhì)pore和抗體吸附量并未明顯變化，各自維持在14.6～15.3 nm和231～262 mg·g-1。而在IC值最大的SEP-S60介質(zhì)中抗體吸附量急劇降低至78 mg·g-1。與之相應(yīng)的是介質(zhì)pore降至12.8 nm。上述結(jié)果充分說明抗體的吸附量很大程度上與pore和聚合物層厚度的變化相關(guān)。已有研究表明[23]，接枝聚合物層對(duì)蛋白質(zhì)分子的空間排阻作用隨聚合物層厚度和蛋白質(zhì)分子量增大而增強(qiáng)。聚合物層厚度增大表現(xiàn)為SEP-S60介質(zhì)pore下降，進(jìn)而導(dǎo)致抗體（w約155×103）吸附量降低。在單體化合物總濃度一定的情況下，這種聚合物層的空間排阻作用對(duì)溶菌酶（w約14.3×103）等小蛋白質(zhì)而言可基本忽略[23]。因此，高容量聚合物接枝離子交換色譜介質(zhì)的設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)IC和pore并重，同時(shí)具備高離子交換配基密度和一定孔道半徑的色譜介質(zhì)（如SEP-S30/M30、SEP-S36/M24和SEP-S48/M12）更加適合于蛋白質(zhì)的高容量吸附。

2.3 共聚物鏈長對(duì)介質(zhì)吸附性能的影響

進(jìn)一步研究了共聚物鏈長對(duì)蛋白質(zhì)在離子交換色譜介質(zhì)內(nèi)吸附平衡的影響，結(jié)果如圖4所示。可以看出，溶菌酶在SEP-S30中有最小的吸附量，而抗體正好相反。表2中Langmuir吸附等溫線擬合的蛋白質(zhì)飽和吸附容量也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。這一結(jié)果與SEP-S60介質(zhì)中抗體吸附量（78 mg·g-1）形成鮮明的對(duì)照，體現(xiàn)介質(zhì)孔道內(nèi)較大厚度的聚合物層對(duì)抗體強(qiáng)烈的空間排阻作用[23]。隨著MMA濃度的增大，介質(zhì)pore減小及對(duì)應(yīng)的聚合物層厚度增大，與之相伴的是介質(zhì)的抗體吸附量降低[圖4（b）]。表2的結(jié)果顯示抗體飽和吸附容量最終降至77 mg·g-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了抗體在聚合物接枝離子交換色譜介質(zhì)內(nèi)的吸附容量與介質(zhì)pore和聚合物層厚度密切相關(guān)。在IC值穩(wěn)定條件下，單體化合物MMA濃度增大引起SEP-S30/M30、SEP-S30/M60和SEP-S30/M90 3種介質(zhì)內(nèi)溶菌酶的吸附容量由380 mg·g-1逐漸降低至276 mg·g-1（表2）。這一結(jié)果也展現(xiàn)了聚合物層對(duì)溶菌酶排阻作用隨其厚度增大而逐漸顯現(xiàn)。

表2 溶菌酶和抗體在聚合物接枝離子交換色譜介質(zhì)上的吸附等溫線和動(dòng)力學(xué)參數(shù) Table 2 Langmuir parameters and effective diffusivities of lysozyme and antibody adsorption on copolymer-grafted cation-exchangers

①0is the diffusivity of proteins in free solution.

2.4 鹽濃度對(duì)蛋白質(zhì)吸附的影響

進(jìn)一步考察了無機(jī)鹽濃度對(duì)蛋白質(zhì)在SEP-S30/M30上吸附的影響，結(jié)果如圖5所示。隨著無機(jī)鹽濃度的增大，溶菌酶在SEP-S30/M30上的吸附量下降[圖5（a）]。隨著無機(jī)鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)與離子交換配基間的親和力降低，并且聚合物分子鏈塌陷。后者的影響已見諸此前的研究報(bào)道[13-14]。因此，溶菌酶吸附容量隨無機(jī)鹽濃度增大而降低。對(duì)于抗體吸附而言，由此帶來聚合物層厚度的降低，弱化了聚合物層對(duì)抗體的空間排阻作用，有利于改善抗體的吸附，結(jié)果如圖5（b）所示。進(jìn)一步增大無機(jī)鹽濃度，溶菌酶和抗體吸附量均降低。上述結(jié)果表明，無機(jī)鹽對(duì)蛋白質(zhì)在聚合物接枝離子交換色譜介質(zhì)中吸附的調(diào)控作用不僅反映在對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合作用的影響上，也表現(xiàn)在其對(duì)聚合物層的調(diào)控以及由此帶來的對(duì)蛋白質(zhì)吸附的影響上。

2.5 吸附動(dòng)力學(xué)

溶菌酶和抗體在SEP-S30、SEP-S30/M3、SEP-S30/M60和SEP-S30/M902上的吸附動(dòng)力學(xué)結(jié)果如圖6所示。有效孔擴(kuò)散系數(shù)的擬合結(jié)果列于表2。從圖6可以看出，介質(zhì)吸附蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)曲線均緩慢下降，100 min后才趨于穩(wěn)定。由表2中擬合得到的參數(shù)可以看出介質(zhì)孔道內(nèi)聚合物層厚度增加引起介質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)有效擴(kuò)散系數(shù)下降。溶菌酶在共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)內(nèi)的有效擴(kuò)散系數(shù)也明顯小于SP Sepharose FF和由SPM單體合成的離子交換色譜介質(zhì)的有效擴(kuò)散系數(shù)[14]。

2.6 蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)吸附

基于上述結(jié)果進(jìn)一步測量了溶菌酶和抗體在介質(zhì)SEP-S30和SEP-S30/M30上的DBC值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。從圖7（a）可以看出，當(dāng)鹽濃度在0～100 mmol·L-1范圍時(shí)，溶菌酶在兩種介質(zhì)上的DBC值都在135 mg·ml-1左右；當(dāng)鹽濃度增加到200 mmol·L-1時(shí)，溶菌酶在介質(zhì)SEP-S30上的DBC值降到43 mg·ml-1，在介質(zhì)SEP-S30/M30上的DBC值降到88 mg·ml-1，后者為SEP-S30介質(zhì)DBC的2倍并表現(xiàn)出更強(qiáng)的鹽的耐受性。從圖7（b）可以看出，抗體在介質(zhì)SEP-S30上的DBC值隨鹽濃度增加而下降，而抗體在介質(zhì)SEP-S30/M30上的DBC值隨鹽濃度增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并且最大值達(dá)到33 mg·ml-1。從中可以看出，SEP-S30/M3色譜介質(zhì)具有較高的抗體DBC值，展現(xiàn)了較好的應(yīng)用潛力。

3 結(jié) 論

引入新單體化合物MMA，利用ATRP技術(shù)合成了不同離子交換配基密度和共聚物鏈長的無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)，系統(tǒng)地研究了溶菌酶和抗體在離子交換色譜介質(zhì)內(nèi)的吸附行為。在單體化合物總濃度一定的情況下，單體化合物MMA濃度增大導(dǎo)致無規(guī)共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)IC下降及pore增大，后者反映出介質(zhì)孔道內(nèi)共聚物鏈逐漸塌陷的特征。蛋白質(zhì)的吸附表明，溶菌酶的吸附主要取決于介質(zhì)的離子交換配基密度，抗體的吸附則在更大程度上與pore和共聚物層厚度相關(guān)。這主要體現(xiàn)在聚合物層對(duì)抗體的空間排阻作用。蛋白質(zhì)在不同鏈長的共聚物接枝離子交換色譜介質(zhì)中的吸附結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論，而且進(jìn)一步表明優(yōu)化無規(guī)共聚物分子鏈可顯著提高蛋白質(zhì)吸附量。此外，蛋白質(zhì)的吸附和介質(zhì)孔道內(nèi)聚合物層厚度均受無機(jī)鹽濃度調(diào)控。吸附動(dòng)力學(xué)的結(jié)果反映出pore導(dǎo)致介質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)有效擴(kuò)散系數(shù)下降。上述研究結(jié)果對(duì)設(shè)計(jì)和開發(fā)高容量聚合物接枝離子交換色譜介質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義。

符 號(hào) 說 明

c——蛋白質(zhì)溶液濃度，mg·ml-1 c0——蛋白質(zhì)溶液初始濃度，mg·ml-1 De——介質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)有效擴(kuò)散系數(shù) D0——溶液中蛋白質(zhì)擴(kuò)散系數(shù) dp——色譜介質(zhì)粒徑，μm IC——離子交換容量，μmol·g-1 KD——葡聚糖分子分配系數(shù) Kd——解離常數(shù)，mg·ml-1 Mw——蛋白質(zhì)分子量 m——色譜介質(zhì)濕重，g q——蛋白質(zhì)吸附量，mg·g-1 qm——蛋白質(zhì)飽和吸附容量，mg·g-1 q10——蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)結(jié)合容量，mg·ml-1 rglu——葡萄糖分子半徑，nm rpore——介質(zhì)孔道半徑，nm rs——葡聚糖分子半徑，nm VB——色譜柱介質(zhì)填充體積，ml VR——葡聚糖分子在色譜柱內(nèi)保留體積，ml VT——色譜柱總體積，ml V0——色譜柱空隙體積，ml V10——10%穿透條件下色譜進(jìn)樣體積，ml

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Synthesis and characterization of copolymer-grafted cation-exchangers for protein adsorption

ZHANG Suling, YANG Wei, YU Linling, BAI Shu, SUN Yan, SHI Qinghong

(Key Laboratory of System Bioengineering of Ministry of Education, Department of Biochemical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300354, China)

High-capacity chromatographic packings for protein adsorption are the material prerequisite for the development of efficient protein chromatography processes. In this work, random copolymer-grafted cation-exchangers for protein adsorption were synthesized by grafting 3-sulfopropyl methacrylate and methyl methacrylate (MMA) to Sepharose Fast Flowatom transfer radical polymerization, and lysozyme and antibody adsorption on to these cation-exchangers was investigated. In case of a given total concentration of the monomers for the grafting reaction, the pore radii of the copolymer-grafted cation-exchangers increased with an increase of MMA concentration, indicating a typical characteristic of a decreasing depth of polymer layer and gradual collapse of the random copolymers. Adsorption equilibria showed that the adsorption capacity for lysozyme was dominated by ionic capacity of the cation-exchangers whilst for antibody it was related to pore radius and corresponding the change in depth of polymer layer. With an increase in depth of polymer layer, there was stronger steric excluded interaction between antibody and polymer layer, and thus decreasing the adsorption capacity for antibody. Moreover, the results demonstrated that the adsorption capacities for proteins on random copolymer-grafted cation-exchangers were improved by optimizing the conformation of random copolymer chains. The adsorption capacities for antibody and lysozyme reached 237 and 380 mg·g-1 in the optimized random copolymer-grafted cation exchangers, respectively. The research revealed that both layer depth of copolymer and protein binding were also regulated by ionic strength in copolymer-grafted cation-exchangers.

copolymer-grafted cation-exchanger; atom transfer radical polymerization; protein; adsorption; high-capacity; antibody

supported by the National Natural Science Foundation of China (21476166, 21236005) and the Natural Science Foundation of Tianjin (15JCYBJC48500).

date: 2016-03-28.

Prof. SHI Qinghong, qhshi@tju.edu.cn

TQ 936.2

A

0438—1157（2016）09—3738—09

10.11949/j.issn.0438-1157.20160349

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21476166，21236005）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃一般項(xiàng)目（15JCYBJC48500）。

2016-03-28收到初稿，2016-05-09收到修改稿。

聯(lián)系人：史清洪。第一作者：張素玲（1989—），女，碩士研究生。