聚乙二醇/K2HPO4雙水相法提取牦牛血中的IgG

杜雨，張珍，趙文寶，周蕓，賈志春，郭敏超

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.慶陽(yáng)市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 慶陽(yáng)　745000)

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聚乙二醇/K2HPO4雙水相法提取牦牛血中的IgG

杜雨1，張珍1，趙文寶2，周蕓2，賈志春1，郭敏超1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.慶陽(yáng)市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 慶陽(yáng)745000)

【目的】 探討牦牛血中IgG的最佳提取工藝.【方法】 以牦牛血液為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取聚乙二醇濃度、K2HPO4濃度、NaCl濃度和pH為自變量，IgG的含量為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因子三水平的分析法模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型.優(yōu)化聚乙二醇/K2HPO4雙水相法提取牦牛血中IgG的工藝條件.【結(jié)果】 聚乙二醇/K2HPO4雙水相法提取牦牛血中IgG的最佳工藝條件為聚乙二醇 13%(w/w)、K2HPO417%(w/w)、NaCl 11%(w/w)、pH 6.0，在此條件下IgG質(zhì)量濃度達(dá)13.82 mg/mL，與預(yù)測(cè)值14.04 mg/mL的相對(duì)誤差為1.59%.【結(jié)論】 回歸模型具有高度顯著性，方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，可以對(duì)IgG的含量進(jìn)行很好的分析和預(yù)測(cè)；各因子對(duì)IgG含量影響大小依次是PEG濃度>NaCl濃度>K2HPO4濃度>pH；

雙水相法;聚乙二醇/K2HPO4;牦牛血;IgG

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)是一類具有抗體活性并能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白[1-2]，其中IgG在人和動(dòng)物血液中含量最多[3-4].由于其特殊的免疫功能，所以IgG被應(yīng)用于功能性食品、新型飼料、臨床等方面[5-6].我國(guó)是牦牛的主要生產(chǎn)國(guó)，約占世界牦?？倲?shù)的94%，但對(duì)牦牛血液的利用，除有報(bào)道的從牦牛血液中提取凝血酶、SOD和少量食用外，大量血液被丟棄，造成了極大的資源浪費(fèi)，并且對(duì)環(huán)境造成了污染.因此，從牦牛血中提取IgG，既可以充分利用牦牛血資源，又可以減少因污血排放而造成的環(huán)境污染，具有重大社會(huì)意義.

目前，國(guó)內(nèi)從動(dòng)物液中提取IgG的方法主要有飽和硫酸銨法、有機(jī)溶劑法和雙水相法等，雙水相法一般用于提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液或含白蛋白的混合蛋白等中的IgG以及其他蛋白質(zhì)中[7-9]，但未用于動(dòng)物血液中IgG的提取.Sulk等[10]首次使用聚合物/磷酸鹽體系提取純化抗體，使用雙水相萃取分離雜交瘤細(xì)胞的上清液中的IgG，最佳條件是5%PEG以及22%磷酸鹽，IgG收率達(dá)到90%.Platis等[11]使用雙水相法結(jié)合Protein A親和層析的方法，分離轉(zhuǎn)基因煙草的提取物中的單克隆抗體.在12%的PEG以及13%的磷酸鹽條件下，單克隆抗體被分配到下相，其收率大約是95%.Andrews等[12]使用萃取和反萃取兩步法來(lái)純化雜交瘤細(xì)胞的上清液中的IgG，萃取的最佳條件為15%的PEG、14%的磷酸鹽以及12%的NaCl，在兩步萃取之后，IgG的純度可達(dá)到80%.

盡管對(duì)動(dòng)物血液中IgG的提取工藝條件已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)雙水相法提取血液中的IgG的工藝條件尚未有所研究.因此，本研究以聚乙二醇/K2HPO4雙水相法提取IgG，探索牦牛血中IgG的最優(yōu)工藝，以期為牦牛血資源的充分利用，提高牦牛綜合利用價(jià)值提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)原料：新鮮牦牛血取自甘肅夏河，加抗凝劑抗凝后，吸取血清，冷藏備用.

牛IgG對(duì)照品，Beijing Blodee Blotechnology Company；羊抗牛IgG抗體(1:16-32)，Beijing Blodee Blotechnology Company；牛血清白蛋白，上海中秦化學(xué)試劑有限公司.

透析袋，美國(guó)進(jìn)口；檸檬酸鈉、氯化鋇、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、碘化鉀、碘化汞、碳酸氫鈉、三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉、聚乙二醇6 000(PEG)、疊氮鈉.

1.2試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)所用主要儀器為：高速冷凍離心機(jī)(H-1850R)、紫外分光光度計(jì)(UV722S)、分析天枰(FA2004)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S24)、數(shù)字酸度計(jì)(PHS-3C)、XH-B型旋渦混勻器.

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1IgG含量測(cè)定采用紫外分光光度法對(duì)IgG的含量進(jìn)行測(cè)定[13-14].

1.3.2聚乙二醇/K2HPO4雙水相法提取IgG的操作步驟在經(jīng)抗凝后的牦牛血清中，加入1 mol/L的BaCl2，沉淀，離心，去除凝血酶，收集上清液.然后將一定量PEG的母液、K2HPO4的母液、NaCl固體、血清和蒸餾水按比例混合均勻，調(diào)pH后，離心，靜置以達(dá)到相平衡(進(jìn)行萃取)，然后將上相取出；再將一定濃度的K2HPO4溶液加到前面取出的上相中，以形成PEG/K2HPO4雙水相體系(進(jìn)行反萃取)，最后取出其下相，進(jìn)行后續(xù)的透析脫鹽.

1.3.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1PEG濃度對(duì)IgG含量的影響取一定量血清，在14%的K2HPO4，12%的NaCl，pH 7.0和靜置12 h的條件下(此條件是參照Andrews等人使用PEG/磷酸鹽雙水相萃取雜交瘤細(xì)胞的上清液中的IgG的最佳條件來(lái)確定)，PEG濃度設(shè)定為5%、10%、15%、20%、25%(w/w)，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定IgG含量，確定最佳PEG濃度.

1.3.3.2K2HPO4濃度對(duì)IgG含量的影響取一定量血清，在最適PEG濃度，12%NaCl，pH 7.0和靜置12 h的條件下，K2HPO4濃度設(shè)定為6%、10%、14%、18%、22%(w/w)，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定IgG含量，確定最佳K2HPO4濃度.

1.3.3.3NaCl濃度對(duì)IgG含量的影響取一定量血清，在最適PEG、K2HPO4濃度，pH 7.0和靜置12 h的條件下，NaCl濃度設(shè)定為8%、10%、12%、14%、16%(w/w)，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定IgG含量，確定最佳NaCl濃度.

1.3.3.4pH對(duì)IgG含量的影響取一定量血清，在最適PEG、K2HPO4、NaCl的濃度和靜置12 h的條件下，pH設(shè)定為5、6、7、8、9，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定IgG含量，確定最佳pH.

1.3.3.5靜置時(shí)間對(duì)IgG含量的影響取一定量血清，在最適PEG、K2HPO4、NaCl的濃度和pH的條件下，靜置時(shí)間設(shè)定為3、6、9、12、15 h，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定IgG含量，確定最佳靜置時(shí)間.

1.3.4響應(yīng)面設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取其中4個(gè)對(duì)IgG含量影響較大的因素，運(yùn)用Box-Behnken模型設(shè)計(jì)四因素三水平二次回歸方程，擬合自變量與IgG含量之間的函數(shù)關(guān)系.

2　結(jié)果與分析

2.1IgG含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可見(jiàn)，線性回歸方程為y=0.490 3x+0.358 8，R2=0.995 5，表明線性關(guān)系較好.將測(cè)定的吸光值代入上述回歸方程中，計(jì)算出IgG的含量.

圖1　IgG含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of IgG

2.2PEG/K2HPO4雙水相法提取牦牛血中IgG單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1PEG濃度對(duì)IgG含量的影響由圖2可知，IgG含量隨PEG濃度的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，在PEG濃度為15%時(shí)，IgG質(zhì)量濃度達(dá)到最大值9.77 mg/mL，并與其他水平有顯著性差異(P<0.05).PEG濃度10%和20%時(shí)的IgG質(zhì)量濃度較15%分別下降了35.80%和19.60%，因此，選擇15%為最優(yōu)PEG濃度.

2.2.2K2HPO4濃度對(duì)IgG含量的影響由圖3可知，IgG含量隨K2HPO4濃度的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，在K2HPO4濃度為18%時(shí)，IgG質(zhì)量濃度達(dá)到最大值11.57 mg/mL，并與其他水平有顯著性差異(P<0.05).K2HPO4濃度14%和22%時(shí)的IgG含量較18%分別下降了20.32%和33.97%，因此，選擇18%為最優(yōu)K2HPO4濃度.

圖2　PEG濃度對(duì)IgG含量的影響Fig.2　Effect of the concentration of PEG on the IgG content

圖3　K2HPO4濃度對(duì)IgG含量的影響Fig.3　Effect of the concentration of K2HPO4on the IgG content

2.2.3NaCl濃度對(duì)IgG含量的影響由圖4可知，IgG含量隨NaCl濃度的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，在NaCl濃度為12%時(shí)，IgG質(zhì)量濃度達(dá)到最大值11.16 mg/mL，并與其他水平有顯著性差異(P<0.05).NaCl濃度10%和14%時(shí)的IgG含量較12%分別下降了32.91%和8.27%，因此，選擇12%為最優(yōu)NaCl濃度.

2.2.4pH對(duì)IgG含量的影響由圖5可知，IgG含量隨pH的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，在pH為6時(shí)，IgG質(zhì)量濃度達(dá)到最大值13.64 mg/mL，并與其他水平有顯著性差異(P<0.05).pH 5和pH 7時(shí)的IgG含量較6分別下降了14.63%和19.47%，因此，選擇6為最優(yōu)pH.

圖4　NaCl濃度對(duì)IgG含量的影響Fig.4　Effect of the concentration of NaCl on the IgG content

圖5　pH對(duì)IgG含量的影響Fig.5　Effect of pH on the IgG content

2.2.5靜置時(shí)間對(duì)IgG含量的影響由圖6可知，IgG含量隨靜置時(shí)間的增加呈先增大后基本不變的趨勢(shì)，靜置時(shí)間3 h和6 h時(shí)的IgG含量較9 h分別下降了17.20%和12.12%，因此，選擇9 h為最優(yōu)靜置時(shí)間.由于在靜置時(shí)間為9 h的IgG含量(13.22 mg/mL)和12 h和15 h無(wú)顯著性差異，所以在后面的響應(yīng)面試驗(yàn)中不選取靜置時(shí)間.

圖6　靜置時(shí)間對(duì)IgG含量的影響Fig.6　Effect of the silent period on the IgG content

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及模型的建立

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法確定牦牛血IgG最佳提取工藝，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1.利用Design Expert軟件對(duì)表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多元回歸模型：

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2　The result and condition of response surface experiment

從圖7可知四因素之間的交互作用的大小依次為NaCl濃度與PEG濃度的交互作用>pH與PEG濃度的交互作用>pH與NaCl濃度的交互作用>K2HPO4濃度與PEG濃度的交互作用>pH與K2HPO4濃度的交互作用>NaCl濃度與K2HPO4濃度的交互作用.

表3　回歸模型方差分析Tab.3　Variance analysis of regression model

P<0.01表示該指標(biāo)極顯著(**)；0.01

圖7　四因素之間交互作用對(duì)IgG含量的影響Fig.7　Effect of four-factors interaction on the IgG content

x1x3、x1x4、x3x4

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

本研究?jī)?yōu)化得出PEG/K2HPO4雙水相法提取牦牛血中IgG的最佳工藝條件為：在12.86%PEG、17.01%K2HPO4、11.02%NaCl、pH 6.10時(shí)，IgG質(zhì)量濃度的理論值為14.035 9 mg/mL，考慮到實(shí)際操作的可行性，將PEG/K2HPO4雙水相法提取牦牛血中IgG的工藝優(yōu)化為：13%PEG、17%K2HPO4、11%NaCl、pH 6.0.按上述條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定IgG質(zhì)量濃度為13.82 mg/mL，IgG含量與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為1.59%.證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化的PEG/K2HPO4雙水相法提取牦牛血中IgG工藝模型可行.

3　討論

本研究確定PEG濃度為13%，K2HPO4濃度為17%，這2個(gè)數(shù)據(jù)同Platis等研究的結(jié)果基本一致.當(dāng)PEG濃度一定時(shí)，IgG含量隨著K2HPO4濃度的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，這是因?yàn)楫?dāng)K2HPO4濃度的增加時(shí)，K2HPO4固定的水分子也就增多，使富K2HPO4下相的親水性增強(qiáng)，從而疏水性更強(qiáng)的IgG傾向于分配至疏水的富PEG上相，而其他雜蛋白(如白蛋白)則分配在親水性較強(qiáng)的富K2HPO4下相中.但當(dāng)K2HPO4濃度超過(guò)17%后，IgG含量降低，這是因?yàn)镮gG也具有親水性，當(dāng)下相親水性特別強(qiáng)時(shí)，IgG也會(huì)分配到下相，以致其無(wú)法和其他蛋白分離.甚至鹽濃度增大時(shí)，上相會(huì)出現(xiàn)渾濁或沉淀的現(xiàn)象，這就說(shuō)明此時(shí)的鹽析作用比較強(qiáng)，會(huì)使鹽離子和蛋白質(zhì)同時(shí)爭(zhēng)奪水分子，以致蛋白質(zhì)失去水化層從而凝集析出.

NaCl濃度11%(w/w)，該數(shù)據(jù)與Andrews等研究結(jié)果基本一致，IgG含量隨NaCl濃度的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)，這是因?yàn)樘砑覰aCl后，使了兩方面有所改變：雙水相系統(tǒng)的兩相間的疏水性差異增大，上相更加疏水，而下相更加親水，這有利于促進(jìn)不同蛋白質(zhì)在兩相間的差異分配；推動(dòng)蛋白質(zhì)的分子表面的疏水殘基暴露.由于IgG分子的疏水殘基較雜蛋白的要多，更傾向于分配到呈現(xiàn)更強(qiáng)疏水性的上相中.同時(shí)大部分雜蛋白(如白蛋白)依然分配在下相中.從而實(shí)現(xiàn)IgG與雜蛋白(如白蛋白)的分離.此外，添加NaCl會(huì)造成兩相間電勢(shì)的變化，這也是影響IgG在兩相間分配的一個(gè)原因[15].

pH 6.0，該數(shù)據(jù)與Andrews等研究結(jié)果基本一致，pH值是影響蛋白質(zhì)在雙水相系統(tǒng)中分配的另一個(gè)重要因素.由于不同的蛋白質(zhì)的帶電殘基數(shù)目不同，造成pH對(duì)其影響程度有所不同，而且在雙水相系統(tǒng)中，鹽離子的不平均分配可以促成兩相之間的電勢(shì)差.總體而言，pH對(duì)IgG的含量在PEG/K2HPO4系統(tǒng)中的影響沒(méi)有前面3個(gè)因素大.主要原因是，在添加NaCl的情況下，IgG與上相之間的疏水相互作用強(qiáng)于靜電相互作用，大部分IgG分配在上相中[16].

在單因素試驗(yàn)中，IgG含量隨靜置時(shí)間呈先增大后不變的趨勢(shì)，在靜置時(shí)間為9 h的IgG含量(13.22 mg/mL)與12 h和15 h無(wú)顯著性差異，所以靜置太長(zhǎng)時(shí)間對(duì)IgG含量的影響不是很大，而且靜置時(shí)間只是為了達(dá)到兩相平衡，對(duì)IgG分配在上相還是下相中基本沒(méi)有影響，因此在后面的響應(yīng)面試驗(yàn)中沒(méi)有選取靜置時(shí)間.

4　結(jié)論

通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化PEG/K2HPO4雙水相法提取牦牛血中IgG的最優(yōu)工藝參數(shù)為：13%(w/w)PEG、17%(w/w)K2HPO4、11%(w/w)NaCl、pH 6.0.在此條件下IgG質(zhì)量濃度為13.82 mg/mL.與預(yù)測(cè)值14.035 9 mg/mL的相對(duì)誤差為1.59%.

各因素影響IgG提取效果的大小順序?yàn)镻EG濃度>NaCl濃度>K2HPO4濃度>pH.通過(guò)對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和交互作用分析，得知該回歸模型極顯著，對(duì)試驗(yàn)擬合較好.因此，采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到的參數(shù)具有一定的實(shí)用價(jià)值.

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(責(zé)任編輯李辛)

Extraction of IgG from yak blood with PEG/K2HPO4aqueous two-phase system

DU Yu1,ZHANG Zhen1,ZHAO Wen-bao2,ZHOU Yun2,JIA Zhi-chun1,GUO Min-chao1

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.The Food Inspection Centre of Qingyang,Qingyang 745000,China)

【Objective】 To optimize the extraction process for IgG from yak blood.【Method】 Yak blood was used as raw material,the extraction condition was optimized on the basis of single-factor test and the response surface methodology,IgG was extracted from yak blood with PEG/K2HPO4aqueous two-phase system.【Result】 The optimum extraction parameters were as PEG 13% (w/w),K2HPO417% (w/w),NaCl 11% (w/w),pH 6.0.The IgG content reached to 13.82 mg/mL under the conditions above mentioned,and the relative error was 1.59% with the theoretical value at 14.04 mg/mL.【Conclusion】 The model has a significant difference,and the established regression equation for the concentration of IgG has an excellent goodness of fit.The concentration of IgG could be analyzed and predicted by the model.Factors influencing the extraction are in the order as: PEG concentration>NaCl concentration>K2HPO4concentration>pH.

aqueous two-phase system;PEG/K2HPO4;yak blood;IgG

杜雨(1991-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué).E-mail:tsdy1225@163.com

張珍，女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事食品科學(xué)與工程專業(yè)的教學(xué)和科研工作.E-mail：zhangzhen@gsau.edu.cn

甘肅省自然基金(1107RGZA23)：血免疫球蛋白G制備及功能特性研究；甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項(xiàng)(GNSW-2013-22)：牛血液免疫球蛋白酶法制備關(guān)鍵技術(shù)研究.

2015-03-27；

2015-05-06

TS 251.93

A

1003-4315(2016)04-0154-07