蘭州百合枯萎病病原菌的分離鑒定與致病性測(cè)定

邊小榮，師桂英 ，梁巧蘭，孫鴻強(qiáng)，樊生豐，陳君良

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

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蘭州百合枯萎病病原菌的分離鑒定與致病性測(cè)定

邊小榮1，師桂英1，梁巧蘭2，孫鴻強(qiáng)1，樊生豐1，陳君良1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

【目的】 為了明確引起蘭州百合枯萎病的病原菌，對(duì)蘭州百合枯萎病鱗莖及病田土壤進(jìn)行研究.【方法】 采用組織分離及土壤稀釋法進(jìn)行病原菌分離，回接試驗(yàn)測(cè)定致病性，病原菌的培養(yǎng)性狀、分生孢子的大小等形態(tài)特征鑒定菌種.【結(jié)果】 從病株鱗莖上分離得F1、F2、F3、F4共4種鐮刀菌，分離頻率依次為25%、15%、5%、5%，從土壤中分離出1株鐮刀菌F5.經(jīng)過致病性分析，鱗片刺傷后接種，鱗片發(fā)病率達(dá)100%，病情指數(shù)(DI)分別為85.42、80.83、75.83、64.58、82.08；鱗片無刺傷接種，鱗片發(fā)病率分別為85.71%、47.62%、42.86%、19.05%、57.14%，病情指數(shù)分別為(DI)分別為53.57、22.62、21.43、9.52、25.00.鑒定結(jié)果為 F1:尖孢鐮刀菌(Fusarium.oxysporum)、F2：茄病鐮刀菌(Fusarium.solani)、F3：三線鐮刀菌(Fusarium.tricinctum)、F4:煙草鐮刀菌(Fusarium.tabacinum)、F5:禾谷鐮刀菌(Fusarium.graminearum).【結(jié)論】 尖孢鐮刀菌、茄類鐮刀菌和禾谷鐮刀菌的致病能力較強(qiáng)，為蘭州百合枯萎病的主要致病菌.

蘭州百合；枯萎病；鐮刀菌；致病性

蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)是百合科百合屬川百合的一個(gè)變種，狹域分布，僅適合在蘭州周邊海撥1 800～2 500 m的二陰山區(qū)種植，是極具地方特色的甘肅名優(yōu)蔬菜.蘭州百合屬于無性繁殖植物，多年生栽培：從母株上收獲的一級(jí)小種球長(zhǎng)成二級(jí)種球需要2～3 a，二級(jí)種球長(zhǎng)成商品百合需要3～4 a.因此，基于其狹域分布及多年生栽培的特點(diǎn)，連作障礙十分嚴(yán)重[1].造成連作障礙的原因很多，其中土傳病害與土壤養(yǎng)分失調(diào)、植物自身的自毒作用一并被列為三大主要成因[2].蘭州百合枯萎病是一種由土傳真菌引起的病害，在百合主產(chǎn)區(qū)2～4 a百合栽培田普遍發(fā)生給生產(chǎn)造成損失.

開展枯萎病病原學(xué)研究是進(jìn)行病原性連作障礙研究的基礎(chǔ).該方面研究在觀賞百合有諸多文獻(xiàn)報(bào)道，梁巧蘭等[3]和楊秀梅等[4]認(rèn)為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum),茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)是引起觀賞百合枯萎病的主要病原菌.Li等[5]首次從觀賞百合品種(Sorbonne)枯死植株分離出三線鐮孢菌(Fusarium.tricinctum).楊秀梅等[6]對(duì)觀賞百合枯萎病病原鑒定與ITS序列分析，并采用鱗片接種法對(duì)36個(gè)百合品種及5個(gè)野生種進(jìn)行枯萎病接種鑒定.

鐮刀菌種類很多，其種類分布表現(xiàn)出很強(qiáng)的地域性[7-10].李誠(chéng)等[11]從甘肅隴東平?jīng)龅貐^(qū)采集研究蘭州百合枯萎病病株進(jìn)行病原學(xué)研究，認(rèn)為“百合枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌百合專化型(Fusariumoxysporum.f sp.lilii),另外還有茄腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani(Mart) Sacc)和串珠鐮刀菌(Fusariummo-niliformSheldon)，但對(duì)病原菌的生物學(xué)特性、致病性等諸多基礎(chǔ)性問題沒提及”.甘肅省臨洮縣東北部山二陰山區(qū)是蘭州百合的宜栽地區(qū)[12].2013年6、7月恰遇連續(xù)陰雨天氣，該區(qū)域上營(yíng)鄉(xiāng)2～4 a生百合枯萎發(fā)病率達(dá)到30%以上，給生產(chǎn)造成很大損失.目前對(duì)甘肅省臨洮縣上營(yíng)鄉(xiāng)蘭州百合枯萎病未見報(bào)道.鑒于此，本試驗(yàn)對(duì)從臨洮縣上營(yíng)鄉(xiāng)采集蘭州百合枯萎病植株及土壤進(jìn)行了病原物的分離鑒定及致病性測(cè)定，以期明確其病原學(xué)特點(diǎn)，為開展蘭州百合病原性連作障礙研究提供技術(shù)支撐.

1　材料與方法

1.1病株采集及病原菌的分離

試驗(yàn)分別于2015年5月2日和2015年6月21日，在甘肅省定西市臨洮縣上營(yíng)鄉(xiāng)包家山村和趙家臺(tái)村的蘭州百合田塊(E 103°28′36″，N 35°17′54″，海拔2 250 m,年平均降雨量為461.8 mm，平均氣溫3.2 ℃，平均無霜期89 d)采集12株病株及土樣，用于病原菌的分離.

將帶病植株的根、莖、鱗莖的病健交界處病組織剪成約0.3 cm×0.5 cm的小塊，75%的乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗4～5次，0.1%的升汞溶液消毒30 s～1 min,無菌水沖洗4～5次，用滅菌濾紙吸干病組織表面水分，五點(diǎn)法置于PDA(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L)平板上.土樣處理方法是[14]：稱取土樣 5.0 g 放入盛45 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，置搖床振蕩15 min使土樣均勻分散形成土壤懸液，然后按照10倍梯度稀釋法進(jìn)行稀釋，吸取100 μL最終稀釋液于PDA培養(yǎng)基中涂布均勻，25 ℃恒溫箱培養(yǎng).長(zhǎng)出的真菌及時(shí)轉(zhuǎn)出，根據(jù)菌落顏色和形態(tài)進(jìn)行分類編號(hào)，并挑取菌絲于新PDA平板上純化2～3次.純化后于PDA斜面帶菌落長(zhǎng)滿斜面4 ℃保存.

1.2病原菌致病性測(cè)定

病原菌致病性測(cè)定采用鱗片接種法進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)計(jì)為5因子(純化分離得到的5種鐮刀菌F1、F2、F3、F4、F5)2水平(刺傷、無刺傷)完全隨機(jī)試驗(yàn)，共10個(gè)處理.每個(gè)處理21個(gè)鱗片，分7培養(yǎng)皿，每個(gè)鱗片接菌餅3塊.

鱗片接種方法參考梁巧蘭等[3-4]的方法進(jìn)行.具體是：將供試菌種在PDA平板上培養(yǎng)后，制成直徑5 mm的菌片備用.采用健康鱗片,以75%酒精表面消毒,無菌水沖洗，采用傷口接種和無傷接種兩種方法進(jìn)行致病性測(cè)定.傷口接種法：用滅菌解剖針在鱗片上刺孔,將帶培養(yǎng)基的菌片貼在孔上.以刺孔但不貼菌片的鱗片為對(duì)照.無傷接種法：直接將菌片貼在鱗片上.以不接菌片鱗片為對(duì)照.

接種10 d后記錄發(fā)病癥狀，測(cè)量病斑直徑(d)，計(jì)算病斑占鱗片面積比例.據(jù)此將鱗片發(fā)病級(jí)數(shù)劃分為5級(jí)，分別是：0級(jí)，鱗片健康無病斑現(xiàn)象;1級(jí)，病斑的大小為07.67 mm：占百合鱗片面積>25%，病斑且腐爛.計(jì)算病情指數(shù)，每處理隨機(jī)取7個(gè)鱗片，3

次重復(fù).

病情指數(shù)(DI)=100×[Σ(鱗片發(fā)病級(jí)數(shù)×對(duì)應(yīng)株數(shù))/(鱗片發(fā)病的最高級(jí)數(shù)×總株數(shù))]

1.3病原菌的鑒定

將分離得到的菌株接種在PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)3 d后用游標(biāo)卡尺(十字交叉法，取平均值)測(cè)量菌落于PDA平板的直徑(生長(zhǎng)速率)，生長(zhǎng)6 d后觀察菌落形態(tài)，在XSP-2C顯微鏡下觀察菌絲及分生孢子的形態(tài)和生長(zhǎng)情況.根據(jù)菌落直徑、大型分生孢子的形態(tài)及產(chǎn)生方式、小型分生孢子的有無及產(chǎn)生方式、厚垣孢子的有無及產(chǎn)生方式等為主要形態(tài)特征，主要依據(jù)《鐮刀菌屬》[15]、《真菌鑒定手冊(cè)》[16]、《尖孢鐮刀菌生物學(xué)及其生物防治》[17]等工具書，利用其檢索表進(jìn)行鑒定.

A：田間發(fā)病癥狀；B、C：地上部莖葉受害癥狀；D：地下鱗莖發(fā)病癥狀；E、F、G：植株不同發(fā)病程度. 圖1　蘭州百合枯萎病癥狀Fig.1　Symptoms of Lanzhou Lily wilt

2　結(jié)果與分析

2.1蘭州百合枯萎病的癥狀

枯萎病也稱為根腐病、莖腐病，是一種鐮刀菌引起的病害.鐮刀菌從百合肉質(zhì)根或鱗莖盤基部傷口侵入，造成肉質(zhì)根和基盤變褐腐爛，并逐漸向上發(fā)展，鱗片出現(xiàn)褐色凹陷病斑，變成黃褐色逐漸腐爛，導(dǎo)致鱗片從基盤散開而剝落.由病鱗莖長(zhǎng)出的植株明顯矮化，植株生長(zhǎng)緩慢，植株不能向上運(yùn)輸養(yǎng)分，受害葉片呈牛皮紙樣，葉片發(fā)黃、萎焉自下而上逐漸枯萎，后枯萎而死(圖1).

該病害在臨洮縣東北部山二陰山區(qū)4月中旬左右開始發(fā)病，低溫高濕的條件下病斑擴(kuò)展迅速，5月上旬發(fā)病數(shù)量急劇上升，5月中旬達(dá)到高峰期，5月下旬植株大量死亡和枯萎；6～7月持續(xù)發(fā)生，6月雨水多時(shí)發(fā)病數(shù)量急劇上升，造成根部腐爛，地上部黃化、枯萎死亡.

2.2病原菌的分離

從12株枯萎病病株中分離得到4種病原菌.土壤中只分離到了一株病原菌F5，其他病原菌未分離成功.病株中真菌分離情況見表1.

表1　蘭州百合枯萎病病原菌的分離Tab.1　The isolations of Lanzhou lily wilt disease pathogen

2.3病原菌的致病性測(cè)定

5種病原菌接種到鱗片上發(fā)病癥狀相似.在刺傷接種情況下，百合鱗片發(fā)病率均為100%，病情指數(shù)(DI)依次為85.42、80.83、75.83、64.58、82.08；無刺傷時(shí)，5種菌的發(fā)病程度不同，發(fā)病率依次為85.71%、47.62%、42.86%、19.05%、57.14%.通過病情指數(shù)計(jì)算，5種病原菌的致病性強(qiáng)弱依次為F1>F5>F2>F3>F4(圖2-3).

2.4病原菌的鑒定

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行檢索，5種鐮刀菌分別為F1:尖孢鐮刀菌(Fusarium.oxysporum)、F2：茄病鐮刀菌(Fusarium.solani)、F3：三線鐮刀菌(Fusarium.tricinctum)、F4：煙草鐮刀菌(Fusarium.tabacinum)、F5：禾谷鐮刀菌(Fusarium.graminearum).(表1，圖1).5種鐮刀菌中，尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和煙草鐮刀菌在12 h的光暗交替下可以產(chǎn)生大量的孢子.三線鐮刀菌在石竹葉片的誘導(dǎo)下能夠產(chǎn)孢，但產(chǎn)孢量極少.禾谷鐮刀菌長(zhǎng)時(shí)間放置(約25 d)時(shí)產(chǎn)生了大量的孢子.

A：未刺傷；未接菌；B：未刺傷，接菌發(fā)病初期；C：未刺傷，接菌發(fā)病后期；D：刺傷，未接菌；E：刺傷，接菌發(fā)病初期；F：刺傷，接菌發(fā)病后. 圖2　蘭州百合枯萎病病原菌接種后的鱗片癥狀Fig.2　Symptom of bulbs after vaccination Lanzhou Lily wilt disease pathogen

A：未刺傷；未接菌；B：未刺傷，接菌發(fā)病初期；C：未刺傷，接菌發(fā)病后期；D：刺傷，未接菌；E：刺傷，接菌發(fā)病初期；F：刺傷，接菌發(fā)病后. 圖3　蘭州百合枯萎病5種病原菌刺傷接種和無刺傷接種后的鱗片病情指數(shù)Fig.3　Disease index of bulbs after stabbing and no stabbing vaccination 5 kinds of pathogen of Lanzhou Lily wilt

3　討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從蘭州百合枯萎病病株及病田土壤中分離得到了5種病原菌，5種鐮刀菌均可導(dǎo)致鱗片發(fā)病，致病性強(qiáng)弱依次為F1>F5>F2>F3>F4.李誠(chéng)等[11]從蘭州百合病株上分離得到尖孢鐮刀菌百合專化型(Fusariumoxysporum.fsp.lilii)，茄腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani(Mart)Sacc)和串珠鐮刀菌(Fusariummo-niliforSheldon)等3種鐮刀菌[11]，但對(duì)分離物并未做致病性測(cè)定.馮昱人等[18]報(bào)道了百合枯萎病病原菌的分離鑒定及致病性測(cè)定，認(rèn)為蘭州百合枯萎病是由尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)等3種鐮刀菌引起，但在文章表述卻以觀賞百合作為研究對(duì)象，文中還有多處語焉不詳，因此研究結(jié)果不與其比較.

表2　5種蘭州百合枯萎病致病菌的形態(tài)學(xué)特征描述Tab.2　The description of morphology features of five kinds of Lanzhou Lily wilt disease pathogen

A、B、C、D、E分別代表尖孢鐮刀菌(Fusarium.oxysporum)、茄病鐮刀菌(Fusarium.solani)、三線鐮刀菌(Fusarium.tricinctum)、煙草鐮刀菌(Fusarium.tabacinum)、禾谷鐮刀菌(Fusarium.graminearum)；1、2分別代表5種菌菌落的正面與背面，3和4分別代表40×10倍鏡下5種菌的顯微形態(tài)；Ⅰ：大型分生孢子，Ⅱ：小型分生孢子，Ⅲ：厚垣孢子，B4、D4、A4：厚垣孢子的著生方式，Ⅳ：產(chǎn)孢細(xì)胞. 圖4　5種蘭州百合枯萎病致病菌菌落形態(tài)和顯微形態(tài)特征Fig.4　Colony shape and micromorphology features of 5 kinds of Lanzhou Lily wilt

本研究分離鑒定獲得了5種鐮刀菌.其中F.oxysporum在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落顏色與黎永堅(jiān)等[19]、郭立佳等[20]、陳霞[21]所描述的菌落顏色一致，分生孢子的大小形態(tài)與李誠(chéng)等[11]、馮昱人等[18]、楊秀梅等[6]、顧龍?jiān)芠22]、白麗艷等[23]、魏志剛[24]、劉小娟[25]、梁巧蘭等[3]的研究一致，則F1可以確定為F.oxysporum，而F.solani的菌落顏色描述有差異，這可能是由于地域環(huán)境的差異所導(dǎo)致的.F3在PDA、PSA培養(yǎng)基上的菌落顏色及PSA大、小型分生孢子的形態(tài)、大小、隔膜數(shù)與馮昱人分離出來的Fusarium.tricinctum的描述十分接近，F(xiàn)usarium.solani的分生孢子的形態(tài)特征與梁巧蘭等[3]的研究基本一致.Fusarium.graminearum的菌落顏色及分生孢子的特征與白麗艷等[23]的研究結(jié)果很接近，煙草鐮刀菌僅根據(jù)《鐮刀菌屬》和《真菌鑒定手冊(cè)》鑒定，未能找到其他文獻(xiàn)支持，只能為初步確定.

蘭州百合枯萎病可引起植物的根腐、莖腐、莖基腐、葉腐等病害.本研究?jī)H從鱗片及土壤中獲得了病原菌并進(jìn)行了致病性測(cè)定，對(duì)病株根、地上莖及葉片發(fā)病組織部位未能獲得病原菌，該方面的工作尚需深入進(jìn)行.

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(責(zé)任編輯趙曉倩)

Isolation and identification of wilt disease pathogen from Lanzhou lily and its pathogenicity

BIAN Xiao-rong1,SHI Gui-ying1,LIANG Qiao-lan2,SUN Hong-qiang1,FAN Sheng-feng1,CHEN Jun-liang1

(1.College of Hoticulture,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070，China；2.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070，China)

【Objective】 To determine the pathogens which causing wilt disease of Lanzhou lily from of Lintao County,Gansu Province,and to evaluate the bulb and pathogenic soil of this area.【Method】 Isolation and identification of pathogen by the method of tissue separation and soil dilution,and the tieback test to determine pathogenic.【Result】 A total of 5 Fusarium isolates that 4 species (F1,F2,F3,F4) were isolated from Lanzhou Lily bulbs，isolated frequency were 25%,15%,5% and 5%.One (F5) from soil were identified based on methods of isolation,purification,morphological characters and pathogenicity.The disease incidences reached 100% and the disease indexes of five pathogens were 85.42,80.83,75.83,64.58,82.08 by bulbs wound inoculation,respectively.The disease incidences of the bulbs were 85.71%,47.62%,42.86%,19.05%,57.14% and the disease indexes of five pathogens were 53.57,22.62,21.43,9.52,25.00 by no-wound inoculation,respectively.Morphological characters showed that strains F1,F2,F3,F4,F5were respectively identified asF.oxysporum,F.solani,F.tricinctum,F.tabacinumandF.graminearum.【Conclusion】F.oxysporum,F.graminearumandF.solanihad higher pathogenicity than others,these are major pathogens of Lanzhou lily wilt disease.

Lanzhou lily；wilt；Fusarium；pathogenicity

邊小榮(1987-)，女，碩士研究生,主要從事蔬菜生理及栽培技術(shù)研究.E-mail:1282608450@qq.com

師桂英，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)槭卟嗽耘嗯c生物技術(shù).E-mail:shigy@gsau.edu.cn

甘肅省農(nóng)牧廳農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(GNCX-2013-36)；甘肅省高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目.

2015-12-09；

2016-03-22

S 644.1

A

1003-4315(2016)04-0058-07