紫外誘變及微波輻射對Alternariamali強(qiáng)毒菌株致病力的影響

侯寶宏，竇劍斌，王衛(wèi)雄，徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

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紫外誘變及微波輻射對Alternariamali強(qiáng)毒菌株致病力的影響

侯寶宏，竇劍斌，王衛(wèi)雄，徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

【目的】 減弱蘋果斑點(diǎn)落葉病菌AlternariamaliRoberts強(qiáng)毒菌株致病力，以期為有效防治該病害的發(fā)生提供理論依據(jù).【方法】 采用紫外及微波輻射兩種方法對AlternariamaliRoberts進(jìn)行誘變，研究其致病力的變化.【結(jié)果】 紫外輻射劑量、輻射距離和時長分別為10 W、10 cm、5 min時，可引起A.mali強(qiáng)毒菌株的負(fù)突變，致病力減小，6 h后孢子萌發(fā)率為58.45 %，4 d后生物學(xué)活性顯著低于原始菌株(P<0.05)，其中產(chǎn)孢量為2×104個/mL，菌絲生長量為152.67 mg，菌落直徑為3.67 cm，7 d后發(fā)病率38.50%，病情指數(shù)為10.32；微波輻射60 s，A.mali強(qiáng)毒菌株達(dá)到最低生物學(xué)活性(P<0.05)，6 h后孢子萌發(fā)率僅為1.83%，4 d后產(chǎn)孢量為4×104個/mL，菌絲生長量為139.30 mg，菌落直徑為3.83 cm，7 d后發(fā)病率為31.94%，病情指數(shù)僅為7.87.【結(jié)論】 紫外輻射可使Alternariamali強(qiáng)毒菌株發(fā)生負(fù)突變，微波輻射可使Alternariamali強(qiáng)毒菌株致病力減弱.

AlternariamaliRoberts；紫外誘變；微波輻射

由蘋果斑點(diǎn)落葉病菌(AlternariamaliRoberts)強(qiáng)毒菌株引起的蘋果斑點(diǎn)落葉病是蘋果主要病害之一，該病在日本、美國、朝鮮以及伊朗等世界各蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，在我國黃河故道和渤海灣兩大蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為嚴(yán)重[1].A.mali強(qiáng)毒菌株有強(qiáng)致病力，被侵染蘋果葉片可形成10～20個病斑于葉片表面，之后病斑處穿孔或破碎，葉片生長受阻減緩，干枯早落，造成樹勢減弱、產(chǎn)量降低.因此，防治A.mali強(qiáng)毒菌株引起的蘋果樹斑點(diǎn)落葉病已成為蘋果病害的研究熱點(diǎn)[2-6].邵旭平等[7]從甘肅省蘋果斑點(diǎn)落葉病葉上分離得到致病菌株A.mal強(qiáng)毒菌株和弱毒菌株，并且發(fā)現(xiàn)兩菌株之間存在交叉保護(hù).目前生產(chǎn)上主要采用化學(xué)方法防治該病害，這不僅帶來農(nóng)藥殘留問題，還會使A.mali產(chǎn)生耐藥性[8].所以尋求一種能從根本上減輕該病害發(fā)生的方法，一直是廣大學(xué)者努力的方向.近年來，紫外誘變和微波輻射等方法被應(yīng)用于植物病害的防治和微生物育種中，此類方法可引起病菌的基因發(fā)生突變，使病菌某些機(jī)構(gòu)和功能受到損傷，最終導(dǎo)致病原菌的致病力發(fā)生改變.王洲等[9]對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BS059菌株進(jìn)行紫外誘變處理，隨誘變時長的不同，BS059發(fā)生了正突變或負(fù)突變.50 s時發(fā)生正突變后篩選獲得高產(chǎn)α-乙酰乳酸脫羧酶菌株，但誘變時長75 s時產(chǎn)生負(fù)突變.劉暢等[10]用紫外線誘變黑曲霉3.2130，篩選獲得酸性蛋白酶缺陷的菌株L4.涂璇等[11]采用微波輻射進(jìn)行了鏈霉菌702抗藥性致死突變的篩選，因此，本試驗(yàn)選用紫外及微波輻射的誘變方法對蘋果斑點(diǎn)落葉病菌A.mali強(qiáng)毒菌株進(jìn)行處理，旨在篩選負(fù)突變菌株，并確定能夠降低A.mali強(qiáng)毒菌株致病力的誘變方法及其最佳誘變條件，為蘋果樹早期落葉病高效低毒防治途徑提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株AlternariamaliRoberts強(qiáng)毒菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2供試培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：葡萄糖18 g，瓊脂12 g，馬鈴薯200 g，水1 000 mL.

PSK液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，加水定容到1 L.

1.1.3主要儀器15 W紫外燈、700 W格蘭仕T770D20T-TD (W0)型微波爐、磁力攪拌器、孢子振蕩器、生化培養(yǎng)箱等.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1A.mali強(qiáng)毒菌株孢子懸浮液的制備將A.mali強(qiáng)毒菌株病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)4～7 d，用無菌水洗脫P(yáng)DA平板上的孢子，在顯微鏡下利用血球計數(shù)板將其配制成105個/mL的孢子懸液，4 ℃保存，備用.

1.2.2紫外誘變處理對A.mali強(qiáng)毒菌株的影響將1.2.1中制備的A.mali強(qiáng)毒菌株孢子懸浮液用移液槍吸取200 μL，均勻涂于PDA平板上，置于10 W紫外燈(波長253.7 nm)下 10 cm處分別照射0.5、1、3、5、7、9 min(照射前 30 min打開紫外燈，使光線穩(wěn)定后開始照射)，照射結(jié)束后立即置于加有冰塊的自來水中終止反應(yīng)，然后置于28 ℃暗培養(yǎng).60 h后，待PDA平板上長出可見的菌落，將其轉(zhuǎn)接至新的PDA平板，25 ℃黑暗培養(yǎng).

1.2.3微波輻射處理對A.mali強(qiáng)毒菌株的影響吸取1.2.1已制備孢子懸浮液1 mL于滅菌的1.5 mL離心管中并搖勻，在700 W格蘭仕T770 D20T-TD (W0)型微波爐中分別輻射處理10、20、30、40、50、60 s.輻射處理后分別吸孢子懸浮液200 μL分別涂于PDA平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng).待60 h后PDA平板上出現(xiàn)可見菌落，將其轉(zhuǎn)接至新的PDA平板，28 ℃黑暗培養(yǎng).

1.2.4誘變菌株與原始菌株培養(yǎng)性狀觀察將誘變處理后的菌株和原始菌株的孢子懸浮液分別涂到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng).7 d后分別觀察各菌株培養(yǎng)特征和顏色變化，主要包括氣生菌絲和基內(nèi)菌絲顏色及可溶性色素及變化等.

1.2.5誘變菌株產(chǎn)孢量的測定吸取一定濃度的誘變菌株孢子懸浮液(105個/mL)，于 30 mL的 PSK液體培養(yǎng)基中接種后28 ℃振蕩培養(yǎng).4 d后顯微計數(shù)孢子懸浮液濃度，并計算誘變后菌株產(chǎn)孢量.對照為原始菌株，各處理3次重復(fù).

1.2.6誘變菌株菌絲生長量測定將誘變菌株的孢子懸浮液(105個/mL)，接種于 30 mL的 PSK液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d.用滅菌干燥的濾紙過濾后在80 ℃恒溫下烘干至恒質(zhì)量，稱菌絲質(zhì)量并計算干質(zhì)量.對照為原始菌株，各處理3次重復(fù).

1.2.7菌落生長速率的測定在PDA培養(yǎng)基上活化誘變菌株后打菌餅(直徑為6 mm)，并重新接種于PDA平板上(培養(yǎng)皿直徑9 cm)于25 ℃黑暗培養(yǎng)，4 d后測量菌落直徑并觀察菌落形態(tài).以原始菌株作為對照，每個處理重復(fù)5次.

1.2.8孢子萌發(fā)率的測定孢子萌發(fā)試驗(yàn)參照方中達(dá)方法進(jìn)行[12].將誘變菌株孢子稀釋成105個/mL，取50 μL涂布于1.5%水瓊脂平板，25 ℃黑暗培養(yǎng)6 h，于顯微鏡下統(tǒng)計孢子萌發(fā)率.以原始菌株作為對照，每個處理重復(fù)5次.

1.2.9誘變菌株離體致病力測定在低倍鏡(10×10)下將誘變菌株制成濃度為每視野10～20個孢子的懸浮液，選取大小及長勢相似的新鮮蘋果葉片噴霧回接，置于28 ℃，相對濕度為80%條件下觀察其發(fā)病情況，7 d后測定發(fā)病率和病情指數(shù)，再次測定病原菌的致病力.設(shè)對照為原始菌株，各處理3次重復(fù).

1.2.10誘變菌株穩(wěn)定性測定將誘變菌株在28 ℃條件下繼代培養(yǎng)8代，每 7 d轉(zhuǎn)接1次.觀察各代的菌落形態(tài).每個處理重復(fù)3次.測定第8代菌

株的產(chǎn)孢量及致病性.以原始菌株作為對照.每個處理重復(fù)5次.

2　結(jié)果與分析

2.1A.mali強(qiáng)毒菌株的紫外誘變處理

2.1.1紫外誘變后各誘變菌株與出發(fā)菌株培養(yǎng)性狀的差異A.mali強(qiáng)毒菌株經(jīng)紫外照射0.5～1 min后，其菌落形態(tài)與原始菌株形態(tài)無明顯差異，菌落氣生菌絲茂密，菌落中央墨綠色，具明顯的輪紋；而A.mali強(qiáng)毒菌株經(jīng)紫外照射5～7 min后，菌落中央氣生菌絲減少，且菌落顏色變淺，由原始菌的墨綠色變?yōu)檎T變后的深褐色至褐色(表1).

2.1.2紫外誘變后各誘變菌株的生物學(xué)活性A.mali.強(qiáng)毒菌株經(jīng)不同時間紫外誘變后，其生物學(xué)活性與原始菌株相比有較大差異(表2).紫外照射0.5、1、3 min后，誘變菌株的發(fā)病率和病情指數(shù)均高于原始菌，表明發(fā)生了正突變，其致病力增強(qiáng)，而其他各處理致病力減弱，表明發(fā)生了負(fù)突變.其中紫外處理5 min時，誘變菌株的致病力明顯減弱，6 h后的孢子萌發(fā)率僅為58.45%.4 d后測定產(chǎn)孢量為2×104個/mL、菌絲生長量為152.67 mg、菌落直徑僅有3.67 cm，7 d后發(fā)病率及病情指數(shù)依次為38.50%和10.32，均與對照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；而紫外處理0.5 min時，誘變菌株的致病力最強(qiáng)，6 h后的孢子萌發(fā)率為93.61%，4 d后產(chǎn)孢量、菌絲生長量、菌落直徑分別為6×104個/mL、170.33 mg和4.43 cm，7 d后發(fā)病率和病情指數(shù)分別為76.05%和23.47%.因此，用10 W紫外燈(紫外波長253.7 nm)于 10 cm處對A.mali強(qiáng)毒菌株照射5 min，可明顯降低該菌的致病力.

A：原始菌(CK)；B：紫外誘變0.5 min；C:紫外誘變5 min. 圖1　紫外誘變后各誘變菌株與出發(fā)菌株菌落形態(tài)Fig.1　Colony morphology of the control strain and induced strain after UV mutagenesis表1　紫外誘變后各誘變菌株與原始菌株菌落形態(tài)Tab.1　Colony morphology of the control strain and induced strain after UV mutagenesis

處理時間/min7d菌落形態(tài)0.5菌落平坦,中央具有氣生菌絲較茂密,正面黑色,有明顯輪紋1菌落較平坦,表面具有少量白色氣生菌絲,有輪紋感,灰黑色3菌落較平坦,生菌絲較少,菌落黑綠色5菌落完整,無氣生菌絲,菌落深褐色至褐色,外緣白色7菌落平坦,中央具有少量灰色氣生菌絲,菌落深褐色9菌落平坦,氣生菌絲較少,菌落灰色至黑色CK菌落平展,中央具較密集氣生菌絲,墨綠色菌落,有明顯輪紋

表2　紫外誘變后各誘變菌株的生物學(xué)活性Tab.2　The biological activities of mutation strains after uv mutagenesis

所有顯著性差異比較均在0.05的水平上，相同字母間差異不顯著，不同字母間差異顯著.

2.2A.mali強(qiáng)毒菌株的微波輻射處理

2.2.1微波輻射后各誘變菌株與原始菌株培養(yǎng)性狀的差異A.mali強(qiáng)毒菌株經(jīng)微波輻射，菌落形態(tài)與未照射菌株形態(tài)無明顯差異，菌落全緣，平坦，中央具有少量白色氣生菌絲，菌落墨綠色，有明顯的輪紋，正面最邊緣為白色，背面為褐色.經(jīng)微波輻射50～60 s后，菌落較不完整，中央產(chǎn)生少量氣生菌絲，顏色變?yōu)榛野咨咙S褐色(表3).

2.2.2微波輻射后各誘變菌株的生物學(xué)活性由表4可以看出，A.mali.強(qiáng)毒菌株經(jīng)不同時間的微波輻射后，各處理與未處理菌株生物學(xué)活性存在較大差異.微波輻射20 s時，誘變菌株的生物學(xué)活性最高，致病力最強(qiáng)，6 h的孢子萌發(fā)率為75.80%，4 d后產(chǎn)孢量、菌絲生長量、菌落直徑分別為11×104個/mL、155.00 mg和4.38 cm，7 d后發(fā)病率和病情指數(shù)分別為61.19%和14.75，產(chǎn)生了正突變；微波輻射誘變時長為60s時，篩選獲得生物學(xué)活性最低和致病力最小的誘變菌株.6 h后測定孢子萌發(fā)率為1.83%，4 d后測定產(chǎn)孢量為4×104個/mL，菌絲生長量及菌落直徑依次為139.30 mg和3.83 cm，7 d后發(fā)病率和病情指數(shù)分別為31.94%和7.87，與原始菌株相比差異顯著(P<0.05).因此，A.mali.強(qiáng)毒菌株經(jīng)微波輻射60 s后，可以使菌株發(fā)生負(fù)突變，使其致病力明顯減弱.

表3　微波輻射后各誘變菌株與原始菌株菌落形態(tài)Tab.3　Colony morphology of the control strain and induced strain after microwave radiation

A：原始菌(CK)；B：微波輻射20 s；C:微波輻射60 s. 圖2　微波輻射后各誘變菌株與出發(fā)菌株菌落形態(tài)Fig.2　The biological activities of mutation strains after microwave radiation表4　微波輻射后各誘變菌株的生物學(xué)活性Tab.4　The biological activities of mutation strains after microwave radiation

處理時間/min6h孢子萌發(fā)率/%4d產(chǎn)孢量/(個·mL-1)菌絲生長量/mg菌落直徑/cm7d發(fā)病率/%病情指數(shù)1084.93±0.79b6×104±0.54c126.0±2.44e4.3±0.04ab53.33±1.40bc13.58±0.26ab2075.8±0.92c11×104±0.73a155.0±2.69b4.38±0.03ab61.19±1.20a14.75±0.30a3057.08±0.6d9×104±0.84b151.3±3.07b4.03±0.08bc56.66±0.99b13.33±0.33abc407.31±0.09e11×104±0.89a123.0±2.99e4.23±0.01ab46.48±0.89d11.74±0.45cd507.31±0.08e5×104±0.49cd133.3±0.34d4.07±0.03bc46.42±0.89d10.38±0.20d601.83±0.05e4×104±0.55d139.3±0.40c3.83±0.07c31.94±0.70e7.87±0.13eCK93.61±0.95a4×104±0.60d614.0±0.49a4.55±0.04a51.19±0.10c12.56±0.25bc

2.3紫外和微波輻射對A.mali強(qiáng)毒菌株誘變效果的比較

通過對兩種方法誘變菌株的形態(tài)特征和生物學(xué)活性進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫外和微波輻射均可以誘變A.mali強(qiáng)毒菌株，且正突變和負(fù)突變都存在(表2，表4).此外，對孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢量和菌絲生長等生物學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，微波輻射后A.mali強(qiáng)毒菌株更易發(fā)生誘變，說明A.mali強(qiáng)毒菌株對微波輻射敏感度更高.通過誘變菌株致病性測定，表明紫外誘變5 min后A.mali強(qiáng)毒菌株發(fā)病率和病情指數(shù)分別低至38.50%和10.32.微波輻射誘變60 s后發(fā)病率及病情指數(shù)分別低至31.94%和7.87.

2.4誘變菌株的穩(wěn)定性

誘變菌株的形態(tài)學(xué)特征和生物學(xué)活性的穩(wěn)定性測定結(jié)果表明，誘變后的各菌株在28 ℃進(jìn)行繼代培養(yǎng)8代后，其培養(yǎng)性狀和初次培養(yǎng)性狀基本一致，其致病力大小也未發(fā)生較大改變，說明A.mali強(qiáng)毒菌株經(jīng)紫外誘變和微波輻射處理后，各誘變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性.

3　討論與結(jié)論

A.mali強(qiáng)毒菌株經(jīng)紫外誘變和微波輻射后，在培養(yǎng)性狀和生物學(xué)活性上發(fā)生了一些改變.A.mali.強(qiáng)毒菌株分別經(jīng)紫外照射5～7 min和微波輻射50～60 s后發(fā)生負(fù)突變，在PDA平板上菌落變得較不完整，中央氣生菌絲減少，顏色變?yōu)榛野咨咙S褐色，且無輪紋產(chǎn)生.其中分別經(jīng)紫外處理5 min和微波輻射60 s時，誘變菌株生物學(xué)活性最低，致病力顯著低于原始菌株(P<0.05).將發(fā)生突變的菌株進(jìn)行繼代培養(yǎng)8代后，培養(yǎng)性狀和生物學(xué)活性未發(fā)生較大改變.因此，紫外輻射劑量、照射距離、時長分別為10 cm、10 W、5 min和微波輻射為60 s是兩種誘變A.mali強(qiáng)毒菌株減弱其致病力方法中的最佳條件.

紫外誘變和微波輻射可以使病原菌堿基的正常配對受到影響，某些基因發(fā)生突變，最終導(dǎo)致病原菌的致病力發(fā)生改變.紫外誘變主要是引起DNA分子形成嘧啶二聚體，分子間氫鍵作用減弱，并扭曲雙鏈結(jié)構(gòu)，使堿基間正常配對受阻，致使造成突變.在誘變過程中，誘變方法是能否誘變成功的最關(guān)鍵的因素之一；此外，為保證突變不恢復(fù)，誘變后菌株應(yīng)在黑暗條件下培養(yǎng).伏建國[13]利用紫外線誘變鏈格孢菌篩選強(qiáng)產(chǎn)毒菌株時發(fā)現(xiàn)，在初篩的5 000株菌株中，獲得152株致病力增強(qiáng)菌株，正突變率為3.0%，得到1 383株致病力減弱菌株，負(fù)突變率為27.7%，這與本試驗(yàn)結(jié)果有一定的相似性.朱英蓮等[14]研究表明，利用紫外誘變照射劑量為15 W、照射距離為22 cm、時間為2 min時，可以篩選出呼吸缺陷型酵母菌株.馮友軍等[15]研究表明，對酒精酵母進(jìn)行紫外誘變，當(dāng)誘變條件為紫外(燈管功率15 W)波長253.7 nm，輻射間距為21 cm，時長1 min、3 min時，獲得了26株呈白色菌落表型的呼吸缺陷型突變株.而在本試驗(yàn)中，紫外誘變的最佳條件為照射劑量10 W、照射距離10 cm、時間為5 min，這與馮友軍[15]結(jié)果有些差異，可能是由于病原菌本身的特性和紫外燈功率不同所致.葉煦亭等[16]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜的通透性可以通過微波輻射增加，所以利用微波輻射篩選出了高產(chǎn)菌株.本試驗(yàn)對A.mali.強(qiáng)毒菌株分別進(jìn)行紫外誘變及微波輻射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫外照射5～7 min和微波輻射50～60 s后，在PDA平板上菌落生長不完整，中央氣生菌絲減少，顏色變?yōu)榛野咨咙S褐色，且無輪紋產(chǎn)生；其中經(jīng)紫外處理5 min和微波輻射60 s時，產(chǎn)生負(fù)突變，菌株生物學(xué)活性降低，致病力明顯減弱.將該菌株繼代培養(yǎng)8代后，觀察其形態(tài)特征并測定生物學(xué)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)致病力也未發(fā)生明顯變化.

本試驗(yàn)對A.mali.強(qiáng)毒菌株進(jìn)行紫外及微波輻射誘變，篩選出了使其發(fā)生負(fù)突變和致病力明顯減弱的最佳條件，并找到A.mali.弱毒菌株.但對于誘變后病原菌的形態(tài)是否發(fā)生變異，究竟哪些基因發(fā)生了突變和哪些機(jī)構(gòu)和功能受到障礙，尚待進(jìn)一步探索.

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Effects of ultraviolet lights and microwave irradiation on pathogenicity ofAlternariamali

HOU Bao-hong,DOU Jian-bin,WANG Wei-xiong,XU Bing-liang

(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

【Objective】 To study the ways to weak the pathogenicity ofA.malihigh virulence strain,and to provide theory basis for effectively control the disease.【Method】 The high virulence strain ofA.maliwas mutated by ultraviolet lights and microwave irradiation, the variation of pathogenicity were studied.【Result】 Under the doses of ultraviolet mutagenic were power for 10W,irradiation distance for 10 cm and time for 5 min,A.malishowed negative mutation,and pathogenic force decreased,the spore germination rate was only 58.45 % after 6 hours,the quantities of spore production,hypha growth and the colony diameter were 2×104individual/mL,152.67 mg and 3.67 cm respectively after 4 days of incubation,and incidence rate and disease index were 38.50 % and 10.32 after 7 days of incubation.Under the dose of microwave irradiation were power for 700 W and time for 60 seconds,the biological activity ofA.malimutants was the lowest,pathogenicity had the minimum,the spore germination rate was only 1.83% after 6 hours,the quantities of spore production,hypha growth and the colony diameter were 4 ×104individual/mL,139.30 mg and 3.83 cm respectively after 4 days of incubation,and incidence rate and disease index were 31.94 % and 7.87 after 7 d of incubation.【Conclusion】 Ultraviolet lights irradiation could cause the negative mutation,and microwave irradiation could weak the pathogenicity ofA.malihigh virulence strain.

AlternariamaliRoberts;ultraviolet lights; microwave irradiation

侯寶宏(1988-)，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊≡c植物病害.E-mail:houbh99@163.com

徐秉良，女，教授，博導(dǎo)，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué).E-mail:xubl@gsau.edu.cn

國家星火計劃項目(2013GA860001)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203034)；甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目(GNSW-2012-27).

2015-05-25；

2015-06-30

S 436.611

A

1003-4315(2016)04-0052-06