立枯絲核菌對馬鈴薯的致病機理研究Ⅱ：病原菌毒素對幼苗活性氧代謝及細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

張君,拓寧，邱慧珍,張文明,張春紅,劉星，朱靜

(甘肅農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室,甘肅 蘭州　730070)

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立枯絲核菌對馬鈴薯的致病機理研究Ⅱ：病原菌毒素對幼苗活性氧代謝及細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

張君,拓寧，邱慧珍,張文明,張春紅,劉星，朱靜

(甘肅農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室,甘肅 蘭州730070)

【目的】 探討馬鈴薯莖潰瘍病的病原菌立枯絲核菌的致病機理.【方法】 采用毒素處理組培苗及透射電鏡觀察相結(jié)合的方法，研究了不同濃度的病原菌菌毒素(T2:低濃度，T3:中濃度，T4:高濃度)對馬鈴薯幼苗體內(nèi)活性氧代謝及細胞超微結(jié)構(gòu)的影響.【結(jié)果】 病原菌毒素處理24 h后，中、高濃度處理(T3和T4)的馬鈴薯幼苗體內(nèi)超氧陰離子(O2-)的產(chǎn)生速率和丙二醛(MDA)的含量顯著高于對照CK(T1)，至120 h時達到峰值，T3和T4處理的O2-產(chǎn)生速率分別是T1的3.3倍和4.1倍，MDA分別是T1的3倍和5.4倍;毒素處理后馬鈴薯幼苗體內(nèi)H2O2含量的變化與O2-和MDA含量相似，處理96 h時即可達到峰值;電鏡下馬鈴薯莖基部組織細胞的超微結(jié)構(gòu)顯示,毒素處理24～48h后,馬鈴薯莖基部組織細胞的質(zhì)體開始變形腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變形；毒素處理72 h后,細胞膜消失，細胞線粒體變形，基質(zhì)外流，細胞壁不再光滑，質(zhì)膜斷裂；毒素處理96～120 h后，細胞質(zhì)溶解，逐漸衰老.【結(jié)論】 中、高濃度的病原菌毒素處理引起了馬鈴薯幼苗體內(nèi)活性氧的積累與膜脂過氧化反應(yīng)，由此造成的細胞質(zhì)膜斷裂，細胞器受損和細胞質(zhì)溶解等一系列細胞超微結(jié)構(gòu)的變化是潰瘍病最終導(dǎo)致植株死亡的可能機理.

馬鈴薯;病原菌毒素;活性氧;膜傷害;細胞超微結(jié)構(gòu)

of Aridland Crop Science,Lanzhou 730070,China)

馬鈴薯莖潰瘍病又稱立枯絲核菌病、黑痣病、莖基腐病、黑色粗皮病，是由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn )侵染引起的一種土傳病害[1]，已成為世界各國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)影響馬鈴薯塊莖產(chǎn)量及商品價值的重要病害[2-3]，也是影響我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要限制因子.馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)內(nèi)蒙[4-6]、黑龍江和遼寧等省[7]對馬鈴薯莖潰瘍病均有報道，發(fā)病嚴重地塊的植株死亡率高達70%～80%，塊莖發(fā)病率達到100%[4,6].甘肅省2010～2011年中部主產(chǎn)區(qū)和干旱灌區(qū)因莖潰瘍病引起的植株幼苗死亡率高達60%[8].這一病害對馬鈴薯的出苗、產(chǎn)量和商品性以及窖藏品質(zhì)造成了很大影響，已成為限制我省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的主要土傳病害[9].然而，有關(guān)這一病害發(fā)病規(guī)律和病原菌致病機理方面的研究鮮見報道.

立枯絲核菌在致病和培養(yǎng)過程中可產(chǎn)生毒素，是其菌致病的關(guān)鍵因子[10-13].立枯絲核菌粗毒素可顯著抑制水稻胚根和胚芽生長[14]，破壞水稻幼苗細胞膜的完整性和細胞的超微結(jié)構(gòu)[12]，菌株致病力越強，產(chǎn)生的毒素越多[15].然而，目前國內(nèi)的相關(guān)研究主要集中在水稻上[14,16]，尚未見馬鈴薯立枯絲核菌產(chǎn)毒和致病機理的研究.

前期研究發(fā)現(xiàn)，用毒素處理馬鈴薯植株，對根系的形態(tài)和生理、植株抗逆生理以及根系細胞膜的膜質(zhì)過氧化造成了顯著影響，而且在植株和塊莖上產(chǎn)生的癥狀與病原菌回接的一致，說明馬鈴薯立枯絲核菌毒素的作用可能是其致病的主要原因之一.

植物病原真菌毒素的作用機理相當復(fù)雜[17]，病原菌侵染會誘發(fā)寄主防衛(wèi)反應(yīng)的啟動，其中氧爆(oxidative burst，OB)為第一即時反應(yīng).有研究指出[18]，立枯絲核菌侵染后，寄主植物體內(nèi)能否快速啟動并有效運轉(zhuǎn)對ROS的清除系統(tǒng)決定著寄主的病情程度，立枯絲核菌侵染馬鈴薯后是否會引起體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生及清除系統(tǒng)的啟動尚未見報道，闡明這一過程對探明立枯絲核菌對馬鈴薯的致病機理具有重要意義.本研究采用課題組分離提取的粗毒素處理馬鈴薯幼苗，研究不同濃度的毒素對馬鈴薯幼苗體內(nèi)活性氧代謝及細胞超微結(jié)構(gòu)的影響，以探明馬鈴薯莖潰瘍病可能的致病機理，對這一病害的有效防控具有重要意義.

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試病原菌:馬鈴薯立枯絲核菌(R.solani)JT-18，由本課題組分離、鑒定，經(jīng)致病性測定對馬鈴薯具有強致病性[19].

供試組培苗:馬鈴薯‘大西洋’，由甘肅農(nóng)業(yè)大學馬鈴薯遺傳育種研究室莖尖脫毒，RT-PCR 檢測并保存.

供試培養(yǎng)基:MS 培養(yǎng)基;馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基( potato dextrose agar，PSA)[20];改良的Richard培養(yǎng)基:KNO310 g、KH2PO45 g、MgSO4·7H2O 5 g、Fe2(SO4)30.02 g、蔗糖50 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0;水瓊脂:瓊脂粉4 g、蒸餾水1 000 mL.

1.2試驗方法

1.2.1粗毒素的制備粗毒素的制備采用敖世恩等[21]的方法并稍作改動.將立枯絲核菌在PSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d，用打孔器取直徑0.5 cm 的菌餅，接種到盛有50 mL 改良的Richard 培養(yǎng)基的三角瓶中，每個三角瓶接種5個菌餅.于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，每日人工手動振蕩1次.培養(yǎng)20 d后，將培養(yǎng)液8 000 r/min 離心15 min，用定性濾紙過濾.濾液按0.4%的比例加入瓊脂粉，分裝于12 cm×3 cm 的50 mL離心管中，每管15 mL,115 ℃滅菌20 min，即為粗毒素，簡稱毒素.

1.2.2試驗設(shè)計試驗設(shè)4個處理，每個處理3次重復(fù).T1：對照(CK)，水瓊脂；T2：低濃度毒素，稀釋至毒素原液濃度的1/3；T3：中濃度毒素，稀釋至毒素原液濃度的2/3 ；T4：高濃度毒素，毒素原液.

將‘大西洋’馬鈴薯脫毒組培苗在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d，無菌條件下將長勢一致的幼苗取出移入不同處理的試管中，每管5株，于4 000 lx、25 ℃、L∶D = 16∶8 條件下培養(yǎng).每隔24 h 取樣進行超氧陰離子(O2-)、H2O2、MDA的測定，以及光學電鏡樣品的制備與觀察.

1.2.3活性氧和膜質(zhì)過氧化的測定超氧陰離子(O2-)產(chǎn)生速率的測定:參照王愛國，羅廣華等[22]的方法進行測定.H2O2含量的測定:參照Patterson等[23]的方法進行.膜脂過氧化程度測定：參照植物生理學實驗指導(dǎo)[24]方法.

1.2.4透射電鏡樣品制備與觀察在高濃度毒素處理(T4)中取樣，分別于處理后的24、36、48、72、96、120 h在植株莖基部取樣：莖基部用無菌水洗滌3遍后切成1 mm3大小的組織塊，用3%的戊二醛于4 ℃下固定，系列丙酮脫水，Epoin812樹膠包埋，

切片染色后用JEM-1230型透射電鏡觀察[25-26].

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計分析軟件，按照單因素隨機設(shè)計的方差分析模型，用Duncan氏新復(fù)極差法對同一時間不同處理的數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析.

2　結(jié)果與分析

2.1病原菌毒素對馬鈴薯幼苗體內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響

病原菌毒素處理對馬鈴薯幼苗體內(nèi)超氧陰離子O2-的產(chǎn)生速率造成了顯著影響.

從表1結(jié)果看出，病原菌毒素處理24 h后，中濃度(T3)和高濃度處理(T4)的馬鈴薯幼苗體內(nèi)超氧陰離子O2-的產(chǎn)生速率顯著高于對照(T1)，至處理后120 h時，幼苗體內(nèi)超氧陰離子O2-的產(chǎn)生速率達到峰值，T3和T4處理的O2-產(chǎn)生速率達為22.0和27.3 μ mol/g/min，分別是對照T1的3.3倍和4.1倍.低濃度的病原菌毒素處理對馬鈴薯幼苗未造成影響.由于毒素脅迫先后激發(fā)氧爆和馬鈴薯幼苗的防衛(wèi)反應(yīng)，隨著毒素效應(yīng)加劇，最終打破活性氧產(chǎn)生與清除之間的動態(tài)平衡，所以T3和T4處理馬鈴薯體內(nèi)超氧陰離子O2-產(chǎn)生速率的變化呈先上升后下降再上升的規(guī)律.

表1毒素處理后馬鈴薯幼苗體內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生速率的變化

Tab.1Production rate of O2-after treating with toxin ofRhizoctoniasolani(μ mol·g-1·min-1)

處理處理時間/h24487296120T11.7±0.7b2.7±1.1b2.0±1.0a5.1±0.8b6.7±1.0bT21.6±0.4b2.7±0.6b2.0±0.4a9.6±1.9b10.2±2.9bT34.4±0.6ab1.8±0.4b2.0±0.8a21.0±6.0a22.0±4.8aT45.7±0.8a7.5±1.7a3.9±1.1a26.0±1.7a27.3±3.2a

2.2病原菌毒素對幼苗體內(nèi)H2O2含量的影響

毒素處理后馬鈴薯幼苗體內(nèi)H2O2含量的變化與O2-的產(chǎn)生速率相似，但是峰值的到達時間提前至處理96 h(表2).

從表2結(jié)果可以看出，病原菌毒素處理對馬鈴薯幼苗體內(nèi)H2O2的含量造成了顯著影響， 病原菌毒素處理24 h后，T3和T4處理的馬鈴薯幼苗體內(nèi)H2O2的含量顯著高于對照T1，至處理后96 h時幼苗體內(nèi)H2O2的含量達到峰值，為2.5、2.6 μmol/g，分別是對照CK的2.5倍和2.6倍.由于H2O2是O2-轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物，它們的含量有一定的相關(guān)性，同樣呈現(xiàn)先上升后下降再上升的變化趨勢.

2.3病原菌毒素對幼苗體內(nèi)丙二醛含量的影響

研究結(jié)果表明，毒素處理對馬鈴薯幼苗體內(nèi)丙二醛(MDA)的含量造成了顯著影響，趨勢與O2-的產(chǎn)生速率完全相同(表3).

表3結(jié)果顯示， 病原菌毒素處理24 h后，T3和T4處理的馬鈴薯幼苗體內(nèi)MDA的含量顯著高于對照T1，至處理后120 h時幼苗體內(nèi)MDA的含量達到峰值，T3和T4處理下MDA為26.7、48.3 μmol/g，分別是對照CK的3倍和5.4倍，MDA是O2-和H2O2在細胞質(zhì)膜積累引起膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，因此T3和T4處理中馬鈴薯幼苗體內(nèi)MDA含量的變化同樣呈先上升后下降再上升的規(guī)律.

表2　毒素處理后馬鈴薯幼苗體內(nèi)H2O2含量的變化Tab.2　H2O2 accumulation level after treating with toxin of Rhizoctonia solani　(μmol·g-1)

表3　毒素處理后馬鈴薯幼苗體內(nèi)丙二醛含量的變化Tab.3 Changes of MDA after treating with toxin of Rhizoctonia solani　(μmol·g-1)

2.4病原菌毒素對馬鈴薯莖基部細胞超微結(jié)構(gòu)的破壞作用

透射電鏡的結(jié)果顯示，與正常細胞的結(jié)構(gòu)完整(圖1-A)相比，用毒素處理24 h后,由于活性氧的迅速積累，馬鈴薯細胞的質(zhì)體開始變形腫脹(圖1-B);毒素處理48 h后雖然活性氧的含量有所下降，但對細胞結(jié)構(gòu)的損傷是不可逆的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)變形，腫脹(圖1-C);毒素處理72 h后,細胞內(nèi)含物消解(圖1-D),膜質(zhì)過氧化加劇導(dǎo)致細胞膜消失，細胞線粒體變形，基質(zhì)外流粒(圖1-E)，細胞壁不再光滑，質(zhì)膜斷裂(圖1-F).毒素處理96～120 h后，細胞質(zhì)溶解.

A:對照馬鈴薯莖基部細胞結(jié)構(gòu)完整(×10 000)；B：毒素處理24 h后質(zhì)體腫脹(×5 000)；C：毒素處理48 h后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹(×10 000)；D：毒素處理72 h后細胞內(nèi)含物消失(×10 000)；E：毒素處理后線粒體變形(×20 000)；F：毒素處理后細胞質(zhì)膜斷裂(×5 000). 圖1　毒素對馬鈴薯莖基部組織和細胞的損傷作用Fig.1　Destructive effects of Rhizoctonia solani on tissue and cell

3　討論與結(jié)論

3.1病原菌毒素導(dǎo)致幼苗活性氧代謝發(fā)生變化

活性氧在健康植株體內(nèi)不存在或很少，當植物被病原菌侵染或被其它因素誘導(dǎo)時，能迅速產(chǎn)生和激發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)的啟動，其中氧爆(oxidative burst，OB)為第一即時反應(yīng)，超氧陰離子、H2O2是主要活性氧類型，氧爆過程產(chǎn)生高濃度活性氧(reactive oxygen species，ROS)既可作為信號物質(zhì)調(diào)控和激活寄主的防衛(wèi)反應(yīng)[18]，又可對病原物起直接毒殺作用，引起膜質(zhì)過氧化，形成MDA.立枯絲核菌侵染后，寄主植物體內(nèi)能否快速啟動對ROS的清除系統(tǒng)決定著寄主的病情程度，且作物對不同濃度毒素脅迫的響應(yīng)不同.紀兆林等[27]研究表明小麥紋枯病菌毒素能干擾寄主生長代謝，是重要的致病因子，同時在低濃度時又有誘導(dǎo)寄主進行抗病性代謝的作用.本研究結(jié)果也表明，莖潰瘍病菌毒素可誘導(dǎo)馬鈴薯幼苗體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生積累，最終導(dǎo)致膜脂過氧化是其致病性的內(nèi)在機制，但是，活性氧對各濃度毒素的響應(yīng)各異.中高濃度毒素活性氧的升高幅度明顯大于低濃度毒素，低濃度毒素對活性氧的產(chǎn)生和膜脂過氧化程度與對照相比始終差異不顯著，基本保持相同水平，這是由于低濃度毒素不足以對馬鈴薯幼苗造成脅迫；中高濃度毒素處理24 h后活性氧含量迅速升高，同時又是是馬鈴薯受毒素脅迫后，防衛(wèi)反應(yīng)最活躍、生理代謝最旺盛的階段，氧爆反應(yīng)激發(fā)馬鈴薯幼苗的防衛(wèi)反應(yīng)導(dǎo)致活性氧在72 h時有所下降，隨著毒素效應(yīng)的加劇，寄主植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除之間的動態(tài)平衡被打破,超氧陰離子和H2O2大量積累，導(dǎo)致膜脂過氧化，形成MDA,各指標分別在96～120 h左右達到峰值，出現(xiàn)受害癥狀.這與張獻龍、朱龍付在棉花黃萎病SSN基因表達被抑制后轉(zhuǎn)基因棉花莖桿和葉片中活性氧水平明顯上升，病程相關(guān)蛋白大量積累并產(chǎn)生類病斑的最新研究結(jié)果基本一致[28].

3.2病原菌毒素導(dǎo)致細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化

大多數(shù)死體營養(yǎng)型病原真菌產(chǎn)生的毒素均為非寄主?；缘?，大量研究結(jié)果表明，大多數(shù)病菌毒素都能不同程度地對植物細胞超微結(jié)構(gòu)造成傷害，且來源不同的毒素,其作用位點可能不同.Xu等[ 29]用煙草野火病菌毒素處理煙草葉片,導(dǎo)致葉綠體內(nèi)膜系統(tǒng)破壞,基粒片層解體,葉綠體形成泡囊,但淀粉粒增多并膨大，李秀琴等[30]研究發(fā)現(xiàn)，玉米全蝕病菌毒素能使玉米根組織線粒體變形，外膜扭曲脊粒模糊發(fā)生空泡化，葉綠體膜瓦解，基粒片層減少扭曲并膨脹，中間出現(xiàn)空泡.楊樹潰瘍病菌毒素處理楊樹樹皮愈傷組織的結(jié)果表明，細胞變形消解，中膠層分解，質(zhì)膜內(nèi)陷，質(zhì)壁分離，線粒體局部破裂，分解成顆粒甚至空泡化，細胞核在處理的后期核膜破裂，核仁部分分解[31]黃萎病菌毒素處理親和與不親和棉花品種的愈傷組織，電子顯微鏡下觀察到親和種寄主細胞膜在VD毒素處理6h后即開始出現(xiàn)細胞膜的內(nèi)陷現(xiàn)象，隨時間增加細胞核的染色質(zhì)向核邊緣聚集，末期細胞質(zhì)凝集，細胞膜部分結(jié)構(gòu)消失，而不親和品種的細胞并未發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)變化，而且出現(xiàn)的時間晚[21].陳夕軍等[32]研究表明立枯絲核菌粗毒素能顯著破壞水稻細胞結(jié)構(gòu)，處理24 h，后引起水稻組織電解質(zhì)滲透和磷素外滲，葉綠體膜被破壞，薄片化空泡化，處理72 h后，葉綠體降解，其他細胞器變得不清晰或消失，例如線粒體，一部分細胞壁變薄消失.本研究結(jié)果表明，對照細胞結(jié)構(gòu)清晰可見，細胞質(zhì)膜完整光滑，核質(zhì)豐富,線粒體結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則正常;毒素處理24 h后,馬鈴薯幼苗莖基部組織細胞的質(zhì)體開始變形腫脹，毒素處理36 h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變形，毒素處理48～72 h后，細胞線粒體變形，基質(zhì)外流粒，細胞壁不再光滑，質(zhì)膜斷裂，毒素處理96～120 h后，細胞質(zhì)溶解，細胞核染色質(zhì)增多，逐漸衰老.這可能都與活性氧積累最終導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化細胞衰老死亡有關(guān)，但具體毒素如何作用于細胞膜的受體、信號識別及傳導(dǎo)機制等,以及如何觸發(fā)對馬鈴薯的一系列致病反應(yīng)還有待進一步研究.

[1]霍茂林.要注意防治馬鈴薯絲核菌病[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè),1988(4):26

[2]Todd C A.Rhizoctoniadisease on potatoes:the effect of anastomosis groups,fungicides and zinc on disease[D].Adelaide:University of Adelaide,2009

[3]Tsror L.Biology，epidemiology and management ofRhizoctoniasolanion potato[J].Journal of Phytopathology,2010,158:649-658

[4]張笑宇,于肖夏,高翔,等.鈴薯黑痣病菌毒素誘導(dǎo)馬鈴薯幼苗丙二醛含量、細胞膜透性及PAL 活性的變化[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報,2012,33(2):16-20

[5]劉寶玉,胡俊,蒙美蓮,等.馬鈴薯黑痣病病原菌分子鑒定及其生物學特性[J].植物保護學報2011,38(4):379-382

[6]曹春梅,李文剛,張建平,等.馬鈴薯黑痣病的研究現(xiàn)狀[J].中國馬鈴薯,2009,23(3):171-173

[7]陳萬利.馬鈴薯黑痣病的研究進展[J].中國馬鈴薯,2012,26(1):49-51

[8]孟品品,劉 星,邱慧珍,等.連作馬鈴薯根際土壤真菌種群結(jié)構(gòu)及其生物效應(yīng)[J].應(yīng)用生態(tài)學報，2012,23(11):3079-3086.

[9]余斌,沈?qū)氃?王文,等.連作障礙對干旱地區(qū)不同馬鈴薯品種的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2012,47(4):43-47

[10]Frank J A,Francis S K.The effect of aRhizoctoniasolaniphytotoxin on potatoes[J].Canadian Journal of Botany,1976,54:2536-2540

[11]Huang W W,Xiang Z,Gong L,et al.Preliminary study on the extraction of crude toxin ofRhizoctoniasolaniand its activity[J].Agricultural Science and Technology,2009,10:132-136

[12]陳夕軍,潘存紅,孟令軍，等.水稻紋枯病菌毒素提純及其組分初步分析[J].揚州大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版,2011,32(1):44-48

[13]徐敬友,張華東,張紅,等.立枯絲核菌毒素的產(chǎn)生及與致病力的關(guān)系[J].揚州大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版,2004,25(2):61-64

[14]康霄文,龍曉波,陳捷,等.水稻紋枯病菌粗毒素的初步研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,1992,23(1):19-22

[15]Vidhyasekaran P，Ponmalar T R，Samiyappan R，et al.Host-specific toxin production byRhizoctoniasolani，the rice sheath blight pathogen[J].Phytopathology,1997,87:1258-1263

[16]Betancourt O，Ciampi L.Contribution to the study and control ofRhizoctoniasolaniⅠ:extraction and bioassay of phenylacetic acid phytotoxicity produced in vitro byR.solaniAG-3[J].Fitopatologia,2000,35:119-125

[17]張華東.立枯絲核菌毒素的產(chǎn)生及與致病力的關(guān)系[D].揚州:揚州大學,2003

[18]Hemissi I，Mabrouk Y，Mejri S，et al.Enhanced defence responses of chickpea plants againstRhizoctoniasolaniby Pre-inoculation withRhizobia[J].Journal of Phytopathology,2013.DOI:10.1111/jph.12071

[19]路小琴，李亞娟，邱慧珍,等.甘肅省中部沿黃灌區(qū)馬鈴薯莖潰瘍病病原菌生物學特性研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報,2015,50(1)：84-88

[20]方中達.植病研究方法[M].3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1998

[21]敖世恩,楊媚,周而勛,等.水稻抗紋枯病突變體的離體篩選[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報,2006,27(1):47-50

[22]王愛國,羅廣華.植物的超氧物自由基與羥胺反應(yīng)的定量關(guān)系[J].植物生理學通訊,1990(6)：55-57

[23]Patterson B D,Mackae E A,Fergusen I B.Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts using Titanium(Ⅳ)[J].Anal Biochem,1984,139:487-492

[24]鄒琦.植物生理學實驗指導(dǎo)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000

[25]甘習華,韓素芬.刺槐根瘤菌侵入線研究中的電鏡制樣方法[J].南京林業(yè)大學學報,1997,21(4):90-92

[26]陳健輝,李榮華,郭培國.干旱脅迫對不同耐旱性大麥品種葉片超微結(jié)構(gòu)的影響[J].植物學報，2011,46(1):28-36

[27]紀兆林,陳景鵬,徐敬友,等.小麥紋枯病菌毒素對小麥植株的作用[J].揚州大學學報,2011,32(3):55-59

[28]Lian X,Zhang X L,Zhu L F.Functional characterization of cotton genes responsive toVerticilliumdahliathrough bioinformatics and reverse genetics strategies[J].Jouranl of Experimental Botany,2014,65(22)6679-6692

[29]Xu L,Zhang S G.Research prospect of the tabtoxin's pathogenicity(in Chinese)[J].Journal of Yunnan Agricultural University,2005,20(5):651-654

[30]宋蒙娜,李秀琴,姚建民，等.玉米全蝕病病菌侵染過程及其毒素的初步研究[J].玉米科學,1995(S1):64-67

[31]趙仕光,朱瑋,岳紅艷,等.楊樹潰瘍病菌毒素對楊樹樹皮愈傷組織超微結(jié)構(gòu)的影響[J].林業(yè)科學研究,1998,11(3):253-259

[32]陳夕軍,徐艷.童蘊慧,等.水稻紋枯病菌毒素致病機理研究[J].植物病理學報,2009,39(4):439-443

(責任編輯李辛)

Pathogenesis mechanism ofRhizoctoniasolanion potato Ⅱ：Effects ofRhizoctoniasolanitoxin on active oxygen metabolism and cell ultrastructure of potato plantlets

ZHANG Jun，TUO Ning，QIU Hui-zhen，ZHANG Wen-ming，ZHANG Chun-hong，LIU Xing，ZHU Jing

(College of Resources and Environmental Sciences,Gansu Agricultural University，Gansu Provincial Key Lab

【Objective】 To explore the pathogenesis mechanism of stem canker of potato virus-free plantlets treated withR.solanitoxin.【Method】 Treating the potato tissue culture seedlings withR.solanitoxin at different concentrations (T2:low concentration,T3:medium concentration,T4: high concentration),observing the cell ultrasturcture by transmission electron microscopy (TEM) to research the effects ofR.solanitoxin on active oxygen metabolism and cell ultrastructure.【Result】 O2-generation rate and MDA content in potato seedlings were significantly higher than those of CK after being treated for 24 h withR.solanitoxin at high concentration treatment (T3and T4),reached the maximum at 120 h.O2-generation rate of T3and T4was 3.3 and 4.1 times as that of CK,respectively and MDA content reached 3 and 5.4 times as that of CK,respectively.The changing trend of H2O2content was similar to that of O2-generation rate and MDA content,reaching the maximum at 96 h.When being treated for 24～48 h,the plastid of histocyte at potato stem base began to swell and endoplasmic reticulum deformed.After being treated for 72 h,cell membrane disappeared,plastochondria deformed,cell wall was no longer smooth,matrix outflowed,plasma membrane fractured.After 96～120 h,cytoplasm dissolved,more chromatin can be seen in the nucleus and appeared cell aging.【Conclusion】 Medium and high concentration toxin caused accumulation of active oxygen species as well as lipid peroxidation,resulting in cell plasma membrane fracture,organelle damage,cytoplasmolysis,which was the possible pathogentic mechanism of canker causing plantlet death.

potato;pathogen toxin;active oxygen；membrane damage;cell ultrastructure

張君(1989-)，男，碩士研究生，研究方向為植物營養(yǎng).E-mail:18893704728@163.com

邱慧珍，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物營養(yǎng)及營養(yǎng)生態(tài)的教學與科研工作， E-mail:hzqiu@gsau.edu.cn

2015-04-17；

2015-05-06

S 532

A

1003-4315(2016)04-0020-06