內(nèi)毒素在高糖高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎大鼠中的作用機制研究*

王文軍郭建紅張楊韓德五

內(nèi)毒素在高糖高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎大鼠中的作用機制研究*

王文軍①郭建紅①張楊①韓德五①

目的：觀察高糖高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）大鼠肝臟巨噬細胞、血漿腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達及肝細胞凋亡變化特點，探討內(nèi)毒素（LPS）在大鼠NASH發(fā)生發(fā)展中的作用機制。方法：雄性SD大鼠隨機分為9周組：Synthetic diet+saline組、Synthetic diet+LPS組、Regular diet+LPS組和Regular diet+saline組；以及5周組：Synthetic diet組和Regular diet組，并在第5周末處死以觀察高糖高脂飲食對大鼠肝臟影響。自第6周開始，9周組大鼠隔日皮下注射LPS 0.5 mg/kg或相同劑量的0.9%氯化鈉注射液，在9周末處死檢測其血漿LPS、ALT與TNF-α水平，并觀察肝臟病理變化、測定肝臟CD68的表達與肝細胞凋亡水平。結果：5周Synthetic diet組肝臟有輕度脂肪變性。9周Synthetic diet+LPS組與其對照組Synthetic diet+saline組和Regular diet+LPS組相比，血漿LPS、ALT與TNF-α表達水平、CD68表達與細胞凋亡率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Synthetic diet+saline組和Regular diet+saline組相比血漿LPS、ALT及TNF-α顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CD68陽性表達與TNF-α水平呈顯著正相關（r=0.64，P＜0.05）結論：高糖高脂飲食誘導的NASH大鼠模型體內(nèi)形成了LPS血癥，LPS可對肝臟形成第二次打擊，當CD68增加，TNF-α的表達也明顯提高，兩者呈現(xiàn)明顯正相關，同時細胞凋亡率也明顯增多，推斷LPS可能通過激活巨噬細胞分泌促炎因子TNF-α介導肝細胞凋亡，進一步促進NASH的發(fā)展。

內(nèi)毒素； 非酒精性脂肪性肝炎； 巨噬細胞； TNF-α； 凋亡

目前肥胖及其相關疾病在全球呈現(xiàn)流行趨勢，是醫(yī)學界面臨的一大挑戰(zhàn)，非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一臨床和病理學術語，疾病范圍包括從簡單的甘油三酯在肝細胞積累，肝脂肪變性和炎癥、纖維化和肝硬化，常見于肥胖患者［1］。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoho lic steatohepatitis，NASH）是NAFLD的一種，為發(fā)達國家引起慢性肝臟疾病的最常見原因，它會導致肝硬化和肝細胞癌的風險增加［2-4］。因此明確NASH發(fā)病機制，阻止其病情進一步惡化，已成為當今醫(yī)學界研究熱點。

近年來的許多研究已證實腸源性內(nèi)毒素（LPS）血癥在NASH的形成發(fā)展中有著重要作用［5］，在前期研究筆者發(fā)現(xiàn)在NASH中肝細胞凋亡率隨病情加重而升高，提示肝細胞凋亡在NASH的病理發(fā)展過程中是一個極為重要的因素［6］，但是目前LPS引起肝細胞凋亡機制尚不明確，本研究旨在通過高脂高糖飲食誘導建立NASH大鼠模型，多次小劑量注射LPS觀察肝臟巨噬細胞與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）的表達及肝細胞凋亡變化特點來探討LPS在NASH大鼠中的作用機制。

1　材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠30只，體重200～250 g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；LPS測定鱟試劑盒（上海伊華臨床醫(yī)學科技公司）；TNF-α放免試劑盒（解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所）；CD68小鼠抗大鼠單克隆抗體（Abcame公司），二抗免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），TUNEL檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及模型建立 30只雄性SD大鼠均給予標準基礎飼料，自由進食飲水3d后，設立9周組：Synthetic diet+saline 組、Synthetic diet+LPS組、Regular diet+LPS組、Regular

diet+saline組， 每組5只。 另外設立5周組，Synthetic diet組與Regular diet組，每組5只，在第5周末麻醉處死該組大鼠以觀察高糖高脂對大鼠肝臟影響。Synthetic飲食配方為含68.75%普通飼料+20%豬油+10%蔗糖+1%膽固醇+0.25%膽酸。自第6周開始，9周組大鼠在相同條件下隔天皮下注射LPS 0.5 mg/kg或相同劑量的0.9%氯化鈉注射液，所有大鼠自由進食與飲水。在實驗第9周末，1%戊巴比妥鈉3 mL/kg腹腔注射麻醉動物，無菌無熱原條件下取腹主動脈血，3500 rpm離心后取血漿備用，取肝左葉10%福爾馬林固定，石蠟包埋5 μm切片備用，余肝組織置于-70 ℃冰箱備用。

1.3.2 病理學檢查 石蠟切片做HE染色，在光鏡下觀察肝組織病理變化。

1.3.3 生化指標檢測 放免法測定血漿TNF-α水平；賴氏2、4-二硝基苯肼比色法測定血漿ALT活性，鱟試劑法測定血漿LPS水平，實驗過程均嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3.4 免疫組織化學方法 石蠟切片免疫組化檢測肝組織中CD68（巨噬細胞分子標記物）的表達，在400倍光鏡下，每組取5張，每張隨機選取取5個視野，運用Image-Pro Plus 6.0軟件進行光密度值的測定。CD68表達陽性為光鏡下細胞腺呈棕黃色顆粒。

1.3.5 TUNEL染色法 在400倍光鏡下，每組取5張，每張切片隨機選取5個視野，計算凋亡細胞數(shù)與總細胞數(shù)比值，測定細胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計學處理 本實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件處理，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗或單因素方差分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，采用Pearson’s相關性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1 肝臟組織學觀察 光鏡下5周Regular diet組大鼠正常肝組織肝小葉結構完整，肝細胞核圓位于中央，呈條索狀排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞內(nèi)未見脂滴（圖1A）；而5周Synthetic diet組肝細胞體積增大，胞漿內(nèi)可見小泡脂滴，肝細胞呈輕度脂肪變性，細胞輪廓模糊（圖1B）。

圖1　5周組大鼠肝組織病理變化（HE，×100）

2.2 各組生化指標檢測結果比較 Synthetic diet+LPS組血漿LPS、ALT、TNF-α水平均顯著高于Regular diet+LPS組和Synthetic diet+saline組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），血漿LPS、ALT、TNF-α表達水平分別為后兩者的1.4～3倍、1.2～4倍、1.3～2倍。Synthetic diet+saline組與Regular diet+saline組相比血漿LPS、ALT、TNF-α均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而Regular diet+LPS組血漿LPS、ALT與TNF-α水平與Regular diet+saline組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1　9周組大鼠各生化指標的比較（x-±s）

2.3 各組免疫組化檢測結果比較 Regular diet+saline組肝組織較少見CD68陽性單核巨噬細胞浸潤，Regular diet+LPS組陽性表達量也無明顯變化，與Regular diet+saline組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Synthetic diet+saline組CD68陽性表達量與Regular diet+saline組比較明顯增多（P＜0.05）；而在Synthetic diet+LPS組可見大量巨噬細胞浸潤，Synthetic diet+LPS組（1.24±0.36）與Synthetic diet+saline 組（0.76±0.18）、Regular diet+LPS組（0.41±0.11）比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2～3。

圖2　各組大鼠肝組織中CD68的表達（IHC，X400）

圖3　各組大鼠CD68陽性表達平均光密度值比

2.4 各組肝細胞凋亡變化比較 在光鏡下，正常肝細胞細胞核為藍色，凋亡細胞細胞核為棕黃色，正常對照組（Regular diet+saline組）偶見少量的肝細胞凋亡，Regular diet+LPS組可以看到肝細胞凋亡數(shù)量無明顯變化，凋亡率與Regular diet+saline組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而在Synthetic diet誘導建立的NASH大鼠模型中，肝細胞凋亡率明顯升高，Synthetic diet+LPS組肝細胞凋亡率達到最高值，與Synthetic diet+saline組、Regular diet+LPS組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4～5。

圖4　各組大鼠肝細胞凋亡的變化（TUNEL，X400）

圖5　各組大鼠TUNEL染色陽性凋亡細胞變化

2.5 相關性分析 經(jīng)Pearson’s相關性分析，CD68陽性表達與TNF-α水平呈顯著正相關（r=0.64，P＜0.05）。

3　討論

本研究采用高脂高糖飲食誘導建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）模型，在喂飼5周高脂高糖飲食的基礎上，自第6周開始隔天皮下注射內(nèi)毒素（LPS）0.5 mg/kg或相同劑量的0.9%氯化鈉注射液，來觀察肝臟細胞凋亡變化特點。研究結果顯示Regular diet+LPS組大鼠肝臟并無明顯脂肪病變，血漿LPS水平和肝損傷指標血漿ALT表達與Regular diet+saline組相比亦無顯著變化；Synthetic diet+LPS組血漿LPS水平進一步升高、ALT表達亦明顯進一步增加，肝功能受損加重，與Synthetic diet+saline組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示同樣劑量的LPS對正常肝臟不具損傷作用，而對在高糖高脂飲食的作用下發(fā)生輕度脂肪變性的肝臟造成了進一步損傷，使肝臟原有疾病加重，對肝臟形成第二次大擊，促進了大鼠NASH的病情進展。

CD68是巨噬細胞的標志物，能較好的反映巨噬細胞在組織中的浸潤程度，通常采用免疫組化檢測CD68陽性表達［7-8］。Mita等［9］的研究顯示，肝內(nèi)過多表達的巨噬細胞在暴發(fā)性肝衰竭患者發(fā)病機制中會起到關鍵性作用。本研究顯示，Regular diet+saline組肝組織較少見CD68標記的陽性單核巨噬細胞浸潤，經(jīng)LPS處理后Reyular+diet+LPS組數(shù)量并無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而Synthetic diet+LPS組肝內(nèi)CD68標記的陽性細胞數(shù)量明顯高于Synthetic diet+saline組及Regular diet+LPS組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示CD68分子標記的肝臟巨噬細胞在NASH的發(fā)病機制中發(fā)揮了一定的作用。

腫瘤死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）具有促炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用，是機體免疫反應和炎癥反應的重要介質(zhì)［10-11］，可由激活的肝臟巨噬細胞分泌產(chǎn)生。革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分LPS是腸源性內(nèi)毒素的主要成分，是肝臟巨噬細胞最敏感的活化劑。據(jù)研究報道TNF-α的高表達與肝細胞凋亡具有顯著的相關性［12］，Kudo等［13］的研究顯示LPS 上調(diào)了TNF-α 在NASH小鼠中的表達，并表明由TNF-α誘導的肝細胞凋亡增多。本研究結果發(fā)現(xiàn)Regular diet+LPS組與Regular diet+saline組比較，TNF-α的表達無明顯變化，凋亡率也無明顯差異，而在Synthetic diet+LPS組TNF-α的表達達到最大值，同時凋亡率也升到最高值，與Synthetic diet+saline組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），本研究結果與Kudo等［13］的研究結果相一致，并進一步證實了在NASH中LPS會上調(diào)TNF-α表達，由TNF-α介導引起的肝細胞凋亡在NASH大鼠的發(fā)病機制中起著重要作用。

筆者認為在NASH大鼠中，因腸道黏膜屏障受損等原因，腸源性內(nèi)毒素很容易進入全身血液循環(huán)，研究結果顯示，Synthetic diet+LPS組血漿LPS水平與Synthetic diet+saline組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示NASH模型大鼠體內(nèi)形成了LPS血癥。據(jù)Rivera等［14］的研究報道，在NASH小鼠模型中CD14 mRNA的表達增強了細胞對LPS的敏感性，從而使LPS的生物活性大大增強［15-16］，LPS進入血循環(huán)后，其脂質(zhì)A部分與LPS結合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）形成復合物，通過與表達在巨噬細胞表面的相應受體結合，激活單核-巨噬細胞釋放大量的TNF-α［17］，與表達在肝細胞膜的TNF受體結合導致肝細胞損傷，并由此介導肝細胞的凋亡，最終促進NASH的發(fā)展。

在對TNF-α水平的表達和CD68標記的陽性細胞表達進行Pearson’s相關性分析后，筆者發(fā)現(xiàn)在NASH中TNF-α的表達與CD68的表達呈明顯的正相關［18-19］，推測NASH中LPS可激活巨噬細胞釋放大量TNF-α，從而增強了TNF-α介導的肝細胞凋亡［20-21］，未來還需要做進一步研究來探討LPS在NASH中的確切機制，為治療NASH和肝硬化等疾病提供理論依據(jù)。

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Pathogenesis Study of Lipopolysaccharide on High Fat and High Sugar-induced Non-alcoholic

Steatohepatitis in Rats

/WANG Wen-jun，GUO J ian-hong，ZHANG Yang，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（25）：019-023

Objective：To observe liver macrophages，tumor necrosis factor-α（TNF-α） expression of high-sugar high-fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis （NASH） rat and liver changes of cell apoptosis，to explore LPS development mechanism occurs in the rat NASH.Method：SD rats were randomly divided into nine weeks group：Synthetic diet+saline group，Synthetic diet+LPS group，Regular diet+LPS group and Regular diet+saline group.The establishment of five additional weeks group：Synthetic diet group and the Regular diet group，and in the fifth week were sacrificed in order to observe the effects on the liver Synthetic diet.Since the first 6 weeks，the 9 weeks group of rats injected subcutaneously every other day LPS 0.5 mg/kg or the same dose of saline，were killed in the weekend 9 detected in plasma LPS，ALT and TNF-α levels and liver pathology observed，measured liver CD68 expression and the level of apoptosis.Result：The 5 weeks Synthetic diet group had mild liver steatosis.The 9 weeks Synthetic diet+LPS group compared to the control group Synthetic diet+saline group and Regular diet+LPS，plasma LPS、ALT and TNF-α expression levels，CD68 expression and cell apoptosis rate significantly increased，and were statistically significant（P＜0.05）.Synthetic diet+saline group compared to Regular diet+saline group，plasma LPS，ALT and TNF-α significantly increased，with statistical significance（P＜0.05）.CD68 positive expression and TNF-α levels were positively related（r=0.64，P＜0.05）. Conclusion：High-sugar high-fat diet-induced rat model of NASH in vivo formation of endotoxemia，LPS can form “two-hit” to the liver，when CD68 increased expression of TNF-α are also significantly improved，both show significant positive correlation，while apoptosis rate is significantly increased，we infer that LPS can activated macrophages to secrete TNF and induced apoptosis in liver cells，further promote the development of NASH.

Lipopolysaccharide； Non-alcoholic steatohepatitis； Macrophage； Tumor necrosis factor-α； Apoptosis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.25.006

2016-04-26） （本文編輯：蔡元元）

山西省基礎研究項目（2013011054-2）

①山西醫(yī)科大學 山西 太原 030001

郭建紅

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China