基于異喹啉生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律推斷博落回莖中的生物堿△

余坤，左姿，卿志星，楊鵬，曾建國，2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128)

·基礎(chǔ)研究·

基于異喹啉生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律推斷博落回莖中的生物堿△

余坤1，左姿1，卿志星1，楊鵬1，曾建國1，2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128)

目的：快速分析博落回莖中的生物堿成分。方法：應(yīng)用高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜對博落回莖的生物堿進(jìn)行分析，根據(jù)一級質(zhì)譜的分子離子和二級質(zhì)譜的碎片離子，結(jié)合博落回中異喹啉類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律，推斷博落回莖中的生物堿結(jié)構(gòu)。結(jié)果：從博落回莖中推斷出11個生物堿的結(jié)構(gòu)，分別為木蘭箭毒堿(Magnocurarine，1)，網(wǎng)脈番荔枝堿(Reticuline，2)，金黃紫堇堿(Scoulerine，3)，輪環(huán)藤酚堿(Cyclanoline，4)，13-甲氧基小檗堿(13-methoxyberberine，5)，四氫巴馬丁(Tetrahydropalmatine，6)，原阿片堿(Protopine，7)，別隱品堿(Allocryptopine，8)，N-甲基氫化小檗堿(N-methylcanadine，9)，血根堿(Sanguinarine，10)，白屈菜紅堿(Chelerythrine，11)，其中化合物1～6及9首次在博落回中報道。結(jié)論：經(jīng)驗證，基于異喹啉生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律推斷博落回莖中生物堿的方法可行。

高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜；生物堿；博落回

博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.是罌粟科博落回屬植物，主要分布在中國的長江中下游地區(qū)[1]。博落回具有抗菌[2]、抗炎[3]、殺蟲[4]、保肝[5]、抗腫瘤[6-7]、促動物生長[8]、凈化水土和防止水土流失[9-10]的作用。據(jù)報道[11-12]，博落回中含有血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿等多種異喹啉類生物堿，這些生物堿主要屬于苯并菲啶、二氫苯并菲啶、普羅托品、原小檗堿、N-甲基四氫原小檗堿等六大類，而生源合成途徑中的芐基異喹啉、四氫原小檗堿、阿樸芬類生物堿卻很少報道[13]。博落回中的研究對象主要是果莢，根和葉也有研究，而莖的研究相對較少，但莖占據(jù)了植物體大部分的生物量。因此，有必要對博落回莖進(jìn)行研究。近年來，高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF-MS/MS)由于具有快速、準(zhǔn)確和所需樣品量少等優(yōu)點，逐漸用于分析和鑒定植物中的化學(xué)成分[14-15]。利用HPLC-Q-TOF-MS/MS可以獲得化合物的精確分子量和二級碎片信息來推斷化合物的結(jié)構(gòu)，還可以對選擇性分離某些成分提供幫助。卿志星等[16]對博落回中九大類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行了總結(jié)，本實驗在此基礎(chǔ)上，用HPLC-Q-TOF-MS/MS對博落回莖中生物堿進(jìn)行分析，從中鑒定出11個生物堿成分，其中7個首次在博落回中報道。

1 儀器與試藥

1290 HPLC串聯(lián)6530 Q-TOF/MS(美國Agilent公司)，ML204/02型精密天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，乙腈、甲酸(色譜純，Merck)，甲醇(色譜純，安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司)，水為Milli-Q超純水。博落回原料來自國家中藥材生產(chǎn)(湖南)技術(shù)中心，經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾建國教授鑒定為博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br.的莖。原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿對照品為實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

取1.0 g博落回干燥莖粉末，100 mL甲醇70 ℃回流提取1 h，過濾，濾液過0.22 μm濾膜，待用。

2.2 色譜條件

色譜柱：XAqua C8柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流動相A為0.2%甲酸-水，流動相B為乙腈；梯度洗脫：0→8min，5%→30%B；8→15 min，30%→45%B；15→21 min，45%→75%B；流速：0.4 mL·min-1；檢測波長：230 nm；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：30 ℃。

2.3 質(zhì)譜條件

ESI離子源，采用正離子檢測模式；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣體積流量：8 L·min-1；霧化氣壓力：3.8×106Pa；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣體積流量：12 L·min-1；毛細(xì)管電壓：3500 V；錐孔電壓：100 V；掃描范圍m/z120～1200；二級裂解電壓20～45 eV。

3 結(jié)果與討論

從博落回莖提取物總離子流圖(見圖1)中選擇了30余個峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，最終推斷出11個生物堿結(jié)構(gòu)(見表1)，包括2個芐基異喹啉類生物堿(1，2)，2個四氫原小檗堿類生物堿(3，6)，2個N-甲基四氫原小檗堿(4，9)，1個原小檗堿類生物堿(5)，2個普羅托品類生物堿(7，8)，2個苯并菲啶類生物堿(10，11)，其中1～6以及9首次在博落回中報道。

注：木蘭箭毒堿(Magnocurarine，1)，網(wǎng)脈番荔枝堿(Reticuline，2)，金黃紫堇堿(Scoulerine，3)，輪環(huán)藤酚堿(Cyclanoline，4)，13-甲氧基小檗堿(13-methoxyberberine，5)四氫巴馬丁(Tetrahydropalmatine，6)，原阿片堿(Protopine，7)，別隱品堿(Cryptopine，8)，N-甲基氫化小檗堿(N-methylcanadine，9)，血根堿(Sanguinarine，10)，白屈菜紅堿(Chelerythrine，11)。圖1 博落回莖總離子流圖

表1 博落回莖中被鑒定的11個生物堿

3.1 芐基異喹啉類生物堿的解析

化合物1和2的質(zhì)譜圖在m/z230以下出現(xiàn)豐度較大的碎片離子，表明化合物母核發(fā)生了裂解，且這兩個化合物分別丟失[NH(CH3)2]+、[NH2CH3]+的碎片，形成m/z269和m/z299的碎片峰，這與芐基異喹啉類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律[16](①容易發(fā)生α裂解，形成m/z相對較小的碎片；②易失去(CH3)2NH或者CH3NH2，從而形成[M-45]+、[M-31]+的碎片峰)相符合。因此推斷化合1和2屬于芐基異喹啉類生物堿。化合物1的碎片離子m/z269發(fā)生α和β裂解分別產(chǎn)生m/z175和m/z107的碎片峰，m/z175繼續(xù)失去1分子CH3OH形成m/z143的子離子峰，推測碎片離子m/z175的結(jié)構(gòu)中存在一個相鄰的甲氧基和羥基，根據(jù)博落回中異喹啉生物堿的生源合成途徑將OH和OCH3分別定位在R5和R6位。

化合物2發(fā)生α裂解形成較高豐度的m/z192和m/z137碎片峰，而其碎片離子m/z299發(fā)生α裂解則生成m/z175產(chǎn)物離子。m/z175進(jìn)一步失去1分子CH3OH生成m/z143，表明該化合物中有相鄰的甲氧基和羥基存在，結(jié)合博落回中芐基異喹啉生物堿的生源合成途徑將OH和OCH3分別定位于R5和R6位。綜上所述，化合物1和2的結(jié)構(gòu)分別確定為木蘭箭毒堿和網(wǎng)脈番荔枝堿，這與文獻(xiàn)報道相符合[17-18]?；衔?和2的裂解方式見圖2。

圖2 化合物1和2的質(zhì)譜裂解途徑

3.2 普羅托品類生物堿的解析

化合物7和8在m/z230以下出現(xiàn)很多豐度較高的二級碎片，表明母核發(fā)生裂解。此外，都形成了[M-H2O]+的碎片，表明7和8都失去了1分子H2O。這與博落回中普羅托品類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律[16](①普羅脫品類生物堿不存在大π共軛系統(tǒng)，母核容易斷裂；②母核容易失去1分子H2O形成閉合四元環(huán))相符合，因此，推斷化合物7和8屬于普羅托品類生物堿?；衔?的碎片離子峰m/z336失去1分子CO和2個H形成m/z306的碎片峰，推測碎片離子m/z336的結(jié)構(gòu)中含有一個亞甲二氧基，根據(jù)博落回中異喹啉類生物堿的生源合成途徑將亞甲二氧基定位在R3和R4位；此外，化合物7直接發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾(RDA)裂解和α裂解形成m/z206、149、190和165等豐度很高的碎片離子峰，碎片離子m/z206進(jìn)一步失去1分子H2O或1個OH形成m/z188或m/z189的碎片峰。

化合物8的碎片離子峰m/z352失去1分子CH4形成m/z336的碎片峰，推測碎片離子m/z352的結(jié)構(gòu)中存在鄰二甲氧基，結(jié)合博落回中異喹啉類生物堿的生源合成途徑將鄰二甲氧基定位在R1和R2位。化合物8直接發(fā)生RDA和α裂解生成m/z206、m/z165、m/z190和m/z181的碎片離子峰，碎片離子峰m/z206進(jìn)一步失去1分子H2O或1個OH形成m/z188或m/z189的碎片峰，這與文獻(xiàn)報道一致[19]，因此，推測化合物7和8分別為原阿片堿和別隱品堿?；衔?和8的裂解方式如圖3。

圖3 化合物7和8的質(zhì)譜裂解途徑

3.3 N-甲基四氫原小檗堿類生物堿的解析

化合物4和9在m/z230以下存在豐度較高的碎片離子峰，表明母核發(fā)生裂解。此外，沒有[M-H2O]+、[M-NH(CH3)2]+、[M-NH2CH3]+等特征碎片離子峰出現(xiàn)，但都出現(xiàn)了[M-CH4]+的碎片離子峰，根據(jù)博落回中生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律[16]，推斷化合物4和9屬于N-甲基四氫原小檗堿。化合物4的碎片離子峰m/z192和m/z151是母核裂解的結(jié)果，碎片離子峰m/z192繼續(xù)失去了1個CH3形成m/z177；化合物4失去氮上的甲基及相鄰的氫形成更穩(wěn)定的碎片離子峰m/z326。

化合物9中，豐度較高的m/z190、m/z149是母核裂解形成的，而m/z338則是化合物9失去氮上的甲基及相鄰的氫形成雙鍵。綜上所述，化合物4和9分別確定為輪環(huán)藤酚堿、N-甲基氫化小檗堿[17，20]?；衔?和9的裂解方式如圖4。

3.4 四氫原小檗堿類生物堿的解析

化合物6的碎片離子峰m/z192和165是母核直接裂解的結(jié)果；碎片離子峰m/z340是化合物6失去1分子CH4形成的，推測化合物6的結(jié)構(gòu)中存在鄰二甲氧基，結(jié)合博落回中異喹啉類生物堿的生源合成途徑將鄰二甲氧基定位在R1和R2位。綜上所述，化合物3和6確定為金黃紫堇堿和四氫巴馬丁，這與文獻(xiàn)報道符合[20-21]?；衔?和6的裂解方式如圖5。

圖4 化合物4和9 的裂解途徑

圖5 化合物3和6 的裂解途徑

3.5 原小檗堿類生物堿的解析

化合物5的碎片離子峰都在m/z300以上，表明母核很穩(wěn)定，可能為苯并菲啶類生物堿或者原小檗堿類生物堿[16]。化合物5的裂解方式有兩種：分子離子失去1分子CH4，形成m/z350的碎片峰，推測化合物5中存在鄰二甲氧基，結(jié)合博落回中異喹啉類生物堿的生源合成途徑將鄰二甲氧基定位在R1和R2位。m/z350繼續(xù)失去1分子CO和2個H形成m/z320的碎片離子，推測碎片離子m/z350上存在亞甲二氧基，結(jié)合博落回中異喹啉類生物堿的生源合成途徑將亞甲二氧基定位在R3和R4位。另一方面，化合物5失去2個CH3形成m/z336的碎片離子，推測化合物5中存在鄰二甲氧基，碎片離子m/z336繼續(xù)失去1分子CO 形成m/z308的碎片峰，表明碎片離子m/z336中存在鄰二甲氧基。綜上所述，參考文獻(xiàn)[19]，化合物5確定為13-甲氧基小檗堿?；衔?的裂解方式如圖6。

圖6 化合物5的質(zhì)譜裂解途徑

3.6 苯并菲啶類生物堿的解析

化合物10和11的碎片離子峰都在m/z 230以上，只有一些小的碎片的丟失，故推斷其為苯并菲啶類生物堿[16]。化合物10中，m/z304 是分子離子失去1分子CO形成的，推測分子離子中存在亞基二氧基。m/z274是m/z304失去1分子CO和2個H，這表明碎片離子m/z304的結(jié)構(gòu)中存在一個亞基二氧基。m/z 317則是分子離子失去1個CH3的結(jié)果。

化合物11中，碎片離子峰m/z333、318是分子離子相繼失去2個CH3形成的，表明分子離子的結(jié)構(gòu)中存在鄰二甲氧基，結(jié)合博落回中異喹啉類生物堿的生源合成途徑，將鄰二甲氧基定位在R3和R4位。碎片離子m/z332則由m/z333失去1個H的結(jié)果；m/z332繼續(xù)失去1分子CO和2個H形成m/z302，這表明碎片離子m/z332的結(jié)構(gòu)中存在亞基二氧基，結(jié)合博落回中異喹啉類生物堿的生源合成途徑將亞甲二氧基定位在R1和R2位上；m/z 318則是m/z333丟失了1個CH3的結(jié)果。綜上所述，化合物10和11分別確定為血根堿和白屈菜紅堿[22]?；衔?0和11的裂解方式如圖7。

圖7 化合物10和11的質(zhì)譜裂解途經(jīng)

4 驗證實驗

本實驗所推斷的化合物數(shù)量較多，但是本實驗室沒有全部化合物的對照品，因此，選取了原阿片堿、別隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿4個生物堿對照品進(jìn)行驗證(見圖8)。結(jié)果表明，這4種生物堿分別與本次實驗中推斷的化合物7、8、10和11一致，這表明基于異喹啉類生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律推斷博落回中生物堿結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確、可行。

圖8 4種生物堿對照品的總離子流圖

5 總結(jié)與展望

目前，博落回藥用資源主要以果莢為主，而果莢的生物量比較少，莖占據(jù)了大部分的生物量，但是莖卻沒有被充分利用，這在一定程度上造成藥材資源的浪費。本實驗用HPLC-Q-TOF-MS/MS對博落回莖中的生物堿進(jìn)行分析，鑒定了博落回莖中六大類共計11個生物堿結(jié)構(gòu)，其中化合物1～6及9共7個生物堿成分在博落回中首次報道，這對于博落回中化學(xué)成分的挖掘具有一定意義，并且對博落回莖作為藥用資源的利用提供了依據(jù)。另外，本研究利用HPLC-Q-TOF-MS/MS結(jié)合博落回中異喹啉類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律，不但可以對已知化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷，同時，也可以對新化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步判定，這將對博落回中新化合物的分離提供指導(dǎo)。

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IdentificationofAlkaloidsinMacleayacordataStemsBasedonMassFragmentationRulesofIsoquinolineAlkaloids

YU Kun1，ZUOZi1，QINGZhixing1，YANGPeng1，ZENGJianguo1，2*

(1.Collegeofpharmacy，HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China；2.HunanAgriculturalUniversity，NationalandProvincialUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalmedicineresourcesandinitiative，Changsha410128，China)

Objective：To study alkaloids in stem ofMacleayacordata.Methods：The methanol extract ofM.cordatastem was analyzed with High Performance Liquid Chromatography-Quardrupole/Time of Flight-Mass spectrometry，alkaloids was identified by the molecular ions of mass spectrometry and the fragment ions of MS/MS spectrometry combined with mass fragmentation rules of isoquinoline alkaloids.Results：11 alkaloids were elucidated，which were magnocurarine(1)，reticuline(2)，scourlerine(3)，cyclanoline(4)，13-methoxyberberine(5)，tetrahydropalmatine(6)，protopine(7)，allocryptopine(8)，N-methylcanadine(9)，sanguinarine(10)，chelerythrine(11)，compounds1-6and9were reported inM.cordatafor the first time.Conclusion：The method to identify alkaloids inM.cordatastems based on mass fragmentation rules of isoquinoline alkaloids is feasible.

High Performance Liquid Chromatography-Quardrupole/Time of Flight-Mass spectromery；alkaloids；Macleayacordata

2015-10-27)

國家科技支撐計劃項目(2012BAI29B04)

*

曾建國，教授，研究方向：中藥資源與開發(fā)；Tel：(0731)84673824，E-mail：ginkgo@world-way.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.009