正交試驗法優(yōu)選復(fù)方白芍腸康顆粒提取工藝

陳鋒，嚴常開，張進

(1.湖北中醫(yī)藥大學 藥學院，湖北 武漢 430065；2.馬應(yīng)龍藥業(yè)集團股份有限公司，湖北 武漢 430064)

正交試驗法優(yōu)選復(fù)方白芍腸康顆粒提取工藝

陳鋒1，2，嚴常開2*，張進2

(1.湖北中醫(yī)藥大學 藥學院，湖北 武漢430065；2.馬應(yīng)龍藥業(yè)集團股份有限公司，湖北 武漢430064)

目的：優(yōu)選復(fù)方白芍腸康顆粒提取工藝。方法：以芍藥苷含量及干膏率為評價指標，通過正交試驗考察加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)對水提工藝的影響；以厚樸酚含量及干膏率為評價指標，通過正交試驗考察乙醇提取分數(shù)、乙醇用量、提取時間和提取次數(shù)對醇提工藝的影響。采用HPLC測定芍藥苷、厚樸酚的含量。結(jié)果：最佳水提工藝為10倍量水，提取2次，每次1.5h；芍藥苷提取量為24.28mg·g-1，干膏率為34.05%；最佳醇提工藝為8倍量60%乙醇，提取2次，每次1.5h；厚樸酚提取量為13.07mg·g-1，干膏率為19.71%。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，為復(fù)方白芍腸康顆粒的合理開發(fā)提供參考。

芍藥苷；厚樸酚；復(fù)方白芍腸康顆粒；潰瘍性結(jié)腸炎；正交試驗；提取工藝

白芍腸康湯為臨床經(jīng)驗方，由白芍、厚樸、吳茱萸、延胡索、甘草等11味藥組成，具有健脾益氣、清熱利濕、瀉火解毒、厚腸止瀉之功，主治潰瘍性結(jié)腸炎。近年來，在精神、飲食和環(huán)境等各種因素的影響下，潰瘍性結(jié)腸炎在我國的發(fā)病率明顯增加，該病發(fā)病機制尚未明確，其具有易癌變、遷延難愈等特點，現(xiàn)已成為影響現(xiàn)代人生活質(zhì)量的重要病癥。目前，尚無特效藥上市。白芍腸康湯自今已有二十多年的臨床應(yīng)用經(jīng)驗，療效確切、安全性高。但湯劑存在劑量大、攜帶不便等不足，本研究擬將其研制成顆粒劑，以提高患者服藥的依從性，便于服用、攜帶和貯存[1-3]。為保證復(fù)方白芍腸康顆粒中各有效成分充分溶出，根據(jù)各藥味的理化性質(zhì)及藥理作用[4-9]，確定方中白芍等藥味水提，厚樸等藥味醇提，采用正交試驗優(yōu)選提取工藝。

1 儀器與試藥

SPD-20A型高效液相色譜儀(日本島津)；StarsoriusBP211D、BS210S型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；KQ3200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

本實驗所用藥材均由安徽亳州提供，符合2010年版《中華人民共和國藥典》一部相關(guān)規(guī)定；芍藥苷、厚樸酚對照品(中國藥品檢定研究院，批號分別為110729-200412，110736-200628)；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1干膏率的測定

精密吸取濃縮液10mL，置已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃烘箱中干燥至恒重，精密稱重，計算干膏率。

2.2芍藥苷的含量側(cè)定

2.2.1色譜條件Ultimate?XB-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫程序依次為0～8minA∶B為19∶81；8～35minA∶B為50∶50；(35～36minA∶B為100∶0；36～45minA∶B為19∶81；流速為1.0mL·min-1；柱溫為25℃；檢測波長為230nm；進樣量為10μL，理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不低于2000。

2.2.2對照品溶液的制備 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為122.96μg·mL-1的芍藥苷溶液，搖勻備用。

2.2.3供試品溶液的制備 取水提濃縮液適量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱重，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4方法學考察 精密量取芍藥苷對照品溶液1、3、5、7、9mL至10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別按上述2.2.1色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程：Y=14663X-1174.1，r=0.9999，表明芍藥苷在12.30～110.67μg·mL-1線性關(guān)系良好。

精密度試驗測得芍藥苷峰面積值的RSD為1.8%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗測定芍藥苷含量的RSD為1.1%，表示本方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗顯示，24h內(nèi)供試品溶液中芍藥苷含量的RSD為0.9%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

取同一水提濃縮液6份適量，精密稱定，分別精密加入芍藥苷對照品1.9326mg，計算平均回收率為98.7%，RSD為0.9%。

2.3厚樸酚的含量測定

2.3.1色譜條件 填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠(150mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇-水(78∶22)；流速為1.0mL·min-1；柱溫為35℃；檢測波長為294nm；進樣量為10μL，理論板數(shù)按厚樸酚峰計算應(yīng)不低于3800。

2.3.2對照品溶液的制備 取厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為160.70μg·mL-1的厚樸酚溶液，搖勻，即得。

2.3.3供試品溶液的制備 取醇提濃縮液適量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱重，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4方法學考察 精密量取厚樸酚對照品溶液0.5、1.5、2.5、3.5、5、7.5mL至10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別按上述2.3.1色譜條件進行測定。以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得厚樸酚回歸方程：Y=16313X-19117，r=0.9993，表明厚樸酚在8.04～120.53μg·mL-1線性關(guān)系良好。

精密度試驗測得厚樸酚峰面積值的RSD為0.8%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗測定厚樸酚含量的RSD為0.9%，表示本方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗顯示，24h內(nèi)供試品溶液中厚樸酚含量的RSD為0.2%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

精密稱取同一醇提液6份，分別精密加入厚樸酚對照品0.4821mg，計算平均回收率為100.23%，RSD為0.8%。

2.5正交試驗優(yōu)選

2.5.1水提工藝 按1/4處方量稱取水提藥材各9份，每份合計282.75g，進行水回流提取，按L9(34)正交表進行試驗，得提取液，濃縮(藥材∶水提液=1∶3)，備用。選擇煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水量為考察因素，以芍藥苷提取量和干膏率為評價指標[10-11]，因素水平見表1，試驗安排及結(jié)果見表2，方差分析見表3～4。

表1 復(fù)方白芍腸康水提工藝正交試驗因素水平(n=3)

表2 復(fù)方白芍腸康水提工藝正交試驗分析(n=9)

表3 水提工藝芍藥苷含量方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00。

表4 水提工藝干膏率方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00。

由直觀分析表可知，各因素對芍藥苷提取、干膏率影響次序一致，均為C>A>B；每個因素三個水平之間的趨勢為A2>A3>A1，B2>B3>B1，C3>C2>C1，得提取工藝為A2B2C3。由方差分析結(jié)果表明，C因素對提取效果的影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而A和B因素差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。從大工業(yè)生產(chǎn)和節(jié)能降耗等全面綜合考察，最終確定最佳提取工藝為A2B2C2，即10倍量水，提取2次，每次1.5 h。

2.5.2 醇提工藝 在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，按1/4處方量稱取醇提藥材各9份，每份合計175.5 g，進行乙醇回流提取，按L9(34)正交表進行試驗，因素水平見表5，得提取液?；厥找掖?，濃縮(藥材∶醇提液=1∶3)，備用。選擇乙醇體積分數(shù)、提取次數(shù)、提取時間、乙醇用量為考察因素，以厚樸酚提取量和干膏率為評價指標[12-13]，結(jié)果見表6，方差分析見表7～8。

表5 復(fù)方白芍腸康醇提工藝正交試驗因素水平(n=3)

表6 復(fù)方白芍腸康水提工藝正交試驗分析(n=9)

表7 醇提工藝厚樸酚含量方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00。

表8 醇提工藝干膏率方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00。

由直觀分析表可知，各因素對厚樸酚提取量、干膏率的影響次序不同，厚樸酚提取量為D>C>B>A，最佳工藝為A1B2C2D3；干膏率為D>C>A>B，最佳工藝為A1B3C3D3；以A因素為誤差項對厚樸酚進行方差分析，結(jié)果表明，D因素對厚樸酚提取量影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，C因素差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而B因素差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以B因素為誤差項對干膏率進行方差分析，結(jié)果表明，D因素對干膏率影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，A、C因素差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。從大工業(yè)生產(chǎn)和節(jié)能降耗等全面綜合考察，最終確定最佳提取工藝為A1B2C2D2，即8倍量60%乙醇，提取2次，每次1.5 h。

2.6驗證試驗

按優(yōu)選的工藝條件制備3批樣品，進行驗證試驗，結(jié)果表明，芍藥苷質(zhì)量分數(shù)為24.28mg·g-1，RSD為0.90%，干膏率為34.05%，RSD為1.47%；厚樸酚質(zhì)量分數(shù)為13.07mg·g-1，RSD為1.91%，干膏率為19.71%，RSD為1.96%。與正交試驗結(jié)果吻合，證明最佳提取工藝合理、穩(wěn)定可行。

3 討論

本方由11味藥組成，劑型為顆粒劑，本文針對方中每位藥的主要有效成分，依據(jù)其性質(zhì)分別使用不同的溶劑進行提取。其中，白芍、厚樸為處方中的君藥。此外，據(jù)文獻報道[6-7]，厚樸酚與和厚樸酚是厚樸的主要藥效成分，而厚樸中厚樸酚對水浸應(yīng)激等所致潰瘍有抑制效果，并對組胺所致十二指腸痙攣有一定的抑制作用。白芍所含的芍藥苷是其主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、解痙、抗炎、抗?jié)兊人幚碜饔?。故選擇以厚樸酚、芍藥苷的含量及干膏率作為本工藝篩選的指標性成分。結(jié)果表明工藝穩(wěn)定可行，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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OptimizationofExtractionTechnologyforFufangBaishaochangkangGranulesbyOrthogonalDesign

CHENfeng1,2，YANChangkai2*，ZHANJin2

(1.CollegeofPharmacy,HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430065，China；2.MayinglongPharmaceuticalGroup,Wuhan430064，China)

Objective：To optimize extraction technology of Fufang Baishaochangkang Granules.Methods：Taking content of paeoniflorin and dry extract rate as evaluation index, orthogonal test was employed to investigate effects of the amount of water, extraction time and times on water extraction process.With contents of magnolol and dry extract rate as evaluation index, orthogonal test was adopted to optimize ethanol extraction process with ethanol concentration, ethanol amount, extraction time and times.Content of paeoniflorin and magnolol were determined by HPLC.Results：Optimum water extraction conditions were as follows: decocted twice with10times the volume of water1.5h per time.Extracting amount of paeoniflorin was24.28mg·g-1, dry extract rate was34.05%.Optimal alcohol extraction conditions were as follows: extracted twice with8times the amount of60% ethanol for1.5h each time; Extracting amount of magnolol was11.14mg·g-1, dry extract rate was19.71%.Conclusion：The optimized extraction process was stable and feasible which could provide a reference for rational development of Fufang Baishaochangkang Granules.

Paeoniflorin；magnolol；Fufang Baishaochangkang Granules；ulcerative colitis；orthogonal design；extraction process

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.024

2015-12-04)

*

嚴常開，主任藥師，研究方向：藥物新制劑、新劑型及新技術(shù)研究；E-mail:yanchangkai@sohu.com