NaCl脅迫下外源殼聚糖對(duì)菜用大豆光合作用及葉綠體活性氧代謝的影響

王　聰,楊恒山,董永義,馬玉露,賈俊英,包金花,鄭　毅

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼　028042)

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NaCl脅迫下外源殼聚糖對(duì)菜用大豆光合作用及葉綠體活性氧代謝的影響

王聰,楊恒山,董永義,馬玉露,賈俊英,包金花,鄭毅

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼028042)

外源殼聚糖;NaCl脅迫;光合作用;葉綠體活性氧代謝

鹽脅迫已成為引起植物產(chǎn)量和品質(zhì)下降的一種主要的非生物脅迫類型,提高植物的耐鹽性已成為當(dāng)前亟待解決的問題。殼聚糖(Chitosan,CTS) 是脫乙?；蟮玫降木郯被咸烟?是一種可再生、廉價(jià)、清潔的化學(xué)物質(zhì),而且是一種有效的非生物脅迫抗性誘導(dǎo)劑[1～5]。研究表明,外源殼聚糖可通過提高抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物質(zhì)的含量,有效阻止辣椒體內(nèi)丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)的積累,緩解水分脅迫對(duì)辣椒幼苗造成的膜脂過氧化,增強(qiáng)辣椒幼苗的抗旱性[3]。鹽脅迫下,殼聚糖通過提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性,降低MDA含量和電解質(zhì)滲出率,進(jìn)而促進(jìn)了豇豆幼苗的形態(tài)建成[5]。高溫脅迫下,外源殼聚糖顯著提高了蝴蝶蘭幼苗葉片SOD、POD及過氧化氫酶(CAT)活性和可溶性糖、葉綠素和類胡蘿卜素含量,顯著降低了質(zhì)膜透性及MDA含量,進(jìn)而提高了蝴蝶蘭幼苗的耐熱性[6]。

盡管就外源殼聚糖緩解逆境脅迫前人已做了大量研究,但殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆光合作用及葉綠體活性氧(ROS)代謝有何影響，是否可阻止/緩解鹽脅迫對(duì)其造成的傷害，尚未見報(bào)道。2013年通過預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源殼聚糖可延緩鹽脅迫對(duì)菜用大豆生長(zhǎng)的抑制作用,并篩選出了殼聚糖處理的適宜濃度為200 mg/L,在此基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)以苗期菜用大豆為研究對(duì)象,用殼聚糖溶液噴施幼苗葉片,探討NaCl脅迫下殼聚糖對(duì)菜用大豆光合作用及葉綠體活性氧代謝的影響,旨在探明外源殼聚糖調(diào)控菜用大豆光合作用的生理機(jī)制,以期為殼聚糖作為抗鹽劑的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1　材料和方法

1.1植物材料準(zhǔn)備

菜用大豆(Glycinemax(L.) Merr.)品種選用主栽品種理想高產(chǎn)95-1,試驗(yàn)于2014年4月6日在內(nèi)蒙古民族大學(xué)試驗(yàn)基地日光溫室內(nèi)進(jìn)行。干種子直播于上直徑25 cm、下直徑15 cm、高20 cm的塑料盆中,蛭石作基質(zhì),澆灌日本園試[7]營(yíng)養(yǎng)液,每盆定苗4株。真葉展開后每3 d澆1/4濃度日本園試營(yíng)養(yǎng)液1次,每盆澆液0.5 L。

1.2CTS誘導(dǎo)及NaCl處理

試驗(yàn)設(shè)如下處理:對(duì)照(CK):葉面噴灑清水,根部澆灌營(yíng)養(yǎng)液;處理1 (T1):葉面噴灑CTS溶液,根部澆灌營(yíng)養(yǎng)液;處理2 (T2):葉面噴灑清水,根部澆灌溶有NaCl的營(yíng)養(yǎng)液;處理3 (T3):葉面噴灑CTS溶液,根部澆灌溶有NaCl的營(yíng)養(yǎng)液。每處理10盆,3次重復(fù)。NaCl脅迫的適宜濃度為100 mmol/L[8];CTS處理的適宜濃度為200 mg/L。

2片真葉完全展開后,用手持小型噴霧器將CTS溶液均勻噴灑在幼苗葉片的正面和背面,以量足但不下滴為宜,對(duì)照和處理3噴灑清水。誘導(dǎo)處理5 d后進(jìn)行NaCl處理,NaCl溶于1/4濃度日本園試營(yíng)養(yǎng)液,均勻澆入處理2和處理3基質(zhì)中,每3 d澆液一次,澆液量同上。對(duì)照和處理1僅澆營(yíng)養(yǎng)液。

1.3測(cè)定項(xiàng)目及方法

NaCl處理0 d開始測(cè)定,以后每3 d測(cè)定一次,共測(cè)定6次。以第一片完全展開的三出復(fù)葉頂葉為測(cè)試對(duì)象。處理15 d(T2處理植株葉片出現(xiàn)明顯褪綠、黃化癥狀)后測(cè)幼苗干質(zhì)量。

光合參數(shù):用GFS-3000光合儀(德國(guó)WALZ公司生產(chǎn))于上午9:00-11:30測(cè)定。氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)及凈光合速率(Pn)由光合測(cè)定系統(tǒng)直接讀出。測(cè)定過程中光強(qiáng)約為800 μmol/(m2·s),大氣溫度為(25±2) ℃,大氣CO2濃度為(487±10) μmol/L。每次測(cè)定重復(fù)10次。

葉綠體制備:參照孫錦[9]的方法提取,在Takeda等[10]的基礎(chǔ)上略作改動(dòng)。10 g去葉脈的新鮮葉片加20 mL提取緩沖液(50 nmol/L、pH值6.1的MES,含0.33 mol/L山梨糖醇,10 mol/L NaCl,2 mol/L MgCl2,2 mol/L EDTA,0.5 mol/L KH2PO4,2 mol/L AsA-Na,AsA-Na使用前現(xiàn)配現(xiàn)加)快速研磨,使葉片碎成綠豆粒大小,4層紗布過濾,濾液3 300 r/min離心3 min,倒出上清液,沉淀用1 mL提取緩沖液漂洗表面懸浮物;然后用1 mL懸浮液(50 mmol/L、pH值7.6的HEPES,含0.33 mmol/L山梨糖醇,10 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2,2 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L KH2PO4,2 mmol/L AsA-Na,AsA-Na使用前現(xiàn)配現(xiàn)加)將沉淀懸浮。為保證葉綠體純度,用Percol試劑進(jìn)行梯度離心,完整率可達(dá)90%。

1.4數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆干質(zhì)量的影響

圖1顯示,NaCl脅迫15 d后,菜用大豆經(jīng)T1處理后的干質(zhì)量與對(duì)照無顯著差異;T2處理使其干質(zhì)量較對(duì)照顯著降低,降幅為28%,T3處理使其干質(zhì)量較T2的增幅達(dá)15%。表明NaCl脅迫顯著抑制了菜用大豆干質(zhì)量的增加,外源殼聚糖可緩解鹽脅迫對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用;無鹽條件下,外源殼聚糖對(duì)菜用大豆干質(zhì)量的誘導(dǎo)作用不顯著。

不同小寫字母表示差異顯著(P<5%)。圖2-10同。

2.2殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆光合作用的影響

2.2.1對(duì)凈光合速率(Pn)的影響由圖2可知,T1處理使第0,3天(噴施殼聚糖第5,8天)時(shí)的Pn顯著高于對(duì)照,增幅分別為18%，30%,之后未見顯著影響。T2條件下,第3天時(shí)的Pn與對(duì)照無顯著差異,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),Pn受到了顯著抑制,較對(duì)照的降幅分別達(dá)37%，45%，51%，52%;T3處理第3天時(shí)其Pn維持在T2水平,第6，9，12天時(shí)較T2顯著增高,增幅分別為30%，56%，24%,至15 d時(shí)誘導(dǎo)作用消失,Pn又回落至T2水平。表明在NaCl脅迫和無鹽條件下,外源殼聚糖對(duì)菜用大豆的Pn均產(chǎn)生了顯著誘導(dǎo)作用,但無鹽條件下僅在前期產(chǎn)生影響。上述試驗(yàn)結(jié)果也表明殼聚糖的作用具有時(shí)效性。

圖2　殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆凈光合速率(Pn)的影響

2.2.2對(duì)氣孔導(dǎo)度(Gs)的影響圖3顯示,T1處理在第0,3天時(shí)的Gs均較對(duì)照顯著增高;經(jīng)T2處理3 d后的Gs與對(duì)照無顯著差異,隨后均較對(duì)照顯著降低,降幅分別為14%,18%,28%,34%,T3處理并未對(duì)NaCl脅迫后的Gs產(chǎn)生顯著影響。表明NaCl脅迫顯著抑制了菜用大豆的Gs,但殼聚糖未對(duì)其產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。

圖3　殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆氣孔導(dǎo)度(Gs)的影響

2.2.3對(duì)胞間CO2濃度(Ci)的影響T1處理后,菜用大豆在第0,3天時(shí)的Ci顯著高于對(duì)照;經(jīng)T2處理后第6,15天時(shí)的Ci顯著高于對(duì)照,其余時(shí)期均維持在對(duì)照水平;與T2相比,T3處理第3,15天時(shí)的Ci無顯著變化,其余時(shí)期均顯著降低(圖4)。

圖4　殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆胞間CO2濃度(Ci)的影響

2.3殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體活性氧代謝的影響

圖5　殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆產(chǎn)生速率的影響

2.3.2H2O2含量圖6顯示,T1處理使0,3 d時(shí)的H2O2含量顯著低于對(duì)照。T2條件下,H2O2含量在脅迫6～15 d期間均顯著高于對(duì)照,T3處理使該期間的H2O2含量較T2顯著降低,降幅分別為13%,13%,11%,11%,但均顯著高于對(duì)照。表明外源殼聚糖可抑制NaCl脅迫下葉綠體H2O2的產(chǎn)生;無鹽條件下,殼聚糖可顯著降低菜用大豆前期的H2O2含量。

2.3.3SOD活性由圖7可看出,T1處理顯著提高了0 d時(shí)的SOD活性;T2處理致使整個(gè)脅迫期間的SOD活性顯著下降,降幅分別為36%,16%,21%,49%,18%,T3處理顯著提高了各期SOD活性,其中第6天時(shí)顯著高于對(duì)照,其余時(shí)期均維持在對(duì)照水平?？梢娡庠礆ぞ厶秋@著誘導(dǎo)了NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體SOD活性;無鹽條件下只對(duì)早期SOD活性產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。

2.3.4POD活性T1處理顯著提高了0,3 d時(shí)的POD活性;T2處理后,第3天時(shí)的活性未受顯著影響,隨后均較對(duì)照顯著下降,T3處理顯著提高了脅迫第6～15天期間的POD活性,其中第6,15天時(shí)達(dá)對(duì)照水平,第9,12天時(shí)顯著高于對(duì)照 (圖8)。

圖6　殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體H2O2含量的影響

圖7　殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體SOD活性的影響

圖8　殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體POD活性的影響

2.3.5APX活性APX可以AsA為電子供體直接清除H2O2。圖9顯示,T1條件下的APX活性在第0,3天時(shí)均顯著高于對(duì)照;T2處理導(dǎo)致第6～15天期間的APX活性均較對(duì)照顯著降低,T3處理使脅迫第6,9,12天時(shí)的活性較T2顯著提高,但均顯著低于對(duì)照。表明外源殼聚糖對(duì)脅迫中期的APX活性產(chǎn)生了顯著誘導(dǎo)作用。

圖9　殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體APX活性的影響

2.3.6GR活性GR催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原形成GSH,是AsA-GSH循環(huán)的關(guān)鍵酶。由圖10可看出,T1處理使第0,3天時(shí)的GR活性顯著升高;T2處理導(dǎo)致整個(gè)脅迫期間的活性均顯著降低;T3處理后GR活性的起伏較大,脅迫第3天時(shí)處于T2水平,之后大幅上升,第9天時(shí)達(dá)峰值,且第6,9天時(shí)的活性均顯著高于對(duì)照,之后又大幅下降,但第12,15天時(shí)的活性仍顯著高于T2?？梢姎ぞ厶秋@著誘導(dǎo)了NaCl脅迫中、后期的GR活性;無鹽條件下前期的GR活性受到顯著誘導(dǎo)。

圖10　殼聚糖對(duì)NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體GR活性的影響

3　結(jié)論與討論

3.1NaCl脅迫下外源殼聚糖與光合參數(shù)

NaCl脅迫可通過影響葉綠素的合成、分解,光合相關(guān)酶活性,水分吸收,氣孔CO2擴(kuò)散阻力等生理活動(dòng)以及光合器官結(jié)構(gòu)等,進(jìn)而直接或間接影響光合作用。植物Pn變化的原因可分為氣孔因素(主要是受氣孔導(dǎo)度的影響)和非氣孔因素(受葉肉細(xì)胞光合活性的影響)。一般地,Pn、Gs和Ci均下降,則Pn的下降主要由氣孔限制引起;Pn和Gs下降,Ci上升或無顯著變化,則Pn的下降主要由非氣孔限制引起[11～15]。而通過誘導(dǎo)氣孔因素或非氣孔因素則可能提高Pn,或阻止、緩解Pn的下降。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,NaCl脅迫下,菜用大豆在脅迫第6,15天時(shí)Pn、Gs顯著下降,Ci顯著升高;脅迫第9、12 d時(shí)Pn、Gs顯著下降,Ci無顯著變化,說明非氣孔限制是導(dǎo)致其Pn下降的主要原因。這與鹽脅迫條件下黑麥草[16]、玉米[17]等的結(jié)果相近。噴施殼聚糖后,菜用大豆在脅迫第6,9,12天時(shí)均表現(xiàn)為Pn較鹽處理顯著升高,Gs無顯著變化,Ci顯著下降,說明殼聚糖可通過誘導(dǎo)非氣孔因素顯著緩解Pn的下降;脅迫第3,15天時(shí)的Pn、Gs、Ci均與鹽處理無顯著差異,前者可能是由于脅迫早期菜用大豆的光合作用未受顯著影響,殼聚糖的誘導(dǎo)作用因此并未被激發(fā)所致,后者表明殼聚糖的作用具有時(shí)效性?？梢?NaCl脅迫下外源殼聚糖可通過誘導(dǎo)非氣孔因素來緩解菜用大豆Pn的下降,進(jìn)而緩解鹽脅迫對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用。

3.2NaCl脅迫下外源殼聚糖與葉綠體活性氧代謝

APX、GR是AsA-GSH循環(huán)的關(guān)鍵酶,其活性高低可直接影響AsA、GSH的氧化、還原速率,進(jìn)而影響AsA-GSH循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)速率及H2O2的清除效率。從本試驗(yàn)結(jié)果來看,外源殼聚糖使NaCl脅迫中期(6～12 d)的APX活性及脅迫中、后期(6～15 d)的GR活性顯著升高?？梢娊?jīng)外源殼聚糖誘導(dǎo),NaCl脅迫下AsA-GSH循環(huán)在清除葉綠體H2O2過程中發(fā)揮了積極作用。

3.3NaCl脅迫與無鹽條件下殼聚糖的誘導(dǎo)機(jī)制

試驗(yàn)結(jié)果表明,外源殼聚糖是通過激活甲殼素誘導(dǎo)受體激酶1(Chitin elicitor receptor kinase 1,CERK1)機(jī)理發(fā)揮作用的[20]。當(dāng)植物細(xì)胞感受到幾丁質(zhì)時(shí),細(xì)胞表面受體-CERK1通過其賴氨酸酸基(Lysine motif,LysM)直接與甲殼素結(jié)合(含胞外段),植物細(xì)胞膜上的CERK1通過胞外LysM結(jié)構(gòu)域二聚化來完成配體感應(yīng),使其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域磷酸化并激活下游防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)通路[21]?？梢?殼聚糖是通過直接作用于細(xì)胞膜系統(tǒng)來誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)的。NaCl脅迫下,植物體可通過Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、SOS信號(hào)傳導(dǎo)[22]、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)[23]等途徑傳導(dǎo)脅迫信號(hào),進(jìn)而誘導(dǎo)植物細(xì)胞發(fā)生一系列抗鹽生理反應(yīng)。外源殼聚糖在NaCl脅迫下也可能是通過直接作用于膜系統(tǒng)進(jìn)而誘導(dǎo)植物體抗鹽機(jī)制來發(fā)揮作用的。當(dāng)菜用大豆在逆境下受到脅迫傷害時(shí),外源殼聚糖可誘導(dǎo)其潛在的抗逆能力,調(diào)動(dòng)抗逆協(xié)調(diào)機(jī)制,以阻止傷害或降低其傷害程度。本試驗(yàn)中,無鹽條件下外源殼聚糖主要對(duì)菜用大豆前期光合作用及葉綠體活性氧代謝產(chǎn)生了顯著影響,與NaCl脅迫下的作用不同,可能是其啟動(dòng)了不同的應(yīng)答機(jī)制所致。

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Effects of Exogenous Chitosan on Photosynthesis and Chloroplast Reactive Oxygen Species Metabolism of Vegetable Soybean under NaCl Stress

WANG Cong,YANG Hengshan,DONG Yongyi,MA Yulu,JIA Junying,BAO Jinhua,ZHENG Yi

(College of Agronomy,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao028042,China)

Exogenous chitosan;NaCl stress;Photosynthesis;Chloroplast reactive oxygen species metabolism

2016-06-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260472;31260483)

王聰(1968-),男,內(nèi)蒙古通遼人,教授,博士，碩士生導(dǎo)師,主要從事蔬菜生理和生物技術(shù)研究。

S643.01

A

1000-7091(2016)04-0162-06

10.7668/hbnxb.2016.04.026