小麥×玉米雜交雙單倍體后代的HMW-GS組成和易位分析

龐建周,王雪征,茜曉哲,王晨陽,陳淑萍

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 旱作農(nóng)業(yè)研究所,河北省農(nóng)作物抗旱研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 衡水　053000)

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小麥×玉米雜交雙單倍體后代的HMW-GS組成和易位分析

龐建周,王雪征,茜曉哲,王晨陽,陳淑萍

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 旱作農(nóng)業(yè)研究所,河北省農(nóng)作物抗旱研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 衡水053000)

為了提高優(yōu)質(zhì)小麥的育種效率，在早代明確高分子量谷蛋白亞基和醇溶蛋白的組成，增加育種的針對(duì)性，以1個(gè)小麥雜交組合的296個(gè)DH株系群體為試材，采用半粒SDS-PAGE法檢測(cè)麥谷蛋白，且用A-PAGE檢測(cè)了醇溶蛋白。結(jié)果表明：母本衡09-6324的HMW-GS構(gòu)成為null、7+9、2+12，是有Sec-1特征帶的1BL/1RS易位系品種，父本師欒02-1亞基組成1、7+9、5+10，是非1BL/1RS易位系品種。296個(gè)DH株系共鑒定出6種不同的HMW-GS類型，均為父母本表達(dá)亞基類型的再分配，無變異類型。與面包加工品質(zhì)呈正相關(guān)的5+10亞基出現(xiàn)頻率為35.13%。DH株系材料中1BL/1RS易位系類型的占54.05%，1、5+10優(yōu)質(zhì)亞基同時(shí)出現(xiàn)，且沒有Sec-1表達(dá)的占15.20%，這些株系可作為新的面包小麥種質(zhì)資源使用。采用半粒SDS-PAGE和A-PAGE法對(duì)育種早代的優(yōu)異單株進(jìn)行有效鑒定和選擇，可以提高優(yōu)質(zhì)小麥育種效率。

小麥;玉米;雙單倍體;半粒電泳法;HMW-GS;黑麥堿

小麥和玉米雜交,利用玉米染色體消失誘導(dǎo)小麥雙單倍體(DH,Double haploid)材料是一種高效率的小麥育種途徑,縮短了育種年限,加快了育種進(jìn)程[1]。由小麥×玉米雜交產(chǎn)生的是純合的DH株系,因此DH群體可以穩(wěn)定繁殖、長(zhǎng)期使用,是一種永久性群體。DH材料的遺傳結(jié)構(gòu)能直接反映F1配子中基因的分離和重組,能在較短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建一個(gè)理想的遺傳作圖群體,因而能有效地進(jìn)行小麥遺傳圖譜的構(gòu)建、QTL的定位以及多基因聚合等研究[2]。

20世紀(jì)70年代國(guó)外Barclay就利用“遠(yuǎn)緣雜交法”使得父本染色體消失從而誘導(dǎo)小麥單倍體的相關(guān)報(bào)道[3]。80年代中后期以英國(guó)、德國(guó)、法國(guó)、加拿大、CIMMYT為代表的學(xué)者在利用小麥×玉米雜交法誘導(dǎo)小麥單倍體領(lǐng)域的進(jìn)展較快[4-6],應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)在法國(guó)、加拿大等已經(jīng)育成一批高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種[7]。我國(guó)單倍體育種起步較晚,中國(guó)農(nóng)科院從20世紀(jì)90年代初就開展了利用小麥和玉米(或摩擦禾)雜交誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生單倍體的研究,逐步完善了該技術(shù)過程,直到2011年才首次出現(xiàn)了應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)育成小麥品種中麥533的報(bào)道[8]。

常規(guī)育種中品質(zhì)性狀不能夠在田間通過性狀表達(dá)和產(chǎn)量篩選,應(yīng)用雙單倍體育種與常規(guī)育種相結(jié)合的方法以及生化及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù),實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)育種從傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)到高效的精準(zhǔn)育種的轉(zhuǎn)化,是快速培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)面包麥的有效途徑。目前,關(guān)于地方常規(guī)品種的HMW-GS和1BL/1RS易位的遺傳規(guī)律研究居多[9],但對(duì)于小麥×玉米雜交DH群體的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)將本地綜合性狀好的高產(chǎn)母本衡09-6324與強(qiáng)筋優(yōu)質(zhì)父本師欒02-1雜交,在F1授玉米粉誘導(dǎo)生成雙單倍體植株,通過生化標(biāo)記篩選含優(yōu)質(zhì)基因,但不表達(dá)黑麥堿(sec-1)的材料,作為小麥改良的新種質(zhì)資源。利用染色體消失法獲得的DH系在品種培育、材料創(chuàng)造、遺傳研究等方面都有著重要意義。

1　材料和方法

1.1供試材料

所用小麥母本為衡09-6324,是本地綜合性狀好的高產(chǎn)優(yōu)良品系,父本為師欒02-1,含1、5+10優(yōu)質(zhì)亞基,中國(guó)春為對(duì)照,均來自本單位小麥育種課題,玉米品種農(nóng)大958系市售品種。雜種F1授玉米粉誘導(dǎo)DH小麥單倍胚,經(jīng)0.75‰秋水仙素加倍處理后得到296個(gè)株系。雙單倍體生產(chǎn)試驗(yàn)在河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站溫室進(jìn)行,生化檢測(cè)試驗(yàn)在河北省農(nóng)作物抗旱研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)方法

麥谷蛋白的提取和SDS-PAGE電泳參考封德順[10]和趙慶瑋等[11]的方法。采用SDS不連續(xù)緩沖系統(tǒng),用北京六一公司的小型電泳槽進(jìn)行凝膠電泳分析,分離膠濃度為10.5%(pH值8.8),交聯(lián)度2.0%,濃縮膠濃度為3.7%(pH值6.8),交聯(lián)度2.7%,穩(wěn)壓電泳,直至溴酚蘭離開凝膠。

醇溶蛋白(Gliadin)的提取參考劉麗等[12]的方法,略有改動(dòng)。采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳法(A-PAGE)分析Gliadin,參考ISTA于1986年頒布的A-PAGE(pH值3.2,T=10%,C=3.5%)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行[13],檢測(cè)Sec-1特征譜帶,確定后代材料是否屬于1BL/1RS易位系。

2　結(jié)果與分析

2.1親本材料HMW-GS組成和1BL/1RS易位分析

衡09-6324是本單位小麥育種課題選育的抗旱、高產(chǎn)、早熟、抗病好的優(yōu)良品系,SDS-PAGE分析表明,HMW-GS構(gòu)成為null、7+9、2+12,A-PAGE分析表明有明顯的Sec-1特征帶,是典型的1BL/1RS易位系品種。師欒02-1是2007年國(guó)審的優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥,產(chǎn)量中等,亞基組成1、7+9、5+10,是非1BL/1RS易位系品種,其電泳譜帶的1、5+10屬優(yōu)質(zhì)亞基,尤其是5+10亞基是當(dāng)前世界公認(rèn)的最優(yōu)亞基[14],對(duì)小麥面粉烘烤品質(zhì)有著重要的影響。本試驗(yàn)是通過雙單倍體快速育種技術(shù)把優(yōu)質(zhì)的1和5+10亞基引入本地高產(chǎn)親本衡09-6324,同時(shí)在早代進(jìn)行生化標(biāo)記Sec-1的鑒定,淘汰表達(dá)Sec-1的易位株系,選擇的后代材料既繼承父本的優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋特性,又具有母本的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)。中國(guó)春(null、7+8、2+12,非1BL/1RS易位)為對(duì)照材料。2.2DH后代群體中HMW-GS的類型和頻率分布

以中國(guó)春和師欒02-1為對(duì)照,以衡09-6324/師欒02-1雜交F1種子為親本,通過小麥×玉米雜交的雙單倍體技術(shù),誘導(dǎo)得到的296個(gè)DH純合株系為試驗(yàn)材料,對(duì)籽粒的HMW-GS和Gliadin進(jìn)行鑒定分析,亞基命名和分類參照魏益民等[15]方法。籽粒麥谷蛋白的SDS-PAGE分析表明,對(duì)應(yīng)于小麥HMW-GS區(qū)域,所有DH籽粒都能檢測(cè)到3～6條帶,統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別列于表1。圖1為部分株系的HMW-GS組成類型。

由表1可以看出,296個(gè)株系在3個(gè)位點(diǎn)上共鑒定出6種不同的HMW-GS類型,均為父母本表達(dá)亞基類型的再分配,無變異類型。Glu-D1位點(diǎn)上與面包加工品質(zhì)呈正相關(guān)的5+10亞基出現(xiàn)頻率為35.13%(15.87+19.26,表1加下劃線部分),與2+12亞基出現(xiàn)頻率的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較,χ2分析P值為0.033 5,分離達(dá)到顯著水平。分析原因:1.可能是DH群體偏小;2.沒有進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn);3.胚誘導(dǎo)、加倍以及移栽過程中的死亡都可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差,有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

1、36.中國(guó)春;2、35.師欒02-1;3～34.F1(衡09-6324/02-1)誘導(dǎo)的部分DH株系。

表1　部分DH株系的HMW-GS及1BL/1RS易位的組成類型

2.3DH后代群體中1BL/1RS易位的頻率分布

以師欒02-1為對(duì)照,對(duì)DH株系的Gliadin進(jìn)行A-PAGE分析,圖2為部分株系Gliadin的類型,ω區(qū)Sec-1特征帶被看作是黑麥1RS染色體臂的標(biāo)記,是1BL/1RS易位的標(biāo)志[16]。表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),表達(dá)1和5+10亞基、且沒有Sec-1的類型占15.20%(5.07+10.14,表1斜體加粗部分),這是我們育種需要的。這些材料可作為優(yōu)質(zhì)面包小麥新品種或育種材料使用,是栽培小麥改良的新種質(zhì)資源。由圖2可以看出,ω區(qū)Sec-1是4條特征譜帶,而師欒02-1在此區(qū)域是3條不同的譜帶,而由衡09-6324/師欒02-1誘導(dǎo)的DH材料中卻出現(xiàn)了Sec-1特征譜帶減弱和消失的情況,經(jīng)重復(fù)驗(yàn)證,排除了試驗(yàn)錯(cuò)誤。分析可能是玉米染色體作用的結(jié)果,此結(jié)果能否在其他育種試驗(yàn)中也能出現(xiàn),以及玉米染色體在DH中是否完全消失,有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

1～35.衡09-6324/02-1誘導(dǎo)的部分DH材料;36.衡09-6324;37.師欒02-1。

3　討論

有關(guān)常規(guī)育種后代HMW-GS組成與1BL/1RS易位系的分離及組合規(guī)律研究較多[12,17-18],但利用染色體消失法選育DH過程中未見報(bào)道,本試驗(yàn)中盡管出現(xiàn)了5+10亞基的偏分離現(xiàn)象,在SDS-PAGE和A-PAGE電泳技術(shù)的協(xié)助下,也可選育出表達(dá)1和5+10亞基,不表達(dá)Sec-1的DH株系,這些可作為面包小麥新的種質(zhì)資源或育種材料使用。

Zhou等[16]認(rèn)為在選育強(qiáng)筋小麥品種時(shí),不宜采用1BL/1RS易位品種(系)作親本,基于本試驗(yàn)結(jié)果筆者認(rèn)為采用小麥×玉米雜交技術(shù)可以選用單一親本是1BL/1RS易位的材料,研究表明蛋白質(zhì)含量與產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)[12,14],一般優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種不高產(chǎn)。在DH生產(chǎn)過程中利用玉米染色體對(duì)Sec-1的抑制作用,通過生化標(biāo)記在早代淘汰表達(dá)Sec-1的材料,若有幸能保留易位系增產(chǎn)抗病的優(yōu)越性,使后代既繼承親本的強(qiáng)筋特點(diǎn),又具有產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì),這將進(jìn)一步加快我國(guó)優(yōu)質(zhì)小麥育種的進(jìn)程。在歐洲已經(jīng)產(chǎn)生了Disponent、Branka等大量具有較好烘烤品質(zhì)的易位系變種[7,19]。

國(guó)內(nèi)外大量研究及實(shí)際育種實(shí)踐表明,HMW-GS及1BL/1RS易位系是影響小麥烘烤品質(zhì)的2個(gè)重要因素[15,20-21],本試驗(yàn)對(duì)小麥×玉米雜交誘導(dǎo)的296個(gè)DH株系的HMW-GS和1BL/1RS易位情況進(jìn)行研究,出現(xiàn)一個(gè)值得關(guān)注的現(xiàn)象,母本衡09-6324是標(biāo)準(zhǔn)的易位系,有較好的高、低分子量谷蛋白亞基的遺傳背景,父本師欒02-1是非易位系,其ω區(qū)也有醇溶蛋白的表達(dá),但其雜交后代的DH株系卻出現(xiàn)了ω區(qū)無蛋白表達(dá)的情況,類似結(jié)果未見報(bào)道。筆者認(rèn)為此現(xiàn)象是DH誘導(dǎo)過程中玉米染色體作用的結(jié)果,雖然DH材料沒有出現(xiàn)玉米染色體[1,22],但并不能否認(rèn)雜交過程中玉米基因誘導(dǎo)DH的作用。本試驗(yàn)只是初步篩選了一個(gè)雜交組合,結(jié)果是否有普遍性值得進(jìn)一步研究證實(shí)。假如DH株系能有效抑制Sec-1的表達(dá),同時(shí)又能保留易位系的增產(chǎn)、抗病特性,那將為小麥品質(zhì)改良開辟一條新的途徑。

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Analysis of HMW-GS and Translocation Line in Progenies of Doubled Haploid from Wheat×Maize Cross

PANG Jianzhou,WANG Xuezheng,QIAN Xiaozhe,WANG Chenyang,CHEN Shuping

(Dry Land Farming Institute,Hebei Academy of Agriculture and Foresty Sciences,Key Lab of Crop Drought Tolerance Research of Hebei Province,Hengshui053000,China)

To improve the efficiency of high quality wheat breeding program,clarify the composition of HMW-GS and Gliadin in the early generation,296 lines from the wheat maize cross were analyzed useing SDS-PAGE method in this experiment,along with this Gliadin were analyzed useing A-PAGE method.A statistics showed that female parent Heng 09-6324 carried null,7+9,2+12 subunits,and were 1BL/1RS translocation lines with Sec-1 characteristic band.Male parent Shiluan 02-1 carried 1,7+9,5+10 subunits,and were non 1BL/1RS translocation.Six types of HMW-GS all originated from parents were identified from 296 DH lines.The frequency of subunits 5+10 which positively related to bread baking quality was 35.13%.A statistics showed that in the A-PAGE the type of translocation of the DH lines accounted for 54.05%,and the percent of lines with subunits 1 and 5+10,but non Sec-1 translocation were 15.20%,these lines could be used as new germplasm for quality breeding.The paper indicated that that the method of half-seed SDS-PAGE and A-PAGE which could be used to identify and select excellent plants in early generation breeding effectively.

Wheat;Maize;Doubled haploid;Half-seed electrophoresis;HMW-GS;Secalin

2016-03-26

河北省農(nóng)林科學(xué)院前期預(yù)備項(xiàng)目(A2015040301);河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所青年基金項(xiàng)目

龐建周(1983-),男,河北邯鄲人,助理研究員,碩士,主要從事小麥×玉米雜交雙單倍體育種研究。

S512.03;S513.03

A

1000-7091(2016)04-0126-04

10.7668/hbnxb.2016.04.021