枯草芽孢桿菌BSD-2的GFP標記及其在黃瓜上的定殖研究

郝慧娟,劉洪偉,尹淑麗,劉倩倩,張麗萍,宋水山

(1.河北工業(yè)大學 化工學院,天津　300130;2.河北省科學院 生物研究所,河北 石家莊　050081;3.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術研究中心,河北 石家莊　050081)

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枯草芽孢桿菌BSD-2的GFP標記及其在黃瓜上的定殖研究

郝慧娟1,2,3,劉洪偉2,3,尹淑麗2,3,劉倩倩2,3,張麗萍2,3,宋水山2,3

(1.河北工業(yè)大學 化工學院,天津300130;2.河北省科學院 生物研究所,河北 石家莊050081;3.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術研究中心,河北 石家莊050081)

為研究枯草芽孢桿菌BSD-2在黃瓜植株上的定殖情況,采用稍加改進的電擊轉化方法將含有GFP基因的pGFP4412質粒導入枯草芽孢桿菌BSD-2菌株中,并測定了其生長曲線、質粒遺傳穩(wěn)定性及其對枯萎病菌和灰霉病菌的抑制作用。結果表明,成功獲得具有綠色熒光的菌株BSD-2-GFP;標記菌株的生長趨勢與野生型菌株基本一致;在無選擇壓力條件下連續(xù)培養(yǎng)56 h,菌株BSD-2-GFP的遺傳穩(wěn)定性為86%;其對植物枯萎病菌和灰霉病菌具有很強的抑制作用,與野生型菌株相當。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),標記菌株處理24 h后即可在黃瓜根內(nèi)部發(fā)現(xiàn),5 d后可在葉脈發(fā)現(xiàn),且50 d后仍可在葉脈觀測到。結果表明,菌株BSD-2-GFP可以很好地在黃瓜體內(nèi)定殖,從而阻止病原菌的侵入。

枯草芽孢桿菌;綠色熒光蛋白;枯萎病;灰霉病;抑菌作用

由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病和由灰葡萄孢菌引起的灰霉病是危害農(nóng)作物尤其是設施蔬菜的兩大主要病害[1-7]。而常規(guī)化學防治由于使用大量的化學農(nóng)藥導致農(nóng)藥殘留嚴重超標,食品安全事件頻發(fā),嚴重危害著人們的生命健康和生存環(huán)境[8-9],植物病害生物防治是綠色、安全,實現(xiàn)農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要措施,而生防拮抗菌的應用是生物防治的重要途徑之一[10]。芽孢桿菌類能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(包括伊枯草菌素[11]、表面活性素和豐原素等脂肽[12],蛋白酶和幾丁質酶等降解真菌結構性聚合物[13],以及抗真菌揮發(fā)性物質),具有良好的拮抗活性,因此,成為在生物防治中使用最廣泛的一類細菌[14-16]。本試驗前期篩選獲得一株拮抗枯草芽孢桿菌BSD-2,該菌株有較寬的抑菌譜,對10種植物病菌有顯著的抑制作用[17],對其抗菌活性物質進行了較深入的研究[18-19],田間試驗結果表明其與其他菌株組成的復合制劑對花生等作物連作病害有較好的防治作用[20],具有良好的應用開發(fā)前景。為了進一步闡明枯草芽孢桿菌BSD-2在植物上的定殖、擴散和生存競爭能力,揭示其抗病作用機理,本試驗利用基因標記示蹤技術,通過電轉化的方法將帶有綠色熒光蛋白基因(GFP)的質粒轉到枯草芽孢桿菌BSD-2菌株中,通過連續(xù)稀釋培養(yǎng)和皿內(nèi)拮抗分別測定菌株的遺傳穩(wěn)定性和抑菌活性,利用熒光顯微鏡觀察其在黃瓜植株上的定殖情況,以期為實際應用提供理論指導依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗材料

BSD-2菌株系河北省科學院生物研究所微生物科室分離得到。病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。質粒pGFP4412由中國農(nóng)業(yè)大學王琦教授惠贈,帶有氨芐青霉素、新霉素(Neomycin sulphate,Neo)抗性基因和GFP基因。菌株BSD-2及DH5α的培養(yǎng)基為LB 培養(yǎng)基。新霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司。電轉化儀(新芝JY 2000-1B)為寧波新芝科器研究所產(chǎn)品。熒光顯微鏡(Leica DM4000B)為德國萊卡儀器公司產(chǎn)品。NB培養(yǎng)基:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉 5 g、葡萄糖10 g,pH值 7.0～7.2。

1.2BSD-2的電擊轉化及轉化子的驗證

質粒提取和感受態(tài)制備參考王培培等[21]的方法,電擊轉化過程如下:取100 μL感受態(tài)細胞,向其中加入1.4 μg質粒,輕輕混勻后轉移至電擊杯中,冰浴30 min后,進行電擊。電擊完畢后迅速加入預熱的復蘇培養(yǎng)基,輕輕混勻后轉移至1.5 mL離心管中,37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 h,然后取100 μL菌液涂布于含有新霉素的LB 平板培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)過夜。試驗重復3 次。

隨機挑選在新霉素平板上生長的菌落進行PCR驗證,PCR所用引物為GFP-1和GFP-2,PCR反應條件為95 ℃預變性4 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,32個循環(huán);72 ℃延伸反應7 min。電泳檢測PCR結果。

引物序列如下:

GFP-1:5′-GCCTCTAGAATGAGTAAAGGAGAAG AAC-3′;GFP-2:5′-GCCAAGCTTTTATTTGTATAGTT CAT C-3′。

1.3標記菌株BSD-2-GFP生長特性

1.3.1菌株BSD-2-GFP的生長曲線測定將BSD-2-GFP在含Neo的LB 平板上劃線培養(yǎng),挑取單菌落接種到含Neo的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。以4%接種量接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基,30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)。以原始菌株BSD-2為對照,同等條件下培養(yǎng),每隔2 h 測定菌液的OD600值,繪制原始菌株BSD-2和標記菌株BSD-2-GFP的生長曲線。每處理重復3次。

1.3.2菌株BSD-2-GFP遺傳穩(wěn)定性測定遺傳穩(wěn)定性測定參考田濤[22]的方法,進行連續(xù)稀釋培養(yǎng),每隔7 h取樣,以0.1%接種量接種到無抗生素LB 液體培養(yǎng)基中,重復直至56 h。然后分別涂布無抗生素LB平板和有抗生素的LB平板,每個處理重復3次,以抗性菌株所占百分比計算工程菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.4菌株BSD-2-GFP對枯萎病菌和灰霉病菌抑制作用

采用平板對峙法[23]對標記菌株和野生型菌株的抑菌效果進行檢測,所用病原指示菌為尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢菌。

1.5標記菌株BSD-2-GFP在黃瓜上的定殖初探

將黃瓜種子依次用75%酒精浸泡10 min、無菌水洗凈、1%次氯酸鈉浸泡5 min、無菌水清洗至包衣顏色褪去,之后放入墊有濾紙的無菌培養(yǎng)皿上,添加無菌水,26 ℃催芽。將發(fā)芽后(根長約1 cm)的種子放入花盆中(土壤和蛭石2∶1),待第3片真葉展開時在根表附近注入10 mL(1.42×109cfu/mL)BSD-2-GFP菌液,每隔1 d澆1次無菌水,澆灌時保持土壤濕潤但水不能從盆底流出。在澆灌后第1,3,5,7,9,11,20,30,40，50 d時用熒光顯微鏡觀察標記菌株在黃瓜根部、莖部、葉柄、主葉脈和次葉脈的定殖情況。

2　結果與分析

2.1陽性轉化子獲得及其熒光檢測

挑取在含有新霉素抗性平板上生長的菌株進行PCR驗證,瓊脂糖凝膠電泳(圖1),說明標記菌株為陽性轉化子。標記后的菌株菌落為圓形(圖2),與原始菌株無差異(圖3)。在萊卡熒光顯微鏡下觀察可看出菌體為綠色(圖4),說明質粒在BSD-2菌株中得到高效表達。

1.核酸標準分子量;2～9.GFP的PCR產(chǎn)物。

圖2　GFP標記后的BSD-2菌株

圖3　野生型BSD-2菌株

圖4　攜帶GFP質粒的BSD-2菌株在熒光顯微鏡下的熒光表現(xiàn)

2.2標記菌株BSD-2-GFP生長特性

2.2.1菌株BSD-2-GFP的生長曲線試驗結果見圖5。2個菌株的生長變化趨勢大體一致,野生型菌株和標記型菌株幾乎同時進入對數(shù)期。而標記型菌株在延遲期停留時間較長,野生型菌株指數(shù)生長期開始于培養(yǎng)后12 h,而標記型菌株指數(shù)生長期開始于培養(yǎng)后13 h,比野生型菌株滯后了1 h。

圖5　BSD-2和標記菌株BSD-2-GFP的生長曲線

2.2.2標記菌株BSD-2-GFP遺傳穩(wěn)定性試驗結果表明:在沒有選擇壓力的情況下,隨著轉接次數(shù)的增加,標記菌株的穩(wěn)定性有降低的趨勢。在連續(xù)稀釋培養(yǎng)56 h后的質粒穩(wěn)定性為86%,說明GFP在BSD-2菌株中有較好的遺傳穩(wěn)定性。芽孢桿菌在營養(yǎng)豐富的實驗室條件下分裂1代大約需要20～30 min,而在自然條件下繁殖1代需要50～100 h,所以認為標記菌株BSD-2-GFP遺傳穩(wěn)定性可以滿足后續(xù)試驗需求(圖6)。

圖6　標記菌株的遺傳穩(wěn)定性

2.3標記菌株BSD-2-GFP對枯萎病菌和灰霉病菌的抑菌作用

對峙培養(yǎng)試驗見圖7,對尖孢鐮刀菌的抑制作用見圖7-A,標記后菌株BSD-2-GFP與野生型BSD-2菌株的抑菌圈平均直徑分別為2.8,2.7 cm。對灰葡萄孢菌的抑制作用見圖7-B,兩者的抑菌帶平均直徑分別為4.5,4.3 cm,對2種病原菌都無明顯差異。以上結果表明,BSD-2菌株經(jīng)過GFP標記后其對尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢菌的抑菌效果并未受到較大影響。

A.BSD-2和BSD-2-GFP對枯萎病菌的抑制作用;B.BSD-2和BSD-2-GFP對灰霉病菌的抑制作用。

2.4標記菌株BSD-2-GFP在黃瓜上定殖情況

標記菌株BSD-2-GFP在黃瓜上的定殖結果表明,灌根24 h時在熒光顯微鏡下可以看到有微量菌株定殖,第3天時在莖部可以檢測到標記菌株的定殖,到達葉脈時需要5 d時間。在處理11 d時可以看到大量綠色菌體定殖根部(圖8-A),形成一層綠色的保護膜,防止病原菌侵入,處理13 d時大量綠色菌體定殖在莖部(圖8-B),15 d時葉柄部有大量聚集(圖8-C),同時在19 d時可以看到主葉脈(圖8-D)和次葉脈(圖8-E)中有大量綠色菌體。在第50天時仍能在黃瓜葉脈中觀測到綠色菌體(圖8-F)。說明標記菌株在黃瓜體內(nèi)有一定定殖能力,并且可以隨著植物體內(nèi)養(yǎng)分的運輸而遷移到莖稈和葉片中。

A.根部;B.莖部;C.葉柄部;D.主葉脈部;E.次葉脈部;F.次葉脈部。

3　討論

本試驗成功地對枯草芽孢桿菌BSD-2進行了GFP標記,標記菌株具有較高的遺傳穩(wěn)定性。標記菌株的獲得為深入研究BSD-2的抗病作用機制奠定了基礎。GFP 因其對細胞功能無影響、體內(nèi)易表達、化學性質穩(wěn)定等優(yōu)點[24-27],常常被作為標記物廣泛應用到分子生物學和細胞生物學研究當中[28-29]。已有多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌被GFP標記[30-32],并用于定殖研究。但一般來說,GFP在菌體內(nèi)的高效表達會賦予轉化菌株額外的代謝負擔,可能影響其生理代謝活動和生物學功能。本試驗中,標記菌株與原始菌株BSD-2的生長特性、拮抗活性無明顯差異,說明GFP蛋白表達并未對生防菌BSD-2的生理代謝和生防功能產(chǎn)生明顯的影響。

不同來源的GFP穿梭質粒在菌體內(nèi)的熒光強度和穩(wěn)定性不同,而同一來源的GFP在不同菌體內(nèi)的遺傳穩(wěn)定性也不盡相同。本試驗獲得的GFP標記菌株其質粒遺傳穩(wěn)定性為86%,不及范曉靜等[24](93%)和田濤[22](92%)的穩(wěn)定性高,可能與BSD-2的生長特性、培養(yǎng)條件等有關,如何增加其穩(wěn)定性有待進一步探討。同時對于在遺傳穩(wěn)定性試驗中遇到的在抗性平板上能生長即抗性基因沒丟失的前提下,不能發(fā)出熒光的原因也有待進一步研究。

拮抗菌株具有較寬的抑菌譜是衡量其具有生防價值的指標之一。本試驗中標記菌株對枯萎病和灰霉病有較好的抑制作用,同樣為枯草芽孢桿菌對枯萎病的抑制作用好于田兆豐等[33]研究的菌株對枯萎病的抑制作用。標記菌株攜帶的GFP基因能在熒光顯微鏡下被觀察到,所以通過定殖試驗可以直觀的監(jiān)測其定殖部位。任嘉紅和黃其玲等[34-35]只研究了標記菌株在根部的定殖情況,本試驗通過熒光顯微鏡在黃瓜的根、莖和葉部觀察到了有綠色菌體成功定殖。此外,本試驗中標記菌株在根部定殖數(shù)量最多時是接菌后11 d，比蔣曉玲等[36]研究的菌株提前了1 d。與魏春燕等[37]研究結果相同的是標記菌株可以由根部向上遷移到葉片,并且穩(wěn)定繁殖。一些病原菌主要從植物的根部、細胞之間的縫隙、初生根和次生根的分叉處侵入植株,標記菌株優(yōu)先占據(jù)這些有利的生態(tài)位,暗示著生防拮抗菌可以改善局部微環(huán)境,阻止病原菌侵入,防止病害發(fā)生[38-39]。

致謝:感謝中國農(nóng)業(yè)大學王琦教授惠贈pGFP4412質粒。

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GFP-Marking and Colonization on Cucumber of Bacillus subtilis BSD-2

HAO Huijuan1,2,3,LIU Hongwei2,3,YIN Shuli2,3,LIU Qianqian2,3,ZHANG Liping2,3,SONG Shuishan2,3

(1.College of Chemical Industry,Hebei University of Technology,Tianjin300130,China;2.Biology Institute,Hebei Academy of Sciences,Shijiazhuang050081,China;3.Hebei Engineering and Technology Center of Microbiological Control on Main Crop Disease,Shijiazhuang050081,China)

For the purpose of exploring the colonization on the cucumber,theBacillussubtilisBSD-2 had remarkable control effect on theBotrytiscinerea.In this study,the plasmid of pGFP4412 that contains green fluorescent protein gene(GFP) was transformed into theBacillussubtilisBSD-2 by modified electroporation.The plasmid stability,growth curve and the inhibition activity of GFP-labeled strains were measured.The results showed that the GFP-tagged strain could emit green fluorescence successfully.The tagged strain nearly had the same trend with the wild type strain in growth.The stability of GFP-marked in engineeringB.subtilisBSD-2 strain was 86% after transference of culture 56 hours continuously without selective pressure.Inhibition activity showed that the GFP-marked strain exhibited the comparable ability as the wild type strain to inhibitFusariumoxysporumandBotrytiscinerea.Observation by fluorescence microscope indicated that the GFP-tagged BSD-2 could colonize on the root tissue after inoculated 24 hours.It could be seen on the leaf veins after five days.It still could be observed on the leaf veins after 50 days.All of these data indicated that the GFP-marked strain could colonize on the cucumber so properly that stopped pathogens to invade the plant.

Bacillussubtilis;GFP;Fusariumoxysporum;Botrytiscinerea;Inhibitory activity

2016-06-11

河北省重點基礎研究項目(13966503D);河北省省級省?？萍己献鏖_發(fā)資金支持項目(Y-15);河北省科學院重點項目(2015302)

郝慧娟(1989-),女,河北石家莊人,在讀碩士,主要從事代謝工程與分子生物學研究。

張麗萍(1969-),女,河北張家口人,研究員,碩士,主要從事農(nóng)業(yè)微生物研究。

Q78;S436.421

A

1000-7091(2016)04-0106-06

10.7668/hbnxb.2016.04.018