濕潤(rùn)燒傷膏對(duì)糖尿病性潰瘍大鼠創(chuàng)面組織晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體表達(dá)的影響研究

李杰輝，王 麗，張春霞，狄鉀騏，李 輝

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濕潤(rùn)燒傷膏對(duì)糖尿病性潰瘍大鼠創(chuàng)面組織晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體表達(dá)的影響研究

李杰輝，王 麗，張春霞，狄鉀騏，李 輝

目的探討濕潤(rùn)燒傷膏(MEBO)干預(yù)糖尿病性潰瘍創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。方法于2015年6月選取145只12周齡的SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白組(35只)和糖尿病模型組(110只)，糖尿病模型組采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制備糖尿病大鼠模型，8周后選取空白組30只及糖尿病模型組成模大鼠90只，糖尿病模型組成模大鼠再采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、MEBO組及貝復(fù)濟(jì)組，每組30只，4組均制備潰瘍模型。成功后MEBO組予MEBO紗條、貝復(fù)濟(jì)組予重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子外用溶液浸透紗條、空白組及模型組予0.9%氯化鈉溶液紗條局部換藥處理，1次/d。分別于創(chuàng)面干預(yù)后第3、6、12天，每次隨機(jī)選取10只大鼠，觀察創(chuàng)面愈合速率；取相同位點(diǎn)創(chuàng)面組織，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、核因子κB(NF-κB)水平，熒光PCR技術(shù)檢測(cè)AGE受體(RAGE)mRNA表達(dá)水平，HE染色觀察創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞及血管生成情況。結(jié)果造模8周后，糖尿病模型組體質(zhì)量低于空白組，血糖水平高于空白組(P<0.01)。空白組、模型組、MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組第3、6、12天創(chuàng)面愈合速率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中模型組、MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面愈合速率低于空白組，MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面愈合速率高于模型組；第6、12天時(shí)，貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面愈合速率低于MEBO組(P<0.05)?？瞻捉M、模型組、MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組第3、6、12天創(chuàng)面組織AGEs水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中模型組、MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織AGEs水平高于空白組，MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織AGEs水平低于模型組(P<0.05)?？瞻捉M、模型組、MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組第3、6、12天創(chuàng)面組織NF-κB水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中第6、12天時(shí)，模型組創(chuàng)面組織NF-κB水平高于空白組，MEBO組創(chuàng)面組織NF-κB水平低于模型組；第12天時(shí)，貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織NF-κB水平高于空白組、低于模型組(P<0.05)?？瞻捉M、模型組、MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組第3、6、12天創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中第6、12天時(shí)，模型組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平高于空白組，MEBO組創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)。病理結(jié)果顯示：干預(yù)后第12天，與模型組比較，MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組能明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞及新生毛細(xì)血管生長(zhǎng)，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中MEBO組更為明顯。結(jié)論MEBO能明顯促進(jìn)糖尿病性潰瘍創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能與調(diào)控創(chuàng)面組織AGEs、NF-κB及RAGE mRNA的表達(dá)有關(guān)。

糖尿病；潰瘍；濕潤(rùn)燒傷膏；晚期糖基化終末產(chǎn)物；NF-κB

李杰輝，王麗，張春霞，等.濕潤(rùn)燒傷膏對(duì)糖尿病性潰瘍大鼠創(chuàng)面組織晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體表達(dá)的影響研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(26)：3153-3159.[www.chinagp.net]

LI J H，WANG L，ZHANG C X，et al.Effect of MEBO on advanced glycosylation end products and their receptors in wound tissue of rats with diabetic skin ulcer[J].Chinese General Practice，2016，19(26)：3153-3159.

糖尿病創(chuàng)面愈合是炎性細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子等多因素共同參與并高度協(xié)調(diào)、相互調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程[1]，任一環(huán)節(jié)的異常均可導(dǎo)致創(chuàng)面難愈合，其中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)異常蓄積所致皮膚“隱性損害”與糖尿病創(chuàng)面難以愈合機(jī)制密切相關(guān)。濕潤(rùn)燒傷膏(MEBO)是皮膚再生醫(yī)療技術(shù)(MEBT/MEBO)的核心藥物，目前廣泛應(yīng)用于各種皮膚潰瘍創(chuàng)面的修復(fù)，尤其是慢性潰瘍創(chuàng)面[2-3]，本研究通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型，并在此基礎(chǔ)上制備糖尿病性潰瘍模型，觀察MEBO對(duì)創(chuàng)面組織AGEs、核因子κB(NF-κB)水平，及對(duì)AGE受體(RAGE)mRNA水平及病理結(jié)構(gòu)的影響，探討MEBO干預(yù)糖尿病性潰瘍創(chuàng)面愈合的相關(guān)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠145只，12周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量(220±30)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK桂2009-0002。大鼠飼養(yǎng)于20～25 ℃、相對(duì)濕度為(60±10)%環(huán)境中，單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品與試劑MEBO(汕頭市美寶制藥有限公司)，STZ(美國(guó)Sigma公司)，重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子外用溶液(貝復(fù)濟(jì)，珠海億勝生物制藥有限公司)，低精蛋白鋅胰島素注射液(江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司)，Trizol(Invitrogen公司)，PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)，Power SYBR? Green PCR Master Mix(ABI公司)，大鼠AGEs、NF-κB p65酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(NeoBiolab公司)。引物設(shè)計(jì)及合成由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司完成。引物序列如下：RAGE上游引物：5′-GGAATTGTCGATGAGGGGAC-3′，下游引物：5′-CAACAGCTGAATGCCCTCTG-3′；β-actin上游引物：5′-TCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′，下游引物：5′-AAAGCCATGCCAAATGTCTC-3′。

1.3儀器美迪信血糖儀及配套血糖試紙(天津億朋醫(yī)療器械股份有限公司)，3900臺(tái)式高通量DNA合成儀(ABI公司)，9700 PCR儀(ABI公司)，7500全自動(dòng)熒光PCR儀(ABI公司)，Multiskan Go全波長(zhǎng)全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)，HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，F(xiàn)SH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)(金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.4方法

1.4.1模型制備2015年6月，糖尿病大鼠模型：SD大鼠給予65 mg/kg STZ(枸櫞酸鈉緩沖液溶解)腹腔注射，注射體積1 ml/kg，在注射前和注射后每周采用電子秤稱量大鼠體質(zhì)量，采用剪尾法應(yīng)用美迪信血糖儀檢測(cè)隨機(jī)血糖水平，如果造模前血糖<8.9 mmol/L，造模后血糖≥16.7 mmol/L，體質(zhì)量明顯下降并且經(jīng)病理證實(shí)胰島細(xì)胞被破壞者，視為糖尿病模型誘導(dǎo)成功[4]。潰瘍模型：將大鼠麻醉后，背部剃毛，呈腹臥位固定于固定板上，用直徑為18 mm的圓形圖章在距肩胛骨下緣水平線下2 cm處脊柱正中皮膚上印出標(biāo)記，碘伏消毒，用組織剪按照標(biāo)記線剪去全層皮膚(深至筋膜)，制備圓形皮膚缺損創(chuàng)面[5]。

1.4.2分組及干預(yù)方法采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為空白組(35只)和糖尿病模型組(110只)，糖尿病大鼠模型誘導(dǎo)8周后，選成模大鼠90只，再采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、MEBO組及貝復(fù)濟(jì)組，每組30只，并選空白組大鼠30只制備潰瘍創(chuàng)面模型。各組創(chuàng)面制備成功后即開(kāi)始創(chuàng)面干預(yù)治療，將B型粘貼傷口敷料(5 cm×8 cm)粘貼大鼠背部，通過(guò)裁切暴露傷口。治療前予0.01%呋喃西林液處理創(chuàng)面，MEBO組創(chuàng)面外敷兩層MEBO紗條(0.2 g/cm2)，貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面外敷兩層重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子外用溶液浸透紗條(60 U/cm2)，空白組與模型組創(chuàng)面局部外敷兩層0.9%氯化鈉溶液紗條，各組均按照創(chuàng)面大小剪成小塊貼于創(chuàng)面上，再加蓋兩層消毒干紗布，換藥后膠布固定，換藥1次/d，不做其他干預(yù)措施。各組大鼠單籠飼養(yǎng)，自由飲水和喂食，隔日更換墊料。

1.4.3標(biāo)本采集各組大鼠分別于創(chuàng)面干預(yù)后第3、6、12天，每次隨機(jī)取10只大鼠觀察創(chuàng)面的大體情況，并計(jì)算創(chuàng)面愈合率，麻醉后取相同位點(diǎn)創(chuàng)面組織，一部分勻漿進(jìn)行ELISA檢測(cè)，一部分以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片備病理檢測(cè)，另一部分將其放置在液氮中保存?zhèn)錈晒釶CR檢測(cè)。

1.4.4指標(biāo)檢測(cè)

1.4.4.1創(chuàng)面愈合速率采用透明膜標(biāo)記法，以創(chuàng)傷后即刻測(cè)量的創(chuàng)面面積為創(chuàng)傷面積，以各時(shí)間點(diǎn)取材時(shí)測(cè)量的面積為時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積，愈合面積=創(chuàng)傷面積-時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面面積；創(chuàng)面愈合速率=(愈合面積/創(chuàng)傷面積)×100%。

1.4.4.2創(chuàng)面組織AGEs、NF-κB水平測(cè)定取部分創(chuàng)面組織在冰水中漂洗后，拭干稱重，剪碎，按1∶9 0.9%氯化鈉溶液體積，制備10%組織勻漿，采用3 000 r/min離心10 min，離心半徑15 cm，取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)采用定量免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)AGEs、NF-κB水平：試驗(yàn)前將10 μl平衡液加入100 μl樣本中，將處理后的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品按每孔100 μl依次加入后，再每孔加入50 μl酶聯(lián)親和物，充分混勻，覆膜37 ℃孵育1 h后，用預(yù)先稀釋好的洗液300 μl洗板，反復(fù)清洗5次并扣干孔內(nèi)剩余液體，每孔按照次序分別加入50 μl底物A和B，避光室溫孵化15 min，加50 μl終止液終止反應(yīng)。立即應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm下讀取OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AGEs、NF-κB水平。

1.4.4.3創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)測(cè)定取液氮凍存的組織加入Trizol 1 ml，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。5 μg RNA變性處理后，在10 μl反轉(zhuǎn)錄體系〔5×Prime Script Ⅱ Buffer 4 μl、RNase Inhibitor(40 U/μl)0.5 μl、Prime Script Ⅱ RTase(200 U/μl)1 μl、RNase free dH2O 4.5 μl〕經(jīng)30 ℃ 10 min、50 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min擴(kuò)增合成cDNA，將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：2×Power SYBR? Green PCR Master Mix 12.5 μl，上游引物(10 pmol/μl)0.5 μl，下游引物(10 pmol/μl)0.5 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性15 min，然后94 ℃變性15 s，55 ℃退火延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，分析Ct值，采用2-ΔΔCt法分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4.4創(chuàng)面組織病理觀察取10%甲醛溶液固定皮膚組織，常規(guī)組織脫水，石蠟包埋，4 μm切片，脫蠟，HE染色，脫水透明封固，顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞及血管生成情況。

2　結(jié)果

2.1體質(zhì)量和血糖水平造模前，空白組和糖尿病模型組體質(zhì)量、血糖水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后，糖尿病模型組體質(zhì)量低于空白組，血糖水平高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。

2.2創(chuàng)面愈合速率空白組、模型組、MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組第3、6、12天創(chuàng)面愈合速率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中第3天時(shí)，模型組、MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面愈合速率低于空白組，MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面愈合速率高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第6、12天時(shí)，模型組、MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面愈合速率低于空白組，MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面愈合速率高于模型組，貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面愈合速率低于MEBO組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表1　兩組大鼠體質(zhì)量和血糖水平比較±s)

表2　4組大鼠造模后不同時(shí)間創(chuàng)面愈合速率比較±s，%)

注：MEBO=濕潤(rùn)燒傷膏；與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與MEBO組比較，cP<0.05

2.3創(chuàng)面組織AGEs水平空白組、模型組、MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組第3、6、12天創(chuàng)面組織AGEs水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中模型組、MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織AGEs水平高于空白組，MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織AGEs水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

表3　4組大鼠造模后不同時(shí)間創(chuàng)面組織AGEs水平比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.4創(chuàng)面組織NF-κB水平空白組、模型組、MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組第3、6、12天創(chuàng)面組織NF-κB水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中第3天時(shí)，模型組創(chuàng)面組織NF-κB水平低于空白組，MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織NF-κB水平高于空白組和模型組；第6天時(shí)，模型組創(chuàng)面組織NF-κB水平高于空白組，MEBO組創(chuàng)面組織NF-κB水平低于模型組；第12天時(shí)，模型組創(chuàng)面組織NF-κB水平高于空白組，MEBO組創(chuàng)面組織NF-κB水平低于模型組，貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織NF-κB水平高于空白組、低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表4)。

表4　各組大鼠造模后不同時(shí)間創(chuàng)面組織NF-κB水平比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.5創(chuàng)面組織RAGE mRNA的表達(dá)空白組、模型組、MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組第3、6、12天創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中第3天時(shí)，模型組創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平高于空白組，MEBO組創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平低于模型組，貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平高于空白組、MEBO組，低于模型組；第6天時(shí)，模型組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平高于空白組，MEBO組創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平低于模型組；第12天時(shí)，模型組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平高于空白組，MEBO組創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表5)。

2.6創(chuàng)面組織病理觀察HE染色鏡下顯示：造模后第3天，各組創(chuàng)面組織均可見(jiàn)出血壞死，有肉芽組織生長(zhǎng)，空白組可見(jiàn)較多成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管生成，伴有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組次之；模型組新生血管生成數(shù)量及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較少。造模后第6天，空白組創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)旺盛，可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量減少；模型組創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)較緩，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和部分新生毛細(xì)血管增生；與模型組比較，MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)較快，伴有不同程度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，新生毛細(xì)血管更加豐富，其中MEBO組更為明顯。造模后第12天，空白組創(chuàng)面肉芽組織逐漸向瘢痕組織轉(zhuǎn)化，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管數(shù)量減少，膠原纖維增多；模型組創(chuàng)面仍處在肉芽組織生長(zhǎng)期，可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和新生毛細(xì)血管增生；與模型組比較，MEBO組創(chuàng)面肉芽組織較少，部分向瘢痕組織轉(zhuǎn)化，可見(jiàn)膠原纖維，有較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；貝復(fù)濟(jì)組介于兩者之間(見(jiàn)圖1，本文彩圖詳見(jiàn)本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

表5　4組大鼠造模后不同時(shí)間創(chuàng)面組織RAGE mRNA表達(dá)水平比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與MEBO組比較，cP<0.05

3　討論

糖尿病是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)WHO數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，全球已有糖尿病患者1.85億左右，預(yù)測(cè)到2025年全世界糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到3.33億[6]。糖尿病患者皮膚易受損傷，損傷后常伴有創(chuàng)面血管發(fā)生遲滯、神經(jīng)病變以及感染，易形成慢性難愈合創(chuàng)面，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此，糖尿病創(chuàng)面的治療是目前創(chuàng)面研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

糖尿病創(chuàng)面愈合是一個(gè)炎性細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞及細(xì)胞因子等多因素共同參與、相互調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，其中細(xì)胞增殖(包括血管生成及成纖維細(xì)胞增生)是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵。目前重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(貝復(fù)濟(jì))廣泛應(yīng)用于臨床治療潰瘍創(chuàng)面，該藥可刺激創(chuàng)面組織分泌堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞及新生毛細(xì)血管形成，促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，加快上皮細(xì)胞爬行，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[7]，故本研究選用貝復(fù)濟(jì)為對(duì)照藥物。研究表明MEBO可顯著提高創(chuàng)面肉芽組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子mRNA的表達(dá)，促進(jìn)創(chuàng)面成纖維細(xì)胞的分裂增殖及新生毛細(xì)血管的增殖，加速創(chuàng)面愈合[8-9]。本研究結(jié)果亦顯示，MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組均可促進(jìn)創(chuàng)面愈合，且愈合后期MEBO組創(chuàng)面愈合速率高于貝復(fù)濟(jì)組，提示MEBO能較快促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

注：MEBO=濕潤(rùn)燒傷膏

圖1大鼠造模后不同時(shí)間創(chuàng)面組織病理圖(HE染色，×100)

Figure 1Pathological figure of wound tissue at different time points

現(xiàn)代研究表明糖尿病患者的皮膚組織存在“隱性損害”，即在未損傷狀態(tài)下已存在組織細(xì)胞學(xué)的改變，這種改變是內(nèi)源性的，雖不造成皮膚破損或斷裂等可見(jiàn)損害，但會(huì)使皮膚易損性增加[10-11]。這種“隱性損害”主要由局部皮膚組織的高糖環(huán)境及AGEs的蓄積所致，因此AGEs的產(chǎn)生和蓄積是糖尿病皮膚創(chuàng)面修復(fù)“失控”的本質(zhì)。故本研究對(duì)MEBO干預(yù)糖尿病性潰瘍創(chuàng)面組織中AGEs的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了研究。

受體途徑是AGEs作用的主要途徑，RAGE是目前已知研究最多、較為深入的AGEs受體，很多細(xì)胞的表面如內(nèi)皮細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等均有RAGE的表達(dá)[12-13]。在糖尿病狀態(tài)下，循環(huán)及內(nèi)皮下基質(zhì)中AGEs不斷增多，內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上特異受體RAGE的表達(dá)亦增強(qiáng)，AGEs與RAGE結(jié)合，啟動(dòng)一系列受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[14]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病性潰瘍大鼠模型第3、6、12天創(chuàng)面組織中AGEs水平及RAGE mRNA表達(dá)水平均較空白組明顯升高；與模型組比較，MEBO組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織中AGEs水平及RAGE mRNA表達(dá)水平降低，提示MEBO能夠通過(guò)干預(yù)AGEs-RAGE信號(hào)上游基因表達(dá)影響創(chuàng)面愈合。

AGEs-RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有多個(gè)作用位點(diǎn)，其中NF-κB是一種重要的效應(yīng)分子。AGEs與RAGE結(jié)合后，可引起氧化應(yīng)激[15-16]，并通過(guò)激活p38 ras蛋白及MAP途徑激活NF-κB[17-19]。NF-κB是一種多效炎性核轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫調(diào)控和炎性細(xì)胞增殖等多種生理、病理過(guò)程[20-21]。NF-κB的活化可以刺激眾多靶基因表達(dá)，如TF、p21 Ras、ERK1/2及RAGE本身的表達(dá)。這些基因的激活可以使白介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)等炎性因子、生長(zhǎng)因子及黏附分子等分泌增加，從而觸發(fā)瀑布式炎性反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，引起持續(xù)的細(xì)胞功能損傷和紊亂，影響糖尿病創(chuàng)面愈合。本研究結(jié)果顯示，糖尿病性潰瘍大鼠模型干預(yù)第3天時(shí)創(chuàng)面組織中NF-κB水平尚低，病理顯示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較少，在干預(yù)第6天和第12天時(shí)創(chuàng)面組織中NF-κB水平持續(xù)升高，病理顯示大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示創(chuàng)面炎癥呈過(guò)激狀態(tài)。與模型組比較，MEBO組第3天創(chuàng)面組織中NF-κB水平升高，第6、12天時(shí)均明顯下降，病理顯示其能明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞及新生毛細(xì)血管生長(zhǎng)，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示MEBO能通過(guò)調(diào)控AGEs-RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中NF-κB表達(dá)水平影響創(chuàng)面愈合。

綜上所述，MEBO能明顯促進(jìn)糖尿病性潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合，顯著降低創(chuàng)面組織AGEs、RAGE mRNA表達(dá)水平，調(diào)控NF-κB表達(dá)水平，改善創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示其促進(jìn)糖尿病性潰瘍創(chuàng)面愈合的機(jī)制可能與調(diào)控創(chuàng)面組織AGEs-RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游相關(guān)炎性因子、生長(zhǎng)因子及黏附分子的影響，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究明確。

作者貢獻(xiàn)：李杰輝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；王麗、張春霞、狄鉀騏、李輝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、資料整理、數(shù)據(jù)處理。

本文無(wú)利益沖突。

[1]付小兵.糖尿病足及其相關(guān)慢性難愈合創(chuàng)面的處理[M].2版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2013：3.

[2]唐乾利，黃欣，王宇，等.濕潤(rùn)暴露療法/濕潤(rùn)燒傷膏治療慢性難愈合創(chuàng)面的超微病理及絲裂原活化蛋白激酶激酶和c-myc mRNA表達(dá)的機(jī)制研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(3)：294-299.

TANG Q L，HUANG X，WANG Y，et al.Ultrastructural pathology and the mechanism ot expression ot MAPKK mRNA & c - myc mRNA ot chronic retractory wound treated by MEBT/MEBO[J].Chinese General Practice，2015，18(3)：294-299.

[3]TANG Q L，HAN S S，F(xiàn)ENG J，et al.Moist exposed burn ointment promotes cutaneous excisional wound healing in rats involving VEGF and bFGF[J].Mol Med Rep，2014，9(4)：1277-1282.

[4]陸樹(shù)良，青春，謝挺，等.糖尿病皮膚“隱性損害”的機(jī)制研究[J].中華創(chuàng)傷雜志，2004，20(8)：468-473.

LU S L，QING C，XIE T，et al.Research on olfactory mechanism of the cutaneous "underlying disorder" in diabetic rats[J].Chinese Journal of Trauma，2004，20(8)：468-473.

[5]趙就禹，付小兵，雷永紅，等.大鼠小面積全層皮膚缺損創(chuàng)面模型的制備[J].感染、炎癥、修復(fù)，2008，9(1)：62-64.

[6]吳菁，谷衛(wèi).糖尿病診治新進(jìn)展——解讀美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)《2010版糖尿病診療指南》[J].中華全科醫(yī)師雜志，2010，9(10)：668-671.

[7]商振球，桂志紅，王華富，等.重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子治療壓瘡的臨床療效系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)藥物與臨床，2013，13(12)：1593-1595.

[8]唐乾利，韓珊珊，付軍，等.MEBT/MEBO對(duì)皮膚創(chuàng)面愈合過(guò)程中VEGF、bFGF、EGF mRNA表達(dá)影響的研究[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，34(5)：597-601.

TANG Q L，HAN S S，F(xiàn)U J，et al.The effect of MEBT/MEBO on the expression of VEGF,bFGF and EGF mRNAs during skin wound healing[J].Journal of Youjiang Medical University for Nationalities，2012，34(5)：597-601.

[9]唐乾利，郭璐，王權(quán)勝，等.MEBT/MEBO對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)燒傷創(chuàng)瘍雜志，2010，22(4)：252-257.

TANG Q L，GUO L，WANG Q S，et al.Experimental study of effect of MEBT/MEBO on rough endoplasmic reticulum of vascular endothelial cell[J].The Chinese Journal of Burns Wounds & Surface Ulcers，2010，22(4)：252-257.

[10]陸樹(shù)良.解讀創(chuàng)面修復(fù)“失控”本質(zhì)，拓寬創(chuàng)面愈合研究視野[J].創(chuàng)傷外科雜志，2007，9(4)：289-292.

LU S L.Nature of wound healing with controllable disorder[J].Journal of Traumatic Surgery，2007，9(4)：289-292.

[11]陸樹(shù)良，謝挺，牛軼雯，等.糖尿病合并創(chuàng)面難愈的機(jī)制研究[J].藥品評(píng)價(jià)，2011，8(7)： 17-21.

LU S L，XIE T，NIU Y W，et al.Mechanism research of diabetic wound hard to be cured[J].Drug Evaluation，2011，8(7)： 17-21.

[12]陳賓，牛軼雯，謝挺，等.糖尿病大鼠皮膚組織糖代謝紊亂與皮膚神經(jīng)病變相關(guān)性研究[J].中華燒傷雜志，2011，27(2)：139-144.

CHEN B，NIU Y W，XIE T，et al.Relationship between cutaneous glycometabolic disorders and cutaneous neuropathy in diabetic rats[J].Chinese Journal of Burns，2011，27(2)：139-144.

[13]呂翠，劉洪娟，劉曉麗，等.晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及其抑制劑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(4)：452-456.

LYU C，LIU H J，LIU X L，et al.The research progress on RAGE and RAGE inhibitor[J].Chinese Pharmacological Bulletin，2013，29(4)：452-456.

[14]FARMER D G，KENNEDY S.RAGE，vascular tone and vascular disease[J].Pharmacol Ther，2009，124(2)：185-194.

[15]牛軼雯，繆明遠(yuǎn)，董煒，等.晚期糖基化終末產(chǎn)物與其受體對(duì)糖尿病創(chuàng)面氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響[J].中華燒傷雜志，2012，28(1)：32-35.

NIU Y W，MIAO M Y，DONG W，et al.Effects of advanced glycation end products and its receptor on oxidative stress in diabetic wounds[J].Chinese Journal of Burns，2012，28(1)：32-35.

[16]劉繼松.氧化應(yīng)激和糖尿病創(chuàng)面的延遲愈合[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，35(7)：756-757.

[17]CLIFTON D R，RYDKINA E，F(xiàn)REEMAN R S，et al.NF-κB activation during infection of endothelial cells involves the activation of catalytic IκB kinases IKKα and IKKβ and phosphorylation-proteolysis of the inhibitor protein IκBα[J].Infect Immun，2005，73 (1)：155-165.

[18]吳起,王甲漢,劉亮，等.p38絲裂原活化蛋白激酶和核因子-κB促進(jìn)創(chuàng)面血管化的機(jī)制探討[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版),2015,36(2):131-135.

WU Q，WANG J H，LIU L，et al.Study of the mechanisms of p38 MAPK and NF-κB in promoting angiogenesis in scald wounds[J].Journal of Jinan University(Natural Science & Medicine Edition),2015,36(2):131-135.

[19]李亞清,嚴(yán)建平,許武林,等.核因子-κB和p38絲裂原活化蛋白激酶調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞白細(xì)胞介素8的表達(dá)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2011,27(2):182-186.

LI Y Q,YAN J P,XU W L,et al.Induction of interleukin-8 by lipopolysaccharide in human airway epithelial cells via NF-κB and p38 mitogen-activated protein kinase[J].Chinese Pharmacological Bulletin,2011,27(2):182-186.

[20]李利,方強(qiáng).核因子-κB的結(jié)構(gòu)和功能研究及與全身炎癥反應(yīng)綜合征的關(guān)系[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)),2005,26(11):792-794.

LI L,FANG Q.Structure and function of nuclear factor-kappa B and its relation to SIRS[J].Foreign Medical Sciences(Clinical Biochemistry and Laboratory Medicine),2005,26(11):792-794.

[21]朱妮.核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及其抑制劑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，24(7)：869-872.

ZHU N.Progress in research on NF-κB and its inhibitor[J].Chinese Journal of Biologicals，2011，24(7)：869-872.

(本文編輯：賈萌萌)

Effect of MEBO on Advanced Glycosylation End Products and Their Receptors in Wound Tissue of Rats with Diabetic Skin Ulcer

LIJie-hui，WANGLi，ZHANGChun-xia，DIJia-qi，LIHui.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530023，China

Correspondingauthor：LIJie-hui，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530023，China；E-mail：182209537@qq.com

ObjectiveTo explore the mechanism of MEBO in the treatment of diabetic skin ulcer.MethodsA total of 145 healthy male SD rats(aged 12 weeks old)in a SPF grade were randomly assigned to blank group(35 rats)and diabetic model group(110 rats)by random number table method in July 2015.Diabetic model was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin，8 weeks later，30 rats in blank group were selected，and 90 successful diabetic rat models were equally divided into diabetic model group，MEBO group and BFGF group with 30 rats in each group，the ulcer models were induced.Rats in MEBO group were treated with MEBO gauze，rats in BFGF group were treated with BFGF gauze，rats in blank group and model group were treated with 0.9% sodium chloride injection gauze，the dressing of each case was changed once a day.At the 3rd，6th and 12th day after intervention，10 rats of each group were selected randomly to investigate wound healing rate.The wound tissue of the same site was obtained for test，levels of AGEs and NF-κB were measured by ELISA，the expression level of RAGE mRNA was measured by fluorescent PCR，and the inflammatory cells，fibroblast and new capillary were observed by HE staining.Results8 weeks after models were established，the body mass of rats in diabetic model group was significantly lower than that in blank group，the blood glucose level of rats in diabetic model group was significantly higher than that in blank group(P<0.01).At the 3rd，6th and 12th day after intervention，there was significant difference in wound recovery rate among blank group，model group，MEBO group and BFGF group(P<0.01)；the wound recovery rate of model group，MEBO group and BFGF group was lower than that of bland group respectively，and the wound recovery rate of MEBO group and BFGF group was higher than that of model group respectively；at the 6th and 12th day after intervention，the wound recovery rate of BFGF group was lower than that of MEBO group(P<0.05).At the 3rd，6th and 12th day after intervention，there was significant difference in AGEs level among blank group，model group，MEBO group and BFGF group(P<0.01).AGEs level of model group，MEBO group and BFGF group was higher than that of blank group respectively，while AGEs level of MEBO group and BFGF group was lower than that of model group(P<0.05).At the 3rd，6th and 12th day after intervention，there was significant difference in level of NF-κB among blank group，model group，MEBO group and BFGF group(P<0.05)；at the 6th and 12th day after intervention，level of NF-κB of model group was higher than that of blank group and MEBO group respectively；at the 12th day after intervention，level of NF-κB of BFGF group was higher than that of blank group and was lower than that of model group respectively(P<0.05).At the 3rd，6th and 12th day after intervention，there was significant difference in expression level of RAGE mRNA among bland group，model group，MEBO group and BFGF group(P<0.05).At the 6th and 12th day after intervention，the expression level of RAGE mRNA of model group and BFGF group was higher than that of blank group respectively，and expression level of RAGE mRNA of MEBO group was lower than that of model group(P<0.05).Pathological results showed that，at the 12th day after intervention,compared with model group，faster growth of the fibroblast and new capillary and less infiltration of inflammatory cells were found in MEBO group and BFGF group，especially among MEBO group.ConclusionMEBO could obviously promote the healing of diabetic skin ulcer by regulating the expression of AGEs，NF-κB and RAGE mRNA in wound tissue.

Diabetes mellitus；Ulcer；MEBO；AGEs；NF-kappa B

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302975)

530023廣西南寧市，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(李杰輝，張春霞，狄鉀騏，李輝)；廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院(王麗)

李杰輝，530023廣西南寧市，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；E-mail：182209537@qq.com

R 632.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.26.006

2016-03-29；

2016-07-15)