基于響應(yīng)面分析法的腎氣丸組方優(yōu)化研究

汪玉梅，高潔，李政木，張旭倩，陳南迪，陳功成，張玉敏，江淑霞

廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006

◆實(shí)驗(yàn)研究◆

基于響應(yīng)面分析法的腎氣丸組方優(yōu)化研究

汪玉梅，高潔，李政木，張旭倩，陳南迪，陳功成，張玉敏，江淑霞

廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006

目的：優(yōu)化腎氣丸組方的最佳劑量配比，為臨床有效地運(yùn)用腎氣丸防治疾病提供可靠依據(jù)。方法：將昆明種小鼠隨機(jī)分為19組，每組10只。按響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，其中17組為中藥組，其余2組為空白組及模型組。小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除空白組小鼠外，其余組小鼠均每天腹腔注射氫化可的松注射液25 mg/（kg·d）制造腎陽(yáng)虛小鼠模型，連續(xù)10 d。同時(shí)中藥組灌胃給予腎氣丸中藥水煎液，空白組、模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥20 d。觀察各組小鼠腎陽(yáng)虛臨床癥狀變化情況，以及血清中促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)醇（COR）的含量變化。結(jié)果：模型組與各中藥治療組比較，自主活動(dòng)明顯減少，畏寒顯著，多尿癥狀明顯，且血清ACTH和COR含量顯著低下。通過(guò)優(yōu)化并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，小鼠腎氣丸最佳使用劑量為肉桂、附子各0.15 g，干地黃0.56 g，山藥、山茱萸各0.28 g，牡丹皮、澤瀉、茯苓各0.42 g。結(jié)論：腎氣丸原方劑量相對(duì)偏低，若將腎氣丸組方中肉桂、附子、牡丹皮、澤瀉、茯苓劑量增加1倍，干地黃、山藥、山茱萸保持不變，即腎氣丸中各藥物配伍比例調(diào)整為：附子∶肉桂∶干地黃∶山藥∶山茱萸∶牡丹皮∶澤瀉∶茯苓為2∶2∶8∶4∶4∶6∶6∶6，其對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能低下的調(diào)節(jié)作用更加顯著，溫補(bǔ)腎陽(yáng)作用最佳。

腎氣丸；響應(yīng)面分析法；組方優(yōu)化；腎陽(yáng)虛模型；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；小鼠

金匱腎氣丸源于東漢醫(yī)家張仲景所著《金匱要略》一書(shū)，其原名為“崔氏八味丸”“八味腎氣丸”“腎氣丸”，現(xiàn)多直接稱(chēng)為“腎氣丸”。原方由“干地黃（八兩），山茱萸（四兩），薯蕷（四兩），澤瀉（三兩），茯苓（三兩），牡丹皮（三兩），桂枝（一兩），附子（炮，一兩）”八味藥物組成，功在溫補(bǔ)腎陽(yáng)，化生腎氣，主治腎陽(yáng)氣不足證?？虑僭u(píng)論該方曰：“腎氣丸納桂、附于滋陰劑中十倍之一，意不在補(bǔ)火，而在微微生火，即生腎氣也，故不曰溫腎，而名腎氣?！钡笫涝谑褂媚I氣丸治療腎陽(yáng)不足所致的各類(lèi)疾病時(shí)，對(duì)原方藥物及其劑量多有變更，尤其是加大原方藥物劑量。本實(shí)驗(yàn)首先建立腎陽(yáng)虛小鼠模型，然后給予腎氣丸藥物不同配比劑量灌胃治療，以小鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)醇（COR）含量變化為觀察指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法開(kāi)展腎氣丸組方優(yōu)化研究，尋找腎氣丸組方的最佳配比劑量，為臨床更有效地運(yùn)用腎氣丸提供可靠依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠190只，合格證編號(hào)：4405900021；許可證號(hào)：scxk（粵）2008-0020，雄性，體重20±2 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材腎氣丸組方中藥材（購(gòu)買(mǎi)于廣東省中醫(yī)院，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張丹雁教授鑒定為正品）；氯化鈉注射液（廣東大冢制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H44020185）；氫化可的松注射液（天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020887）。

1.3 主要試劑小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）ELISA試劑盒（美國(guó)RB Rapidbio公司）；小鼠皮質(zhì)醇（COR）ELISA試劑盒（美國(guó)RB Rapidbio公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)器材AEG-220電子分析天平（日本島津儀器有限公司）；日立CR22G低溫高速離心機(jī)；PerkinElmer X5多功能免疫分析儀（美國(guó)PE公司）；Biotek Elx50洗板機(jī)（美國(guó)Biotek公司）；DT5-3低速臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京時(shí)代北利公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)按響應(yīng)面分析因素及水平表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。選擇（肉桂+附子）X、（干地黃+山藥+山茱萸）X和（牡丹皮+12澤瀉+茯苓）X三個(gè)因素為自變量，以低劑量（－1）、中劑量3（0）、高劑量（1）為三個(gè)水平，以小鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和皮質(zhì)醇（COR）含量為響應(yīng)值（Y），根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

2.2 動(dòng)物處理將小鼠隨機(jī)分為19組，每組10只。按響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，其中17組為中藥組，另外2組為空白組及模型組。小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除空白組小鼠外，其余組小鼠均每天腹腔注射氫化可的松注射液25 mg/（kg.d）制造腎陽(yáng)虛小鼠模型［1］，連續(xù)10 d。同時(shí)中藥組灌胃（藥量按動(dòng)物和人的劑量估換公式法折算［2］）給予中藥水煎液，空白組、模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥20 d。按照響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表，精密稱(chēng)取腎氣丸相應(yīng)劑量，水煎，并濃縮，于4℃冰箱保存。于給藥后的第21天上午8時(shí)，摘除小鼠眼球，取血0.3 mL，置離心管內(nèi)靜置1 h，離心10 min，轉(zhuǎn)速4000 r/min，取上層血清，存于-20℃冰箱待測(cè)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Design Expert V.8.0.5b統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 觀測(cè)指標(biāo)

3.1 腎陽(yáng)虛臨床指標(biāo)體重下降、體溫下降、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、畏寒、體毛枯疏、失去光澤、采食量及飲水量減少、多尿等癥狀［3］。

3.2 血清指標(biāo)檢測(cè)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)醇（COR）的含量，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 一般狀況與空白組比較，模型組及各中藥組在予氫化可的松注射液腹腔注射5天后，均開(kāi)始出現(xiàn)精神萎頓、活動(dòng)減少、弓背蜷縮、畏寒、體毛枯疏、失去光澤、多尿等癥狀。與各中藥治療組比較，模型組自主活動(dòng)明顯減少，畏寒顯著，多尿癥狀明顯?？瞻捉M小鼠體重增加幅度明顯高于模型組及各中藥組，各組小鼠治療前后體重變化見(jiàn)表2。

4.2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表1中響應(yīng)面分析因素及水平表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4.3 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析用Design Expert統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ACTH模型分析結(jié)果見(jiàn)表4，COR模型分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

表2 各組小組治療前后體重變化

表3 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 ACTH多種模型方差分析結(jié)果

表5 COR多種模型方差分析結(jié)果

通過(guò)模型分析，建立ACTH的多元二次響應(yīng)面回歸模型，得擬合方程：

其中，Y是效應(yīng)值促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）含量，X1、X2和X3為自變量，即（肉桂+附子）X1、（干地黃+山藥+山茱萸）X2和（牡丹皮+澤瀉+茯苓）X3。各因素與指標(biāo)之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。以上述擬合的數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)，描繪了等高線圖和自變量對(duì)因變量的三維響應(yīng)面圖。分別將其中一個(gè)因素固定在中心值，以促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）含量對(duì)另外兩個(gè)因素描繪三維圖，見(jiàn)圖1-6。

圖1 y=f（X1，X2）的等高線圖（X3=0）

圖2 y=f（X1，X2）的響應(yīng)面圖（X3=0）

圖3 y=f（X1，X3）的等高線圖（X2=0）

圖4 y=f（X1，X3）的響應(yīng)面圖（X2=0）

圖5 y=f（X2，X3）的等高線圖（X1=0）

圖6 y=f（X2，X3）的響應(yīng)面圖（X1=0）

通過(guò)模型分析，建立COR的多元二次響應(yīng)面回歸模型，得擬合方程：

其中，Y是效應(yīng)值皮質(zhì)醇（COR）含量，X1、X2和X3為自變量，即（肉桂+附子）X1、（干地黃+山藥+山茱萸）X2和（牡丹皮+澤瀉+茯苓）X3。各因素與指標(biāo)之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。經(jīng)分析計(jì)算后可知，小鼠腎氣丸最佳使用劑量X1為0.256 g，X2為1.435 g，X3為1.160 g。在此條件下，取得的小鼠血清ACTH含量為12.8137 pg/mL，COR含量為14.4529 pg/mL?？紤]到實(shí)際應(yīng)用及方差分析結(jié)果，確定小鼠腎氣丸最佳使用劑量為：肉桂、附子各0.15 g，干地黃0.56 g，山藥、山茱萸各0.28 g，牡丹皮、澤瀉、茯苓各0.42 g。并按此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得小鼠血清ACTH含量為12.02 pg/mL，COR含量為13.63 pg/mL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合臨床實(shí)際應(yīng)用情況，以及普通高等教育中醫(yī)藥類(lèi)規(guī)劃教材《方劑學(xué)》書(shū)本記載：肉桂、附子各3 g，干地黃24 g，山藥、山茱萸各12g，牡丹皮、澤瀉、茯苓各9 g，推斷若將腎氣丸組方中肉桂和附子劑量增加1倍，干地黃、山藥、山茱萸保持不變，牡丹皮、澤瀉、茯苓亦增加1倍，即腎氣丸中各藥物配伍比例調(diào)整為：附子：肉桂：干地黃：山藥：山茱萸：牡丹皮：澤瀉：茯苓為2∶2∶8∶4∶4∶6∶6∶6，其對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能低下的調(diào)節(jié)作用更加顯著，溫補(bǔ)腎陽(yáng)作用最佳。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)腎氣丸進(jìn)行組方優(yōu)化研究旨在優(yōu)化組方的劑量及配比，不改變藥物組成。實(shí)驗(yàn)運(yùn)用糖皮質(zhì)激素氫化可的松建立小鼠腎陽(yáng)虛模型，根據(jù)腎氣丸不同劑量配比對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠臨床癥狀、血清ACTH和COR含量的改善情況，來(lái)尋找腎氣丸溫補(bǔ)腎陽(yáng)作用的最佳配比劑量。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉桂和附子劑量增加1倍，干地黃、山藥、山茱萸保持不變，牡丹皮、澤瀉、茯苓亦增加1倍，即附子、肉桂、干地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓的比例為2∶2∶8∶4∶4∶6∶6∶6，其對(duì)腎陽(yáng)虛小鼠腎上腺皮質(zhì)功能低下?tīng)顩r改善明顯，溫補(bǔ)腎陽(yáng)作用最佳。該結(jié)果與古文獻(xiàn)中記載的腎氣丸衍化方作用相一致，在眾多腎氣丸衍化方中，肉桂及附子的劑量均較原方劑量有所增加，以便更好地發(fā)揮其溫補(bǔ)腎陽(yáng)之功?？紤]劑量及配比發(fā)生改變的可能原因?yàn)椋孩贉匮a(bǔ)腎陽(yáng)作用目的的強(qiáng)化。自晉至宋時(shí)期對(duì)腎氣丸的衍化來(lái)看，該方已逐漸從補(bǔ)腎氣衍變?yōu)闇匮a(bǔ)腎陽(yáng)的方劑。明代開(kāi)始，眾醫(yī)家逐漸將金貴腎氣丸奉為溫補(bǔ)腎陽(yáng)之代表方。普通高等教育中醫(yī)藥類(lèi)規(guī)劃教材五版及六版教材均將該方列入補(bǔ)陽(yáng)藥類(lèi)，作用為“補(bǔ)腎助陽(yáng)”，主治“腎陽(yáng)不足證”。正所謂“量隨證變，效由量生”，因此，該方的劑量及配比發(fā)生一定變化是合理的。②藥材質(zhì)量的變化。藥材質(zhì)量好壞是產(chǎn)生臨床療效的關(guān)鍵所在，但隨著生態(tài)環(huán)境的改變，或者炮制方法的不同，藥材質(zhì)量也在不斷發(fā)生變化，為達(dá)到良好的治療效果，組方藥物劑量發(fā)生改變，而不是固守原方劑量。③劑型的改變?！督饏T要略》中記載腎氣丸用法為“上為細(xì)末，煉蜜為丸，如梧桐子大，酒下為十五丸，日再服”，現(xiàn)多用湯劑入藥。劑型上的改變，對(duì)組方中有效成分的溶出產(chǎn)生一定影響，如作為肉桂的主要有效成分桂皮醛，因其具有揮發(fā)性，因而隨著藥物的不斷加熱煎煮，其含量將會(huì)受到影響，其藥理作用同時(shí)發(fā)生改變，故對(duì)臨床療效亦產(chǎn)生一定影響。故此，為達(dá)到良好的臨床治療功效，將腎氣丸劑量及配比進(jìn)行優(yōu)化是必要的。

［1］高潔，李政木，黎同明，等.從拆方腎氣丸對(duì)腎陽(yáng)虛模型大鼠HPA軸的影響初探“陰中求陽(yáng)”配伍機(jī)理［J］.四川中醫(yī)，2007，25（7）：15-17.

［2］陳奇.中藥藥理學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：33.

［3］沈自尹.中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)［J］.中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986（2）：117.

（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Component Optimization Study of Shenqi Wan Based on Response Surface Analysis

WANG Yumei，GAO Jie，LI Zhengmu，ZHANG Xuqian，CHEN Nandi，
CHEN Gongcheng，ZHANG Yumin，JIANG Shuxia

Objective：To optimize optimum dose matching of Shenqi wan component，and provide reliable evidence for preventing and treating disease with Shenqi pill clinically.Methods：Divided Kunmin mouse into 19 groups randomly，10 cases in each group.Designed scheme as per response surface，set 17 groups as Chinese medicine（CM）group，other two groups set as blank group and model group.All the mice were fed adaptive for 1 week.Except mice in blank group，mice in all of the other group were injected hydrocortisone 25 mg/（kg·d）intraperitoneally to make kidney-yang deficiency model for 10 consecutive days.At the same time，CM groups were gavaged Shenqi wan，blank group and model group were given isovolumetric normal saline，successive medication for 20 days.Observed changes of kidney-yang deficiency clinical symptom，and content changes of adrenocorticotrophic hormone（ACTH），cortisol（COR）in serum.Results：Comparing with CM group，locomotor activity in model group was decreased obviously，intolerance of cold and polyuria symptom was obvious，and contents of ACTH and COR in serum were decreased significantly.By optimization and verify experiment，Shenqi wan optimal dose as follows：cinnamon and radix aconiti carmichaeli were 0.15g respectively，dried rehmannia was 0.56 g，yam and dogwood were 0.28 g respectively，moutan bark，rhizoma alismatis and poria cocos were 0.42g respectively.Conclusion：The Shenqi wan dose in original prescription is low relatively.If contents of cinnamon，radix aconiti carmichaeli，moutan bark，rhizoma alismatis and poria cocos are double，content of dried rehmannia，yam and dogwood remain are unchanged，that is，drugs compatibility proportion in Shenqi wan is adjusted to the following：radix aconiticarmichaeli：cinnamon：dried rehmannia：yam：dogwood：moutan bark：rhizoma alismatis：poria cocos be 2∶2∶8∶4∶4∶6∶6∶6.The regulating effect of above prescription on adrenal cortex hypofunction are more significant，effect on warming and invigorating kidney yang are optimal.

Shenqi wan；Response surface analysis；Component optimization；Kidney-yang deficiency model；Animal experiment；Mice

R285.5

A

0256-7415（2016）08-0292-05

10.13457/j.cnki.jncm.2016.08.130

2016-03-21

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30572295）

汪玉梅（1978-），女，講師，研究方向：方劑配伍規(guī)律研究。

李政木，E-mail：lzm@gzucm.edu.cn。