引起老齡貓牙齦炎細菌分離培養(yǎng)鑒定

葉妍琳，趙振江，楊子江，付　偲，楊　濤，肖　嘯、2*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院，云南昆明650031）

引起老齡貓牙齦炎細菌分離培養(yǎng)鑒定

葉妍琳1，趙振江1，楊子江1，付偲1，楊濤1，肖嘯1、2*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院，云南昆明650031）

∶牙齦炎是老齡貓發(fā)病機率較高的一種疾病，也是貓類健康危害較大的疾病之一，隨著伴侶寵物市場的不斷發(fā)展，老齡貓牙齦炎的病例也隨之增多，因此，對于引起老齡貓牙齦炎致病菌的研究也顯得尤為重要；通過采樣拭子采集患牙齦炎的牙齦分泌物樣本，分離到16株菌，通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生化特性，確定這16株細菌中有3種，分別是葡萄球菌、鏈球菌、陰性巴氏桿菌；引起老齡貓牙齦炎的致病菌是∶葡萄球菌、鏈球菌。

∶老齡貓牙齦炎；葡萄球菌；鏈球菌；分離培養(yǎng)；鑒定

1　引言

牙齦炎為牙齦部分組織發(fā)生的炎癥，老齡貓牙齦發(fā)生時首先流涎最常見，最初有食欲，但咀嚼或吞咽出現(xiàn)障礙，進而食量逐漸減少，想吃但是不張嘴，逐漸消瘦，口臭明顯［1］。局部淋巴結(jié)腫大，牙齦除血。打開口腔發(fā)現(xiàn)牙齦、牙床、口腔黏膜等部位紅腫、潰瘍并且出血等。嚴重病例常伴有全身癥狀［2］，如體溫升高、精神沉郁、廢食等。外觀癥狀上，貓咪會應(yīng)因為疼痛，而產(chǎn)生行為上的怪異，例如；易怒、具有攻擊性、抑郁、喜歡獨處、進食困難，不整理毛發(fā)（舔毛），當(dāng)然口臭是最常見的現(xiàn)象。是老齡貓發(fā)病機率較高的一種疾?。?］。也是貓類健康危害較大的疾病之一。

近年來，隨著伴侶寵物市場的不斷發(fā)展，老齡貓牙齦炎的病例也隨之增多［4］。貓的壽命較長，如果從小就能精心飼養(yǎng)管理，大多數(shù)的貓都能活14～17年（相當(dāng)于人70～80歲）。貓在8～9歲時，開始進入老年期［5］，但它的衰老過程比較緩慢，衰老特征逐漸出現(xiàn)，只要主人細心觀察就能發(fā)現(xiàn)。和人類一樣，寵物也面臨老齡化的問題，因此，對于引起老齡貓牙齦炎致病菌的研究也顯得尤為重要［6］。

引起老齡貓牙齦炎的病因有很多種，其一是，老齡貓本身體質(zhì)。抵抗力、免疫力就比較弱，細菌、真菌、病毒（貓杯狀病毒、貓鼻氣管炎病毒等）的侵入造成病變［7］，而一部分病因很可能是由潛在的疾病引起的，特別是老齡貓，慢性腎功能衰竭、白細胞減少癥（下降的白血細胞數(shù)量）。另外，有極少數(shù)由糖尿病引致。雖然引起老齡貓牙齦炎的病因較多且復(fù)雜，但只要是細菌感染所致，如不配合采用抗生素治療，病情反復(fù)機率很大［8］。雖然，理論上有很多藥物能治療貓牙齦炎，但隨著抗菌藥物的廣泛使用以及臨床中不合理使用藥物，使得病原菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴重，所以在日常飼養(yǎng)過程中應(yīng)多注意它的活動和行為，發(fā)現(xiàn)異常，不要給它亂服藥，應(yīng)及時送寵物醫(yī)院就診服藥一定要根據(jù)醫(yī)囑不要隨意改變。

2　材料與方法

2.1試驗時間、地點采集來自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院就診時出現(xiàn)牙齦炎癥狀的老齡貓的牙齦分泌物，裝予滅菌采樣管中冷藏。2015年3月3日至2016年4月14日在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院牧醫(yī)樓實驗室進行室內(nèi)試驗。

2.2試驗材料

2.2.1實驗病料采集到的三只患牙齦炎的老齡貓的牙齦分泌物。

2.2.2主要儀器設(shè)備顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、載玻片、蓋玻片、氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、酒精燈、立式壓力蒸汽滅菌器、冰箱、臺式高速離心機、接種環(huán)、染色缸、染色架等。

2.2.3培養(yǎng)基與試劑蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、乳糖、磷酸氫二鉀、膽鹽、普通肉湯培養(yǎng)液、血瓊脂平板培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、新型微生物微量生化鑒定管、革蘭氏染液等。

2.3試驗方法

2.3.1培養(yǎng)基（液）的制備參照參考文獻［9］配制

2.3.1.1普通肉湯的制備∶蛋白胨2g；牛肉膏1g；氯化鈉1g；加熱溶于200ml雙蒸水中，調(diào)節(jié)PH值為7.3-7.5，121℃高壓滅菌15min備用。

2.3.1.2普通瓊脂培養(yǎng)基的制備∶蛋白胨4g；牛肉浸粉1g；瓊脂2.6g；加熱溶于200ml雙水中，調(diào)節(jié)PH值為7.3-7.5，121℃高壓滅菌15min備用。

2.3.1.3血瓊脂平板培養(yǎng)基的制備∶牛肉膏3g；蛋白胨10g；Nacl5g；瓊脂15g；溶解于1000ml雙蒸水中，PH調(diào)節(jié)到7.4-7.6，121℃高壓滅菌15min備用。

2.3.2細菌的增菌在超凈工作臺上，用槍頭滴管把配好的肉湯培養(yǎng)液分別取適量裝入采好的病料高壓滅菌的試管中，并且標(biāo)明編號，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)24小時。

2.3.3細菌的分離接種環(huán)將過夜培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)液在超凈工作臺上分別接種到血瓊脂平板培養(yǎng)基上，并且標(biāo)明接種的編號。接種時用接種環(huán)以“Z”字型畫開，每涂過培養(yǎng)皿的一半時旋轉(zhuǎn)90°，用接種環(huán)繼續(xù)沿“Z”字末端畫開。接種完成后將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)18h-24h。

觀察菌落生長情況，長出圓形、中等大小、光滑、不透明、濕潤的菌落，有不太明顯的溶血環(huán)；微小灰白色半透明菌落。

2.3.4細菌的純培養(yǎng)在超凈工作臺上挑取培養(yǎng)皿中挑取典型的單個無污染的菌落分別接種到普通肉湯培養(yǎng)基中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h-24h，增菌培養(yǎng)，得到純化的菌落。

并對在普通肉湯培養(yǎng)基上，純化無污染的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，疑似葡萄球菌、鏈球菌。

2.3.5細菌革蘭氏染色、鏡檢

2.3.5.1制片取活躍生長期菌種按常規(guī)方法涂片（不易過厚），干燥和固定。

2.3.5.2初染滴加草酸銨結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位，染色1～2min后傾去染液，水洗至流出水無色。

2.3.5.3媒染用碘液覆蓋1min，傾去碘液，水洗至流出水無色。

2.3.5.4脫色將玻片上殘留水用吸水紙吸取，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脫色（一般20～30s），當(dāng)流出液無色時立即用水洗去乙醇。

2.3.5.5復(fù)染將玻片上殘留水用吸水紙吸取，用番紅復(fù)染液染色2min，水洗，吸去殘水晾干。

2.3.5.6鏡檢把制作好的玻片放在顯微鏡上，低倍鏡找出細菌的范圍，然后在待檢部位上加一滴香柏油，轉(zhuǎn)動鏡頭轉(zhuǎn)換器，將油鏡頭置于工作位置，從側(cè)面觀察并緩慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使油鏡頭浸沒在油滴內(nèi)，當(dāng)油鏡頭幾乎接觸玻片時停止轉(zhuǎn)動，然后眼睛移至目鏡，緩慢向上移動粗調(diào)節(jié)器（只應(yīng)上升，不能下降，以免壓碎標(biāo)本和損壞鏡頭），待看到模糊物象時，再用細調(diào)節(jié)器轉(zhuǎn)動至物象完全清晰為止。

2.3.6生化鑒定

2.3.6.1將純化所得的細菌接種于營養(yǎng)肉湯中，恒溫37℃培養(yǎng)18h-24h待用。

2.3.6.2細菌懸液的制取在無菌操作臺上分別吸取4ml經(jīng)過夜培養(yǎng)的肉湯菌液于經(jīng)高壓滅菌的離心管內(nèi)，2000rmp離心20min，去上清液，加入1ml無菌生理鹽水混勻。

凝固酶試驗∶取肉湯培養(yǎng)物同凝固酶試驗兔血漿于試管內(nèi)充分混合，置37℃培養(yǎng)，6h后觀察，如果內(nèi)容物完全凝固，為陽性，液體不凝固為陰性。

馬尿酸鈉水解試驗∶將細菌接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h后，離心吸取上清液，加入氯化高鐵立即混勻，10min后觀察結(jié)果，振蕩后沉淀物不消失為陽性，消失為陰性。

七葉苷水解試驗∶將細菌接種于七葉苷培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h后，觀察結(jié)果。如果培養(yǎng)基變成黑色者為陽性，不變?yōu)殛幮浴?/p>

甘露醇、山梨醇發(fā)酵試驗∶將細菌接種于對應(yīng)的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h后，觀察結(jié)果如果培養(yǎng)基變成黃色者為陽性，不變?yōu)殛幮浴?/p>

3　結(jié)果與分析

通過對來云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院就診時出現(xiàn)牙齦炎癥狀的三只老齡貓的牙齦分泌物細菌的培養(yǎng)、分離、染色鏡檢、生化鑒定，最后確定的細菌分別是葡萄球菌、鏈球菌。下面對實驗結(jié)果進行分析∶3.1病原分離與培養(yǎng)在37℃培養(yǎng)的血平板上有溶血菌落、灰色圓形菌落和白色菌落（詳見平板1、2、3），將純培養(yǎng)的溶血菌落進行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性鏈球菌；將灰色圓形菌落進行染色，得到革蘭氏陰性巴氏桿菌；將金黃色的菌落革蘭氏染色，看到革蘭氏陽性球菌，呈球形或稍呈橢圓形，排列成葡萄狀。分離培養(yǎng)三份病貓樣品時，分離得到疑似葡萄球菌8株，疑似鏈球菌5株，疑似巴氏桿菌3株，故做了生化鑒定，把三種細菌分為A、B、C兩組討論，A代表疑似葡萄球菌；B代表疑似鏈球菌；C代表疑似巴氏桿菌。詳見圖1、圖2、圖3.

血平板1　

血平板2

血平板3

3.2生化試驗

3.2.1分離菌A生化試驗

表1結(jié)果表明，試驗菌株與判斷標(biāo)準(zhǔn)相符，A菌為葡萄球菌；9］，共分離得到8株.

圖1　疑似葡萄球菌　

圖2　疑似鏈球菌

圖3　疑似巴氏桿菌

表1　A菌生化鑒定結(jié)果

3.2.2分離菌B生化試驗表2結(jié)果表明，試驗菌株與判斷標(biāo)準(zhǔn)相符，B菌為鏈球菌［10］，共分離得到5株。

表2　B細菌生化鑒定結(jié)果

3.2.3分離菌C生化試驗∶與判斷標(biāo)準(zhǔn)比較后，試驗菌株與判斷標(biāo)準(zhǔn)相符，因此C菌為陰性巴氏桿菌［11］，共分離得到3株，見表3.

表3　C細菌生化鑒定結(jié)果

與判斷標(biāo)準(zhǔn)比較后，實驗所分離培養(yǎng)到的菌株與葡萄球菌、鏈球菌、巴氏桿菌判斷標(biāo)準(zhǔn)相符。結(jié)合細菌菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢的結(jié)果，最后確定所分離到的菌為葡萄球菌、鏈球菌和陰性巴氏桿菌。

4　討論

4.1引起老齡貓牙齦炎的病因有很多，在這里只是研究臨床上最常見的細菌型，采樣過程中發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長貓患口腔炎的機率也大大增加，這可能是由于一些齒垢的積累損傷口腔黏膜，口腔免疫力下降，致使大量繁殖所引起，最終導(dǎo)致牙齦炎。不過齒炎口炎的發(fā)展過程，看法倒是較一致的，就是∶不當(dāng)?shù)胤窖装Y反應(yīng)。牙齦組織對牙斑（細菌和口水、食物的共同產(chǎn)物）產(chǎn)生不耐導(dǎo)致發(fā)炎。臨床上觀察到的牙齦口炎，一開始就發(fā)生在牙齒與牙齦之間，外觀上可以看到紅腫的患部。而細菌性牙斑如果繼續(xù)與細菌交互作用，則會繼續(xù)發(fā)展成牙結(jié)石，到了有結(jié)石階段時，牙齒結(jié)構(gòu)將受到破壞。

目前在牙齦口炎治療上，倒是有一種較激進的處理方式，就是全口拔牙。貓咪齒齦和牙齒之間，如同水火，誓不兩立，所以有些獸醫(yī)會建議飼主，當(dāng)貓咪發(fā)現(xiàn)有牙齦炎（牙齒和牙齦之間泛紅）時，就做全口拔牙的動作，免得日后發(fā)生嚴重的口齦炎，這一點，我倒是采保留看法，理由∶拔牙不是輕松的工作！牙齦還很健康的貓，牙根也很健全，如果要拔牙，得做整套。切牙韌帶會造成出血，用拔牙艇松動牙齒還是出血，加上貓嘴小、貓牙更小，拔牙艇不好操作。用拔牙鉗拔出，又是出血、往往還沒在拔牙鉗上使力時，牙齒就應(yīng)聲斷裂，殘留的牙根又是一個禍根，高速電鉆打磨也是出血。貓牙體積小是讓貓咪拔牙難度升高的主因。

所以，對于貓的口腔問題，建議多在洗牙和口腔衛(wèi)生上下手，口腔狀況較差的貓，提醒飼主回診的時間，定期的檢查與清潔，必要時會拔除已經(jīng)發(fā)炎較嚴重的牙齒，此時牙齒已經(jīng)較好拔除，發(fā)炎的組織在拔牙后一個月內(nèi)，也會得到很好的響應(yīng)。當(dāng)然，并不是每只貓，都可以在較優(yōu)勢的時間點，被發(fā)現(xiàn)牙齦有異狀，所以有時候，當(dāng)貓咪被送到診所時，可能已經(jīng)整個牙齦都紅腫潰爛，有的案例甚至侵犯到較深的咽喉部，貓咪的痛苦可想而知。

4.2采樣是在夏季，明顯看得出的致病菌是葡萄球菌和鏈球菌，巴氏桿菌是陰性菌?？赡懿煌募竟?jié)引起貓牙齦炎的致病菌有所不同。

5　結(jié)論

從患有牙齦炎癥狀的三只老齡貓的牙齦分泌物中分離出16株細菌中，通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生化特性，確定這16株細菌中有3種，分別是葡萄球菌、鏈球菌和巴氏桿菌。引起老齡貓牙齦炎的是具有一定致病力的葡萄球菌和鏈球菌。

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S858.292

B

1003-8655（2016）04-0010-04

2016-04-20

∶葉妍琳（1990-），女，云南昆明人，臨床獸醫(yī)碩士研究生，研究方向為獸醫(yī)臨床診斷學(xué)。

∶肖嘯（1966-），云南昆明人，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院教授，研究生導(dǎo)師，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院院長，研究方向為動物病理學(xué)和經(jīng)濟性動物寄生蟲研究；小動物疾病學(xué)及重大動物疫病防控技術(shù)。