基于HPLC指紋圖譜的不同產(chǎn)地金銀花—銀黃顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)

喬衛(wèi)林　彭麗華　王慧玲　劉星云（中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司　中山　528437）

基于HPLC指紋圖譜的不同產(chǎn)地金銀花—銀黃顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)

喬衛(wèi)林彭麗華王慧玲劉星云（中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司中山528437）

目的：建立3個(gè)不同產(chǎn)地金銀花—銀黃顆粒的HPLC指紋圖譜，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地金銀花及其制劑—銀黃顆粒的成分差異。方法：采用高效液相色譜法，Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6mm×150mm，2.7μm），以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8mL·min-1，檢測波長為238nm，柱溫為40℃。結(jié)果：建立了10批不同產(chǎn)地金銀花藥材的HPLC指紋圖譜共有模式，獲得19個(gè)共有特征峰；建立了3個(gè)不同產(chǎn)地金銀花制備的銀黃顆粒的HPLC指紋圖譜共有模式，獲得19個(gè)共有特征峰；3個(gè)不同產(chǎn)地金銀花及其制備銀黃顆粒的成分質(zhì)量相似性較好，但仍存在一定的地域差異。結(jié)論：建立的方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可用于金銀花及其制劑—銀黃顆粒的質(zhì)量控制和綜合評(píng)價(jià)。

金銀花 銀黃顆粒 指紋圖譜

銀黃顆粒組方由金銀花和黃芩構(gòu)成，具有清熱疏風(fēng)、利咽解毒的功效，用于外感風(fēng)熱、肺胃熱盛所致的咽干、咽痛、喉核腫大、口渴、發(fā)熱，急慢性扁桃體炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染等癥。該復(fù)方主要原料金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera Japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，主產(chǎn)于山東、河南和河北等地。目前，銀黃顆粒及金銀花藥材的質(zhì)量為通過2個(gè)指標(biāo)成分的含量測定控制［1～5］，但中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)并非僅來源于幾個(gè)指標(biāo)成分，指標(biāo)成分的含量控制無法全面反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量。中藥HPLC指紋圖譜技術(shù)被認(rèn)為是當(dāng)前能較全面反映中藥材及復(fù)方整體化學(xué)成分信息的方法，能更有效地評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量信息。金銀花及銀黃顆粒各自的指紋圖譜研究已有少量報(bào)道［6～12］。本研究在分析上述研究背景的基礎(chǔ)上，收集來源于不同產(chǎn)地的10批金銀花，并制成銀黃顆粒成品，再采用HPLC法同時(shí)建立金銀花藥材和相應(yīng)批次銀黃顆粒的指紋圖譜，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地金銀花的化學(xué)成分差異及對(duì)其制劑-銀黃顆粒的成分影響。

1　儀器與材料

1.1儀器：安捷倫1200RRLC快速液相色譜儀（美國安捷倫公司）；明澈TM-D24UV純水系統(tǒng)（美國密理博公司），KQ-400KOE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋DK-S24（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；萬分之一電子天平AB204-S（瑞士梅特勒-托利多公司）、十萬分之一電子天平AUW220D（日本島津公司）。

1.2試藥和試劑：乙腈、甲醇（HPLC級(jí)，天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司），AR甲醇、AR無水乙醇（廣東光華化學(xué)廠有限公司），冰醋酸AR（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），超純水（明澈TM-D24UV純水系統(tǒng)制備）、金銀花藥材共10批，經(jīng)中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司賈世清中藥師鑒定為忍冬科植物忍冬（Lonicera Japonica Thunb.）的干燥花蕾，批號(hào)及產(chǎn)地信息見表1。銀黃顆粒由中山市恒生藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)。

1.3對(duì)照品：綠原酸對(duì)照品（110753-200703）、木樨草苷對(duì)照品（111720-200905）、咖啡酸對(duì)照品（110885-200102）、蘆丁對(duì)照品（100080-200707）、槲皮素對(duì)照品（100081-200907），均購自中國藥品生物制品檢定所。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件：Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6mm×150mm，2.7μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫程序見表2；柱溫為40℃；檢測波長為238nm；流速：0.8mL·min-1；進(jìn)樣量5μL。

表1　金銀花及銀黃顆粒樣品信息

表2　流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2對(duì)照品溶液的制備：精密稱定綠原酸、木樨草苷、咖啡酸、蘆丁和槲皮素對(duì)照品適量，甲醇溶解，配成濃度分別為0.0168mg/ mL、0.0172mg/mL、0.0228mg/mL、0.0324mg/mL和 0.0294mg/mL的對(duì)照品混合溶液。

2.3供試品溶液的制備

2.3.1金銀花藥材供試品溶液的制備：取金銀花藥材（粉碎，過四號(hào)篩）1.0g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，加入甲醇25mL，超聲提取30min（功率500W，頻率40kHz），放冷，過濾，將過濾所得殘?jiān)^續(xù)加甲醇25mL，超聲提取30min，過濾，合并濾液，將濾液蒸干，用甲醇定容至10mL，0.22μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3.2銀黃顆粒供試品溶液的制備：取銀黃顆粒4.4g，精密稱定，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50mL，超聲提取40min（功率500W，頻率40kHz），放冷，過濾，將濾液蒸干，用甲醇定容至10mL，0.22μm微孔濾膜濾過，備用。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn)：取金銀花藥材（批號(hào)：20100101）1份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄圖譜。各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜1.66%（參照物為綠原酸），表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次金銀花藥材（批號(hào)：20100101）6份，精密稱定，分別按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄圖譜。各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，RSD＜2.78%（參照物為綠原酸），表明本方法的重復(fù)性符合指紋圖譜控制技術(shù)的要求。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批次金銀花藥材（批號(hào)：20100101），精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置。分別于0h、2h、8h、12h、24h、48h內(nèi)測定，記錄圖譜。計(jì)算48h內(nèi)各圖譜中主要色譜峰峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD。結(jié)果各主要色譜峰峰面積和相對(duì)保留時(shí)間RSD＜2.78%，表明供試品溶液在48h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5指紋圖譜的建立及分析

2.5.1參照色譜峰的確定，精密吸取金銀花對(duì)照藥材供試品溶液（批號(hào)121060-200805）及混合對(duì)照品溶液5μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，見圖1。其中供試品圖譜中綠原酸峰峰形好，分離度好，選為參照峰。

2.5.2不同產(chǎn)地金銀花指紋圖譜的建立及比較分析：取上述10批次金銀花藥材，分別按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣5μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄指紋圖譜（見圖2）。采用中南大學(xué)與中智藥業(yè)集團(tuán)聯(lián)合開發(fā)的中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫軟件，中位數(shù)法建立10批次指紋圖譜共有模式，共19個(gè)共有特征峰，共有特征峰的總面積占總峰面積的90%以上（見圖3）。9批不同產(chǎn)地金銀花的指紋圖譜與對(duì)照藥材指紋圖譜比較，全譜相似度均在0.86以上，但峰面積相似度未全部高于0.85（見表3）。

表3　10批金銀花相似度比較

2.5.3銀黃顆粒指紋圖譜的建立及分析：將不同產(chǎn)地的9批金銀花按照銀黃顆粒法規(guī)工藝制備成9批成品，再分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣5μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄指紋圖譜，分別形成河北金銀花所制備銀黃顆粒、河南金銀花所制備銀黃顆粒和山東金銀花所制備銀黃顆粒的共有圖譜（分別命名為YH1、YH2、YH3），進(jìn)行比較分析（見圖5），并分別對(duì)比分析不同產(chǎn)地銀黃顆粒與其對(duì)應(yīng)的金銀花原料指紋圖譜相關(guān)性（見圖6）。采用中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫軟件，中位數(shù)法建立9批銀黃顆粒指紋圖譜共有模式，共19個(gè)共有特征峰，共有特征峰的總面積占總峰面積的90%以上（見圖7）。3產(chǎn)地金銀花所制備銀黃顆粒指紋圖譜比較（設(shè)河北產(chǎn)金銀花所制備銀黃顆粒共有圖譜為標(biāo)準(zhǔn)圖譜），全譜相似度均在0.97以上，但峰面積相似度偏低（見表4）。

表4　3產(chǎn)地金銀花所制備銀黃顆粒相似度比較

3　討　論

3.1不同產(chǎn)地金銀花指紋圖譜數(shù)據(jù)分析：由表3可見，與金銀花對(duì)照藥材相比，河北和河南產(chǎn)金銀花的全譜相似度較高，達(dá)0.91，分別可與對(duì)照藥材形成29個(gè)共有峰和27個(gè)共有峰，山東產(chǎn)金銀花的相似度則相對(duì)較低（與對(duì)照藥材形成19個(gè)共有峰）；峰面積相似度比較可見，河南金銀花與對(duì)照藥材更接近。

從綠原酸的含量角度分析，相同生藥量濃度下，綠原酸的峰面積大小為金銀花對(duì)照藥材＞河北金銀花＞河南金銀花＞山東金銀花。

為更清晰比較不同產(chǎn)地間金銀花藥材的差異，對(duì)每個(gè)產(chǎn)地金銀花指紋圖譜的共有模式進(jìn)行對(duì)比分析（見圖4）。由圖4可見：在保留時(shí)間為2.6～3.2min之間有2組色譜峰，河北金銀花含量顯著高于其他產(chǎn)地及對(duì)照藥材；在保留時(shí)間為5.2～5.6min之間有2組色譜峰，河北金銀花和對(duì)照藥材含量顯著高于河南金銀花和山東金銀花；保留時(shí)間為6.6min的色譜峰，河南金銀花和對(duì)照藥材含量顯著高于河北金銀花和山東金銀花；山東金銀花和河北金銀花的咖啡酸含量高于對(duì)照藥材和河北金銀花；山東金銀花在保留時(shí)間為 12.0～13.5min、16.0～16.5min和19.5min時(shí)，存在色譜峰含量極低甚至缺失。

基于上述成分分析的結(jié)果，初步認(rèn)為：①河北和河南產(chǎn)金銀花的質(zhì)量與金銀花對(duì)照藥材更接近，稍優(yōu)于山東產(chǎn)金銀花。②若需簡單、快速地鑒別金銀花藥材產(chǎn)地，河北產(chǎn)金銀花的主要鑒別點(diǎn)在保留時(shí)間為2.6～3.2min、5.2～5.6min和12.10min處，河南產(chǎn)金銀花的主要鑒別點(diǎn)在保留時(shí)間為6.6min和7.7min處，山東產(chǎn)金銀花的主要鑒別點(diǎn)在保留時(shí)間為12.0～13.5min、16.0～16.5min和19.5min處。

3.2銀黃顆粒指紋圖譜數(shù)據(jù)分析：由圖5可見，不同產(chǎn)地金銀花制備的銀黃顆粒間存在的成分差異與金銀花原料間的差異一致。由圖6可見，金銀花藥材的絕大部分成分峰在制備的銀黃顆粒圖譜中能找到，說明在制備銀黃顆粒過程中，金銀花的成分組成是基本穩(wěn)定的。銀黃顆粒圖譜中，在保留時(shí)間為21.0～28.0min處存在幾個(gè)金銀花藥材沒有的色譜峰，主要由黃芩藥材提供。由表4可見，不同產(chǎn)地金銀花制備的銀黃顆粒全譜相似度高，但峰面積相似度偏低，認(rèn)為整體成分組成差異不大但成分含量存在較大的差異，還需結(jié)合精確含量測定確認(rèn)。

3.3本研究對(duì)供試品制備的提取溶劑（不同濃度乙醇和甲醇）、提取方法（超聲提取、加熱回流）、提取時(shí)間（20min、30min、40min、60min）和提取次數(shù)等均進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明：“2.3”項(xiàng)下條件所制備供試品的指紋圖譜干擾峰相對(duì)較少，峰信息較全，含量較高，故選其作為供試品制備方法。

3.4本研究采用DAD檢測器在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行了掃描，結(jié)果在238 nm波長下各峰分離良好，峰分布均勻且基線平穩(wěn)，峰信息量較大，故選取238nm作為指紋圖譜檢測波長。此外考察了不同色譜柱（Diamonsil C18，4.6mm×250mm，5μm；Hypersil C18，4.6mm×250mm，5μm；Poroshell 120 EC-C18，150mm×4.6mm，2.7μm；ZORBAxEclipsePlusC18，4.6mm×100mm，1.8μm；ZORBAx C18，4.6mm×50mm，1.8μm），不同流動(dòng)相（乙腈-水，甲醇-水，乙腈-0.1%醋酸，甲醇-0.1%醋酸，乙腈-0.2%磷酸），不同洗脫梯度和不同柱溫（25℃、30℃、40℃）的分離效果，結(jié)果以“2.1”項(xiàng)下色譜條件所得圖譜干擾小、峰形好、峰分離度大，適合作為金銀花及銀黃顆粒HPLC指紋圖譜分析的色譜條件。

3.5本研究分析的金銀花樣品批次有限。還需進(jìn)一步擴(kuò)大收集不同產(chǎn)地的金銀花批次量并制備成相應(yīng)批次的銀黃顆粒，從而建立不同產(chǎn)地金銀花的指紋圖譜模型，確認(rèn)更清晰的指紋圖譜鑒別點(diǎn)，并反映不同產(chǎn)地原料和生產(chǎn)工藝等環(huán)節(jié)的差異對(duì)銀黃顆粒成品質(zhì)量差異的影響。

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HPLC fingerprints of Lonicera Japonica Thunb.—Yinhuang Granules from different habitats

Qiao Weilin Peng Lihua Wang Huiling Liu xingyun（Zhongshan City，China Pharmaceutical Group Co.，Ltd.Zhongshan 528437）

Objective：To establish HPLC fingerprint of Lonicera Japonica Thunb.—Yinhuang Granules from different habitats and evaluate their differences.Methods：RP-HPLC was performed on an Poroshell 120 EC-C18column（4.6mm×150mm，2.7μm）with a gradient elution composed of acetonitrile-aqueous solution containing 0.2%phosphoric acid at the flow rate of 0.8mL·min-1.The column temperature was set at 40℃，while the detective wavelength was set at 238nm.Results：The chromatographic fingerprint common pattern of Lonicera Japonica Thunb.was established and 19 mutual peaks were obtained from the chromatograms of 10 batches of samples；The chromatographic fingerprint common pattern of Yinhuang Granules was established and 19 mutual peaks were obtained.The quality of Yinhuang Granules andLonicera Japonica Thunb.from different habitats was similar but there were still some regional differences. Conclusion：The method has good precision，stability and repeatability and can be used for quality control for Lonicera Japonica Thunb. andYinhuang Granules.

Lonicera Japonica Thunb Yinhuang Granules Fingerprint

R284.1

A

1672-8351（2016）02-0005-03