柱前衍生化HPLC法分析人工栽培金線蓮中多糖的單糖組成

林守二， 黃麗英， 俞曉玲

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柱前衍生化HPLC法分析人工栽培金線蓮中多糖的單糖組成

林守二1,2， 黃麗英1， 俞曉玲1

目的建立一種金線蓮多糖(ARPS)中單糖組成的柱前衍生化高效液相(HPLC)測定方法。方法以三氟乙酸(TFA)水解ARPS，通過1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生，梯度洗脫HPLC測定，并分別對衍生化過程的pH、PMP 的用量和水解過程的TFA濃度作了優(yōu)化。結(jié)果人工栽培ARPS由甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，且各單糖的物質(zhì)的量的比為：甘露糖∶核糖∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=1.00∶8.47∶47.30∶1.17∶1.19。結(jié)論該方法簡便可行，重復(fù)性良好，適用于分析ARPS中單糖組成。

蘭科； 多糖類； 色譜法； 色譜法, 高效壓液相； 單糖類

(2016)03-0148-07

金線蓮具有抗腫瘤、保肝和降壓等多種藥理活性，但野生資源稀少[1-2]，目前已經(jīng)實現(xiàn)人工栽培和工廠化生產(chǎn)組培苗[3]。本課題組發(fā)現(xiàn)，野生的金線蓮中富含金線蓮多糖，主要由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖和巖藻糖組成[4]。目前文獻(xiàn)對人工栽培和野生金線蓮這二種不同來源藥材的重要活性成分之一金線蓮多糖(anoectochilus roxburghii polysaccharide, ARPS)組成的異同點鮮有報道。本研究采用三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)水解ARPS，以1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮(1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)作為柱前衍生化試劑，梯度洗脫高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測定人工栽培的金線蓮中ARPS的單糖組成，并計算其物質(zhì)的量。同時，對衍生化過程的pH、PMP的用量和水解過程的TFA濃度分別優(yōu)化，為ARPS的單糖組成分析提供參考，也為金線蓮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑D-甘露糖(批號：33708)、D-半乳糖(批號：lot#H1224032)、鼠李糖(批號：32800)、葡萄糖(批號：lot#A1403066)、L-巖藻糖(批號：30268)、DL-阿拉伯糖(批號：lot#G1223072)、D-核糖(批號：35727)、D-(+)-半乳糖醛酸(批號：lot#B1413009)(以上對照品均購自阿拉丁試劑公司，純度均≥98%)；PMP(批號：20131127，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；TFA(化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯仿(化學(xué)純，南京利盛化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，西隴化工股份有限公司)；乙酸銨(色譜級，西亞試劑公司)。

1.1.2主要儀器自動三重純水蒸餾器(SZ-97，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(BS124S，Max120 g， d=0.1 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司)； 高效液相色譜儀(LC-20A，日本島津有限公司)；離心機(jī)(H 1650-W，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.1.3精制ARPS來源金線蓮為福建南靖人工栽培藥材，經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院張永紅教授鑒定。精制ARPS為實驗室應(yīng)用水提醇沉后高速逆流色譜法分離純化(另報道)，苯酚-硫酸法測得其純度為92.46%。

1.2方法

1.2.1衍生化過程pH的考察精密稱取甘露糖9.0 mg，核糖7.5 mg，鼠李糖18.2 mg，葡萄糖9.0 mg，半乳糖9.0 mg，阿拉伯糖7.5 mg，巖藻糖8.2 mg，半乳糖醛酸10.6 mg，用水定容至10 mL，得鼠李糖濃度為10 mmol/L(因響應(yīng)值較小)，其余單糖濃度為5 mmol/L，作為混合對照品溶液。

取5份100 μL混合對照品溶液，加入100 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液(0.435 5 g PMP 溶于50 mL的甲醇)，再分別加入0.1 mol/L的NaOH 60,40,30,25,20 μL，渦旋混勻，70 ℃水浴反應(yīng)30 min，取出冰浴冷卻后分別加入等物質(zhì)的量的鹽酸溶液中和，80 ℃干燥。用600 μL水復(fù)溶，并加入1 mL氯仿萃取4次，最后用0.22 μm的微孔濾膜過濾后待進(jìn)樣分析。

1.2.2衍生化過程PMP用量的考察取5份100 μL混合對照品溶液，分別加入不同量0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，使PMP的物質(zhì)的量分別為各單糖物質(zhì)的量總和的2，5，10，20，30倍，再加入0.1 mol/L的NaOH 30 μL，其余條件及方法同1.2.1，衍生化后待進(jìn)樣分析。

1.2.3混合對照品溶液的衍生化取混合對照品溶液100 μL于1.5 mL的EP管中，加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液100 μL(為單糖總物質(zhì)的量的10倍)和0.1 mol/L NaOH溶液30 μL，其余條件及方法同1.2.1，衍生化后待進(jìn)樣分析。

1.2.4ARPS的水解及TFA濃度的考察取精制ARPS 3 mg，加入1.5 mL濃度分別為0.002，0.01，0.02，0.1，0.2，2 mmol/L的TFA溶液，充氮氣封管，于100 ℃水浴水解12 h，冰浴冷卻后8 000 r/min離心10 min，取上清液，用NaOH中和至中性，作為樣品溶液。取樣品溶液100 μL于1.5 mL的EP管中，加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液100 μL和0.1 mol/L的NaOH 溶液30 μL，其余條件及方法同1.2.1，衍生化后待進(jìn)樣分析。

1.2.5色譜條件的選擇色譜柱：C18柱(4.6×250 mm，5 μm，Waters)；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測波長：254 nm；流動相：B：乙腈，A：20 mmol/L 乙酸銨水溶液；梯度模式：時間梯度0～2～8～25 min，相應(yīng)濃度梯度：溶劑B 15%～20%～28%～33%，進(jìn)樣體積為20 μL。

1.2.6方法學(xué)考察(1)線性關(guān)系的考察：精密稱取甘露糖4.0 mg，核糖7.4 mg，葡萄糖126.3 mg，半乳糖7.5 mg，阿拉伯糖 4.1 mg，用水定容至10 mL，為混合對照品母液。配制不同濃度的混合對照品溶液衍生化后按1.2.5條件進(jìn)樣分析。(2)精密度試驗：取1.2.1中同一混合對照品溶液衍生化后，按1.2.5條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值。(3)穩(wěn)定性試驗：取同一份樣品溶液衍生化后按1.2.5條件，分別于0，2，4，6，8，10，12 h后進(jìn)樣，觀察峰面積變化情況。(4)重復(fù)性試驗：取樣品溶液6份衍生化后，按1.2.5條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并換算成含量計算RSD值。(5)加樣回收試驗：取已知含量的ARPS樣品9份，按低、中、高分成3組，每組分別加入含量為80%,100%,120%的相應(yīng)對照品，按1.2.4水解并衍生化后按1.2.5條件進(jìn)樣分析，計算回收率和RSD。

2　結(jié)　果

用于糖類衍生化的試劑有2-氨基苯甲酸、糖腈乙酸酯、PMP等。其中，PMP與糖類物質(zhì)衍生時反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物無立體異構(gòu)，兩分子PMP與一分子單糖縮合，生成的衍生物與各單糖的定量關(guān)系明確，線性關(guān)系良好，其反應(yīng)原理如圖1所示：

本實驗采用PMP衍生化HPLC法分析人工栽培金線蓮中多糖的單糖組成，并對衍生化條件進(jìn)行優(yōu)化，比較各種單糖對照品峰面積的大小，優(yōu)化后的衍生化條件及單糖含量測定結(jié)果如下：

2.1衍生化過程pH的優(yōu)化結(jié)果當(dāng)加入0.1 mol/L NaOH 25 μL時，半乳糖醛酸峰面積的響應(yīng)值最大；巖藻糖在加入量為30 μL時峰面積響應(yīng)最大；鼠李糖、半乳糖和葡萄糖均隨NaOH加入量的增加峰面積響應(yīng)增大，但在加入量為30～60 μL時增大較緩慢；而阿拉伯糖、核糖和甘露糖在加入量為20～30 μL中響應(yīng)值呈上升趨勢，當(dāng)加入量>30 μL后趨于平穩(wěn)狀態(tài)。故加入0.1 mol/L的 NaOH 30 μL 較為合適，此時測得溶液中的pH值為8～9(圖2)。

當(dāng)PMP與單糖總和的物質(zhì)的量的比為5倍以下時，各種糖的峰面積響應(yīng)值都隨著PMP加入量的增大而增大；當(dāng)PMP加入量為5～20倍時，各種糖的峰面積基本都維持在最大值的水平；當(dāng)PMP加入量超過20倍時，各種糖峰面積響應(yīng)值略下降，綜上分析,PMP加入量為單糖總物質(zhì)的量的5～20倍時較為合適，故本實驗選擇PMP加入量為單糖總物質(zhì)的量的10倍(圖3)。

2.2TFA濃度的優(yōu)化結(jié)果不同單糖對TFA 的敏感程度不同，隨著TFA濃度的增大，ARPS水解后各種單糖的峰面積都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，其中葡萄糖和甘露糖在TFA濃度為0.1 mol/L時峰面積響應(yīng)最大，而核糖、阿拉伯糖和半乳糖則在TFA濃度為0.02 mol/L時峰面積有最大響應(yīng)(圖4)。由于核糖在這2個TFA濃度上差異變化較為劇烈，其他糖的變化則相對平緩，故選用濃度為0.02 mol/L的TFA作為水解酸。色譜分析發(fā)現(xiàn)，ARPS中不含鼠李糖、半乳糖醛酸和巖藻糖3種單糖，故不討論TFA的濃度對其影響。

此外，實驗中發(fā)現(xiàn)衍生化過程中在70 ℃水浴反應(yīng)30 min后，選用冰浴冷卻，可以減少雜質(zhì)峰，酸中和步驟中以加入等當(dāng)量的酸為宜，且在酸中和后的干燥過程可明顯減少雜峰。

綜上所述，最優(yōu)化的水解和衍生化條件是：0.02 mol/L的TFA作為水解酸，衍生化過程加入0.1 mol/L的NaOH 30 μL，PMP加入量為單糖總物質(zhì)的量的10倍。

2.3PMP(不含單糖)、混合對照品和樣品衍生化反應(yīng)后的色譜圖色譜過程應(yīng)用等度洗脫對流動相的組成進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)乙腈濃度<22%時峰較寬，且保留時間較長；而當(dāng)乙腈濃度>30%時，峰與峰之間不能達(dá)到完全分離，故洗脫方式采用梯度洗脫，優(yōu)化結(jié)果其梯度為0～2～8～25 min，乙腈濃度為15%～20%～28%～33%。在保證乙腈梯度濃度的情況下，考察流動相中醋酸銨的pH為5.0～7.5時混合對照品的出峰情況，發(fā)現(xiàn)隨著pH的增大，洗脫順序不變，出峰時間縮短，但分離度略變差。為了分析簡便，且在基本滿足分離度的要求下，最終選擇水相含20 mmol/L pH為7.0的醋酸銨溶液。

選擇考察后的最優(yōu)條件，PMP(不含單糖)、混合對照品溶液及樣品溶液衍生化后按1.2.5色譜條件進(jìn)樣分析。依據(jù)保留時間，判斷ARPS由甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成(圖5～7)。

2.4線性關(guān)系的考察按1.2.5條件進(jìn)樣分析，以單糖摩爾濃度為橫坐標(biāo)(x，mmol/L)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖5種單糖進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.5精密度試驗取1.2.1中同一混合對照品溶液衍生化后，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖的峰面積并計算RSD值，結(jié)果表明RSD值分別為1.31%，0.83%，1.35%，2.11%和1.84%，表明方法精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗取同一批樣品溶液6份衍生化后進(jìn)樣分析，記錄甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖的峰面積，換算成含量并計算RSD值，結(jié)果表明RSD值分別為2.59%，3.21%，2.65%，1.35%和1.59%，表明重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗同一份樣品溶液衍生化后于0，2，4，6，8，10，12 h后進(jìn)樣，觀察甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖及阿拉伯糖的峰面積變化情況，根據(jù)4 h內(nèi)的峰面積計算得RSD值分別為1.78%，2.12%，3.27%，1.26%和1.32%，表明樣品在萃取后4 h內(nèi)測完基本穩(wěn)定，在6 h后測響應(yīng)值有所下降，隨著時間推移，下降越明顯。

表1　6種單糖的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.8加樣回收試驗取已知含量的ARPS樣品9份，按低、中、高分成3組，每組分別加入含量為80%,100%和120%的相應(yīng)對照品，水解并衍生化后進(jìn)樣分析，計算回收率和RSD，結(jié)果如表2所示，平均回收率為98.72%～102.28%，RSD為1.05%～3.71%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2　回收率實驗結(jié)果

表2　(續(xù))

RSD：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.

2.9各單糖的物質(zhì)的量的比測定結(jié)果ARPS經(jīng)優(yōu)化后的條件水解并衍生化后，按1.2.5色譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積對應(yīng)線性關(guān)系換算成物質(zhì)的量，進(jìn)而求出組成ARPS的各單糖物質(zhì)的量的比，結(jié)果如表3所示。

表3　各單糖物質(zhì)的量的比測定結(jié)果

根據(jù)表3樣品中各單糖的峰面積之比可得ARPS中各單糖的物質(zhì)的量的比為：甘露糖∶核糖∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=1.00∶8.47∶47.30∶1.17∶1.19，物質(zhì)的量的比之間差異較大，表明ARPS主要由葡萄糖組成，葡萄糖可能是構(gòu)成糖主鏈的主要單糖[5]。文獻(xiàn)研究的野生金線蓮中多糖的單糖組成為甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖∶阿拉伯糖∶巖藻糖=1.3∶1.0∶1.2∶1.1∶1.7[6]，研究結(jié)果與之差異較大，表明人工栽培的金線蓮與野生金線蓮的單糖組成種類和物質(zhì)的量的比都不同。

3　討　論

單糖組成的研究是多糖結(jié)構(gòu)表征的重要內(nèi)容。多糖是由單糖連接而成的，要測定其單糖組成，首先要對多糖進(jìn)行水解。不同糖的水解條件不同，目前多采用酸水解法，主要用到的酸有鹽酸、硫酸和TFA，其中TFA反應(yīng)條件溫和且易于除去，被廣泛使用[7-8]。本研究考察了不同濃度的TFA對ARPS的水解情況后，最終選擇了0.02 mol/L的TFA。但不同多糖的構(gòu)成方式不同，可能水解過程最適TFA濃度也會有所差別。

由于多糖的紫外吸收為末端吸收，需要通過衍生化反應(yīng)，使其帶上紫外吸收的基團(tuán)，使得普通的紫外吸收檢測器就能實現(xiàn)對其進(jìn)行分析。單糖組成分析方法主要是氣相色譜法和液相色譜法[9]。文獻(xiàn)[10-11]在研究單糖組成分析時，同時采用PMP柱前衍生化法(HPLC法)和糖腈乙酸酯衍生化法(GC法)分析，結(jié)果表明2種方法檢測結(jié)果基本一致，但HPLC沒有揮發(fā)性限制問題，且文獻(xiàn)表明HPLC能檢測到多糖組成中的多糖和糖醛酸信息[12]，結(jié)果更為全面。本實驗以PMP作為柱前衍生化試劑。由PMP空白試驗可知，殘余的PMP峰出現(xiàn)在12.7 min，均在各個單糖出峰之前，不影響測定結(jié)果。同時分別對衍生化過程的pH和PMP 的用量作了考察，但是不同單糖對pH及PMP用量的敏感度不同，因此同時測定時應(yīng)綜合考慮后選擇較為合適的條件。

實驗測得人工栽培ARPS各單糖的物質(zhì)的量的比為：甘露糖∶核糖∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=1.00∶8.47∶47.30∶1.17∶1.19，葡萄糖含量尤為高，其可能與栽培過程所添加的原料有關(guān)，與野生ARPS單糖組成差異也較大，但對于藥材的綜合質(zhì)量評價還有待于進(jìn)一步研究。

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(編輯:張慧茹)

Analyze Monosaccharide Composition of Polysaccharide in Artificial Cultivated Anoectochilus Roxburghii by Pre-column Derivatization HPLC

LIN Shou’er1,2, HUANG Liying1, YU Xiaoling1

1. College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China;2. Fujian Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou 350001, China

ObjectiveTo establish a method for the determination of monosaccharide composition inAnoectochilusRoxburghiipolysaccharide (ARPS) by pre-column derivatization High Performance Liquid Chromatography(HPLC).MethodsARPS was hydrolyzed by trifluoroacetic acid(TFA) solution and the monosaccharide derivatives obtained with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP) were separated by HPLC using gradient elution process.The pH, dosage of PMP in the process of derivatization and concerntration of TFA in the process of hydrolyzation was optimized respectively.ResultsARPS was composed of mannose, ribose, glucose, galactose and arabinose, and their molar ratio was 1.00∶8.47∶47.30∶1.17∶1.19.ConclusionThe method is simple, workable and had good reproducibility.It could be used to determine the monosaccharide composition of ARPS.

orchidaceae； polysaccharides； chromatography； chromatography, high pressure liquid； monosaccharides

2015-12-15

國家海洋局海洋生物遺傳資源重點實驗室開放研究基金(HY201404)；國家衛(wèi)生和計劃生育委員會科研基金(wkj-FJ-33)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410392016)

1.福建醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，福州350004；2．福建省疾病預(yù)防控制中心，福州350001

林守二(1989-)，女，醫(yī)學(xué)碩士

黃麗英. Email:fjmuhly88@sina.com

R282.71； R343.2； R343.9； R927.2； R977.7

A

1672-4194