江南卷柏Phi類谷胱甘肽S-轉移酶的分子特性

張元杰，楊志靈，楊海靈

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江南卷柏Phi類谷胱甘肽-轉移酶的分子特性

張元杰，楊志靈，楊海靈

北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院，北京 100083

谷胱甘肽-轉移酶 (Glutathione-transferase, GST) 在幫助植物抵抗各種脅迫中發(fā)揮重要作用。該研究從江南卷柏中克隆到兩個Phi類GST基因，分別命名為和，兩個基因均編碼215個氨基酸殘基的蛋白質。表達模式分析發(fā)現(xiàn)，這兩個基因在江南卷柏根、莖和葉中均有表達。將這兩個基因在大腸桿菌中誘導表達重組蛋白并純化，酶學性質分析表明SmGSTF1和SmGSTF2對CDNB、NBD-Cl和NBC等3種底物都有活性。SmGSTF1對Fluorodifen和Cum-OOH也有活性，而SmGSTF2對它們沒有活性。酶動力學分析表明SmGSTF1和SmGSTF2對GSH有較高的親和力，而對CDNB的親和力都相對較低。在不同pH及溫度條件下對SmGSTF1和SmGSTF2重組蛋白進行活性測定，發(fā)現(xiàn)這兩個蛋白在pH 7?8.5，45?55 ℃溫度范圍內有較高的催化活性。研究推測，SmGSTF1和SmGSTF2可能在江南卷柏的抗逆生理過程中有重要的作用。

江南卷柏，谷胱甘肽-轉移酶，基因表達，酶學性質

蕨類植物起源于距今4億年前，相比較苔蘚植物，蕨類植物孢子體內部有明顯的維管組織的分化，因而在原始維管植物的進化中具有重要意義[1]。江南卷柏是蕨類植物的現(xiàn)存種之一，在中國廣泛分布于長江流域和長江以南各地[2]，是一種常用的具有清熱活血作用的藥用植物[3]。對其進行研究有助于理解蕨類植物適應更復雜陸地環(huán)境的作用機制。

谷胱甘肽-轉移酶 (Glutathione-transferase，GST，EC 2.5.1.18) 是一類具有多種生理功能的蛋白質超家族，廣泛存在于哺乳動物、植物、鳥類、昆蟲、寄生蟲及微生物體內。最早在20世紀70年代，就在玉米中發(fā)現(xiàn)了GST[4-6]，隨后植物GST的基因結構、進化分析、表達模式和生物學功能等得到了廣泛的研究[7-10]。GST在生物體內主要參與植物的解毒代謝，它能催化外源或內源的親電子化合物與還原型谷胱甘肽 (Reduced glutathione) 結合形成R-SG復合物，增加其親水性，使其能夠被轉運出細胞膜，達到解毒的作用[4-6]。植物GST基因家族主要分為8個類型，分別是Tau、Phi、DHAR、Zeta、Theta、Lambda、TCHQD和EF1Bγ[11]，其中Phi類GST是植物特有的類型。植物中Tau、Phi和Zeta類GST的晶體結構已得到解析，蛋白結構比較發(fā)現(xiàn)植物GST的三維結構都比較保守[12]，但其負責與特異性底物結合的C末端區(qū)域結構變化較大，這也說明不同的GST能結合特定底物而發(fā)揮不同的生理功能[13]。Phi類GST對于植物抵抗逆境脅迫具有重要作用，例如，在擬南芥中過量表達一個Phi類GST基因能顯著提高其植株對紫外線的抗性[14]；在煙草中過量表達玉米的Phi類GST基因明顯增強了植株對除草劑的抗性[15]。

先前已經有對苔蘚植物 (如小立碗蘚)、裸子植物 (如油松) 和被子植物 (如楊樹) 中Phi類GST的研究[11,16-17]，但缺乏對于蕨類植物中Phi類GST的相關研究。本研究從江南卷柏中克隆得到兩個Phi類GST基因，對它們的系統(tǒng)發(fā)育、基因結構、基因表達模式，以及所編碼蛋白的結構和生化活性進行了深入的研究，為揭示Phi類GST在植物響應環(huán)境脅迫中的作用機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的江南卷柏取自重慶縉云山，用于RNA的提取。

1.2 江南卷柏Phi類GST的鑒定

以已發(fā)表的小立碗蘚Phi類GST蛋白序列為模板[17]，在NCBI的江南卷柏基因組數據庫中進行TBLASTN搜索，然后對搜索得到的序列進行保守結構域分析。

1.3 江南卷柏和基因的克隆

將江南卷柏植株洗凈，取約50 mg新鮮葉片，按照植物總RNA提取試劑盒 (BioTeKe公司) 說明書提取江南卷柏葉的總RNA，然后用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。根據和基因序列，分別設計引物對SmGSTF1-EX1/EX2和 SmGSTF2-EX1/EX2，以江南卷柏葉cDNA為模板，用Q5高保真DNA聚合酶 (NEB公司) 進行PCR擴增，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用DNA快速純化/回收試劑盒 (鼎國公司) 回收目的條帶。純化后的PCR片段連接到pEASY-Blunt載體 (全式金公司)，并轉化1-T1感受態(tài)細胞 (全式金公司)。在X-gal/IPTG Amp平板上挑取多個菌落，進行菌落PCR，并對陽性克隆進行測序。

1.4 Phi類GST系統(tǒng)發(fā)生關系分析

將SmGSTF1和SmGSTF2，以及其他植物Phi類GST蛋白序列通過Clustal X 1.83進行氨基酸序列比對，然后在BioEdit中進行手動校對。利用MEGA 5.0的neighbour-joining (NJ) 模型構建進化樹，Bootstrap值為1 000。

1.5和的表達模式分析

使用植物總RNA 提取試劑盒 (BioTeKe公司) 提取江南卷柏根、莖和葉3個部位的RNA，然后將RNA用反轉錄試劑盒 (TaKaRa公司) 反轉錄成cDNA。設計引物SmGSTF1-SP1/SP2和SmGSTF2-SP1/SP2，分別以江南卷柏根、莖和葉的cDNA為模板，以江南卷柏基因為內參進行半定量RT-PCR，以研究和在不同組織的表達情況 (表1)。PCR反應程序是：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，分別進行24、26、28個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將PCR產物送出測序，進一步驗證擴增得到的PCR產物是否為目的基因。

表1 本研究所用的引物

Table 1 Primers used in this study

1.6 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白結構模擬

以擬南芥的Phi類GST (PDB:1GNW) 的X射線衍射晶體結構為模板，在SWISS-MODEL上進行蛋白結構模擬，對模擬結果進一步用prolife-3D程序進行驗證，選取最優(yōu)的模擬結構。

1.7 SmGSTF1和SmGSTF2重組蛋白的表達和純化

以SmGSTF1-EX1/EX2、SmGSTF2-EX1/EX2為引物，以葉cDNA為模板，進行PCR擴增得到目的基因片段。用限制性內切酶HⅠ和Ⅰ對PET-30a載體進行雙酶切。利用無縫克隆試劑盒 (中美泰和公司) 將目的基因連接到雙酶切后的載體上，再將重組載體轉化到大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞中。挑取陽性菌落進行測序，然后將測序驗證無突變的重組表達菌接種到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以1∶100的比例擴大培養(yǎng)至600為0.6左右，加入IPTG (終濃度為0.1 mmol/L) 誘導蛋白在大腸桿菌BL21中表達，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。將誘導表達后的菌液4 ℃、10 000×離心3 min收集菌體，加入適量緩沖液A (20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4， pH 7.5) 進行重懸，在冰上進行超聲波破碎10 min，將破碎后的菌液在4 ℃、10 000×離心10 min，取少量菌液、超聲破碎后的離心上清液和沉淀，經SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達情況。用緩沖液A平衡Ni 柱 (購自于Amersham Pharmacia Biotech公司)，將超聲破碎離心后的上清液上柱，待蛋白結合30 min后，用緩沖液A洗脫雜蛋白，再用緩沖液B (0.5 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.5) 洗脫目的蛋白，收集目的蛋白洗脫峰進行下一步酶學活性分析。

1.8 SmGSTF1和SmGSTF2重組蛋白的酶學活性檢測

參照Habig等[18]的方法測定重組蛋白對CDNB、DCNB和NBC的催化活性，參照Ricci等[19]的方法測定重組蛋白對NBD-Cl的催化活性，參照Edwards等[20]的方法測定重組蛋白對DHA、fluorodifen和Cum-OOH的催化活性。在25 ℃下，使用紫外分光光度計 (Evolution 300)進行所有的測活反應。以CDNB和GSH為底物，每5 ℃作為一個梯度，測定重組蛋白在15?65 ℃之間的活性。參照Yuen等[21]的方法，在pH 5?10范圍內測定重組蛋白在不同pH下的催化活性。

通過測定重組蛋白在不同CDNB和GSH濃度下的催化活性分析其動力學常數。分析重組蛋白對于GSH的動力學時，CDNB的濃度保持1.0 mmol/L不變，測定重組蛋白在不同GSH濃度 (0.1?1.0 mmol/L) 時的催化活性。分析重組蛋白對于CDNB的動力學時，保持GSH濃度為1.0 mmol/L不變，測定其在不同CDNB濃度 (0.6?4.0 mmol/L) 時的催化活性。利用Hyper32程序，通過線性回歸分析獲得其酶動力學參數。

2 結果與分析

2.1 江南卷柏Phi類GST基因的克隆與基因結構分析

以江南卷柏cDNA為模板，利用引物SmGSTF1-EX1/EX2和SmGSTF2-EX1/EX2克隆得到和的cDNA序列。和都包含648個堿基的開放閱讀框，編碼215個氨基酸殘基的蛋白質 (圖1)，預測的蛋白分子量分別為24.03 kDa和23.99 kDa。SmGSTF1和SmGSTF2之間只有4個氨基酸差異，氨基酸序列相似性為98.14%。通過保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，擴增得到的2個基因都具有Phi類GST的保守結構域，說明我們擴增得到的是Phi類GST基因。和基因組序列全長都是768 bp，都含有2個內含子，2個內含子長度都為60 bp。

圖1 SmGSTF1和SmGSTF2的氨基酸序列

2.2 江南卷柏Phi類GST基因的系統(tǒng)發(fā)生關系分析

將江南卷柏Phi類GST和苔蘚植物小立碗蘚、裸子植物油松、單子葉植物水稻、以及雙子葉植物擬南芥和毛果楊的Phi類GST共同進行系統(tǒng)發(fā)生分析。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示江南卷柏的兩個Phi類GST與其他物種的Phi類GST聚在一起，而且其位于系統(tǒng)發(fā)育樹的內部，說明本研究擴增得到的2個基因為Phi類GST (圖2)。和聚在一起，說明和是在江南卷柏與其他物種分化之后通過基因重復產生的。

2.3 江南卷柏和基因的組織表達模式分析

采用半定量RT-PCR方法研究和基因在江南卷柏不同組織 (根、莖和葉) 中的表達分布。研究發(fā)現(xiàn)和基因在江南卷柏根、莖和葉中均表達，且這2個基因在所有的循環(huán)中都有表達 (圖3)，說明和可能是組成型表達基因，在江南卷柏的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

2.4 江南卷柏SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的三維結構

利用SWISS-MODEL網站模擬江南卷柏SmGSTF1和SmGSTF2的三維結構 (圖4A)。優(yōu)化后的構象用Profile-3D進行校驗，可以看出絕大部分氨基酸殘基得分都是正值 (圖4B)，位于合理的范圍，表明模擬的結構具有比較高的可信度。SmGSTF1和SmGSTF2的三維結構包括2個結構域：由α螺旋和β折疊組成的N末端結構域 (N-domain) 以及由6個α螺旋組成的C末端結構域 (C-domain)。蛋白結構比較發(fā)現(xiàn)2個蛋白的結構高度相似。

圖4 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白三維結構的比較

2.5 江南卷柏SmGSTF1和SmGSTF2重組蛋白的表達和純化

將重組表達載體pET30a/SmGSTF1和pET30a/SmGSTF2分別轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，經IPTG誘導，SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)SmGSTF1和SmGSTF2重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達 (圖5)。將重組蛋白經Ni柱親和層析純化并進行蛋白凝膠電泳，SDS-PAGE結果顯示重組蛋白的分子量與預測的SmGSTF1和SmGSTF2蛋白大小一致，而且雜帶較少，表明純化蛋白的純度較高。

圖5 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在大腸桿菌BL21中的表達和純化

2.6 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的底物活性分析

SmGSTF1和SmGSTF2蛋白對不同底物的催化活性如表2所示，SmGSTF1和SmGSTF2對CDNB、NBD-Cl和NBC都具有酶學活性，對DCNB和DHA沒有催化活性。另外SmGSTF1對Fluorodi 和Cum-OOH有活性，而SmGSTF2對它們沒有活性。我們發(fā)現(xiàn)，同一蛋白對不同底物的活性相差很大，如SmGSTF2對CDNB的活性是其對NBC的22.3倍。不同蛋白對同一底物的活性變化也很大，例如，SmGSTF1和SmGSTF2對CDNB的活性相差不大，而SmGSTF1對NBC的活性是SmGSTF2的14.67倍。

表2 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的酶學活性

Table 2 Specific enzymatic activities of the recombinant SmGSTF1 and SmGSTF2 towards different substrates

Values shown are±, calculated from three replicates, n.d. represents no detected.

2.7 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的動力學分析

分別以GSH和CDNB為底物，對SmGSTF1和SmGSTF2蛋白進行酶動力學分析，結果如表3所示。米氏常數m表示酶對底物的親和力，我們發(fā)現(xiàn)SmGSTF1和SmGSTF2蛋白對GSH的m值遠小于它們對CDNB的m值，說明它們對GSH比CDNB有更高的親和力，且SmGSTF1相比于SmGSTF2對GSH有更高的親和力。catm表示酶對底物的催化效率，我們發(fā)現(xiàn)，SmGSTF1對GSH的催化效率是SmGSTF2的1.94倍，而它們對CDNB的催化效率沒有差別。

表3 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白對GSH和CDNB的動力學

Table 3 Kinetic constants of SmGSTF1 and SmGSTF2 towards GSH and CDNB (Values shown are±, calculated from three replicates)

2.8 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的pH依賴性和溫度依賴性分析

以CDNB和GSH為底物，對SmGSTF1和SmGSTF2蛋白進行pH依賴性分析，結果如 圖6所示。pH依賴性顯示，在pH 5.0?8.0時，其催化活性逐漸升高，在pH 7.0?8.5時，兩個蛋白都可以保持80%以上的相對活性，且在pH 8.0時達到最高活性，pH 9.5時仍都能保持40%以上的相對活性，說明SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在偏堿性的條件下有更高的催化作用。

圖6 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在不同pH下的活性

以CDNB為底物，檢測SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在不同溫度下的催化活性，溫度依賴性結果如圖7所示，我們發(fā)現(xiàn)SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在較高的溫度下有比較高的催化活性，在15?45 ℃的范圍內，SmGSTF1和SmGSTF2蛋白的催化活性不斷增高。在40?55 ℃時，兩種蛋白都保持了80%以上的相對活性，并在45 ℃時達到最高活性，且在65 ℃也仍保持40%以上的相對活性。

圖7 SmGSTF1和SmGSTF2蛋白在不同溫度下的活性

3 討論

谷胱甘肽轉移酶在植物體內發(fā)揮著重要作用，如響應環(huán)境脅迫，細胞信號轉導和抵抗病原菌入侵等[22-26]。根據我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，在雙子葉植物毛果楊中共有9個Phi類GST基因，單子葉植物水稻中有17個Phi類GST基因，裸子植物油松中有7個Phi類GST基因，苔蘚植物小立碗蘚中有10個Phi類GST基因[16-17]，而本研究中江南卷柏只有兩個Phi類GST基因，說明相對于其他類型植物，蕨類植物可能需要更少的Phi類GST基因。另外，在毛果楊的9個Phi類GST基因中有7個是組成型表達[11]，油松中的7個Phi類GST基因都是組成型表達[16]，本研究克隆到的2個江南卷柏Phi類GST基因在根、莖和葉中均有表達，可能是組成型表達基因，預示著Phi類GST基因可能在江南卷柏生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。

系統(tǒng)發(fā)生關系分析發(fā)現(xiàn)，和在進化樹上聚在一起，而且兩個基因的序列高度相似，氨基酸序列相似性為98.14%，表明它們可能是在江南卷柏與其他類型植物分化之后最近通過基因重復產生的，然而蛋白活性分析發(fā)現(xiàn)，SmGSTF1蛋白對CDNB、NBD-Cl、NBC、Fluorodifen和Cum-OOH都有活性，而SmGSTF2蛋白只對CDNB、NBD-Cl和NBC有活性，說明這兩個蛋白的底物譜已經發(fā)生了分化。對NBD-Cl的催化活性，SmGSTF1是SmGSTF2的1.89倍，對NBC的催化活性，SmGSTF1是SmGSTF2的14.67倍，蛋白生化活性差異預示著SmGSTF1和SmGSTF2存在著功能分化。

酶動力學分析發(fā)現(xiàn)，SmGSTF1蛋白對CDNB的親和力是SmGSTF2 的2.4倍，然而由于SmGSTF1對CDNB的轉換數cat值比SmGSTF2高，導致兩種蛋白對CDNB的催化效率catm值沒有差別，說明在SmGSTF1和 SmGSTF2對CDNB的催化反應中，與底物結合以及與底物結合后所發(fā)生的電子轉移或者產物的釋放速率對于兩個蛋白的催化功能都很重要。

蕨類植物是最早脫離水體束縛，最早適應陸地生態(tài)環(huán)境和最早出現(xiàn)維管組織的類群。蕨類植物從水生到陸生，體內必然存在一套機制來適應復雜的陸地環(huán)境。對SmGSTF1和SmGSTF2在不同pH和溫度條件下進行活性分析發(fā)現(xiàn)，它們在pH 6.0?9.5，以及30?65 ℃范圍內均具有較高的催化活性，表明這兩個蛋白能在比較寬的環(huán)境變化條件下發(fā)揮功能，預示著SmGSTF1和SmGSTF2對于江南卷柏適應復雜的陸地環(huán)境具有重要作用。

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Molecular characteristics of two Phi glutathione-transferases in

Yuanjie Zhang, Zhiling Yang, and Hailing Yang

,,100083,

Glutathione-transferase (GST) is important in plants to resist various stresses. In this study, two Phi GST genes (and) were cloned from.andgenes encode proteins of 215 amino acid residues. Gene expression analysis showed that the two genes were expressed in roots, stems and leavesThe recombinant SmGSTF1 and SmGSTF2 proteins were overexpressed in, and purified by Ni-affinity chromatography. SmGSTF1 and SmGSTF2 had the catalytic activity towards 1-Chloro-2,4-Dieitrobenzene, 4-Chloro-7-nitro-1,2,3-benzoxadiazole (NBD-Cl), and 4-Nitrobenzyl chloride substrates. SmGSTF1 also had the activity towards Fluorodifen and Cumyl hydroperoxide (Cum-OOH), whereas SmGSTF2 not. The enzyme kinetics analysis showed that SmGSTF1 and SmGSTF2 had high affinity towards glutathione, and low affinity towards 1-Chloro-2, 4-Dieitrobenzene. The enzymatic activity of SmGSTF1 and SmGSTF2 had high catalytic activity between pH 7 and 8.5, and between 45 and 55 °C. SmGSTF1 and SmGSTF2 may have an important role in the resistance ofagainst stress.

, glutathione-transferase, gene expression, enzymatic activity

October 16, 2015; Accepted: January 6, 2016

張元杰, 楊志靈, 楊海靈. 江南卷柏Phi類谷胱甘肽-轉移酶的分子特性. 生物工程學報, 2016, 32(7): 927–936.

Zhang YJ, Yang ZL, Yang HL. Molecular characteristics of two Phi glutathione-transferases in. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 927–936.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31270641).

Corresponding author: Hailing Yang. Tel/Fax +86-10-62590843; E-mail: yhailing77@163.com

國家自然科學基金 (No. 31270641) 資助。

網絡出版時間：2016-01-26 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160126.0933.002.html

(本文責編 陳宏宇)