豬基因PCR-SSCP分析條件優(yōu)化的研究

劉燕河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院

豬基因PCR-SSCP分析條件優(yōu)化的研究

劉燕
河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院

PCR-SSCP技術(shù)作為一種區(qū)分檢測(cè)基因組之間微小差異的有效方法，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏和適用于大量樣品篩選的特點(diǎn)。但影響基因測(cè)驗(yàn)的因素很多，為探討豬基因PCR-SSCP分析的優(yōu)化條件，經(jīng)過反復(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在凝膠濃度12%，電壓4℃120v12h或室溫下250v10min后120v10h，甘油濃度0%，電泳溫度4℃等條件下效果最佳，條帶最清晰。

豬PCR-SSCP條件優(yōu)化

單鏈構(gòu)象多態(tài)性 （sing1e strand conformation，SSCP）在分子標(biāo)記領(lǐng)域和基因圖譜的構(gòu)建方面很受研究者的青睞，但試驗(yàn)效果易受諸多因素的影響［1,2］。此次實(shí)驗(yàn)根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室和作者所積累的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)豬基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析的試驗(yàn)條件進(jìn)行了研究，主要從凝膠的濃度、電壓的大小、甘油的濃度及溫度的高低等因素出發(fā)，進(jìn)行分析比較，旨在從中篩選出一種效果比較理想的實(shí)驗(yàn)條件，以提高該方法對(duì)豬基因突變檢測(cè)的成功率，為進(jìn)一步深入相關(guān)研究建立基礎(chǔ)［2,3］。

一、試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

2014年8月1日～2015年6月1日牧業(yè)工程學(xué)院生物分子公開實(shí)驗(yàn)室。

二、材料與方法

1.材料

（1）DNA提取試劑黃泛區(qū)南廠杜洛克豬血樣加ADE抗凝,（標(biāo)號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）、5M/LKI溶液、氯仿∶異戊醇（24∶1）、生理鹽水、去離子水、異丙醇、70%預(yù)冷酒精、無(wú)水乙醇、一倍TE緩沖液等。

（2）PCR試劑及檢測(cè)試劑Taq酶、引物1、引物2、10×buffer、dNTP，Agarose（瓊脂糖）TAE緩沖液、EB染料、1oading Buffer染色劑等。

（3）PAGE凝膠試劑30%Acry1amide、5×TBE、10%過硫酸銨 （AP）、TEMED,20%NaOH、0.1%硝酸銀、1% TBE、甲醛、醋酸等。

（4）主要儀器。離心機(jī)（博勵(lì)行儀器有限公司,D-37520）、電子萬(wàn)用爐（天津市泰斯特儀器有限公司）、PCR儀（PTC-100，MJ Research，INC）、DYY-Ⅲ型電泳儀（北京六一儀器廠）、立式電泳槽（北京六一儀器廠）、凝膠成像系統(tǒng)（Ge1-Logic100，Kodak）、玻板、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司,型號(hào)101-2s）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（上海伸安醫(yī)療器械廠,LD2X-408Ⅰ型）等。

2.主要方法

（1）DNA提取。①冷凍抗凝全血在室溫下溶化后混勻，取300u1移至EP管中，加入1m1無(wú)菌雙蒸水來(lái)回倒轉(zhuǎn)十次溶解紅細(xì)胞，13000r/min離心5min,棄上清，重復(fù)兩次。②棄上清，加入1m1 0.9%的生理鹽水，混勻，洗滌白細(xì)胞。13000r/min,離心5min棄上清。③向沉淀中加入100u1 5mo1/L碘化鉀溶液，漩渦振蕩30s,加入0.9%的生理鹽水300μg，然后立即加入450mg氯仿：異戊醇混合溶液 （24∶1），充分混勻10min,13000r/min,離心5min。④取上清到另一EP管中，加等體積氯仿：異戊醇（24∶1），輕輕混勻，13000r/min，離心5min。⑤取上清到另一EP管中，加入等量異丙醇或兩倍體積的無(wú)水乙醇，充分混勻，見有白色絮狀物即為DNA,常溫沉淀30min～1h。⑥加入預(yù)冷的200mg70%乙醇和無(wú)水乙醇，洗滌DNA,10000r/min離心3min，重復(fù)一次。⑦棄上清，待DNA晾干，加入50mg雙蒸水，過夜溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件。①18mg的反應(yīng)體系：模板3u1，DNTP：2.5u1,buffer：2.5u1，引物上下個(gè)：0.8u1×2=1.6u1，Taq：0.4u1,水：11u1。②PCR條件：預(yù)變性：94℃，5min；變性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：72℃，50s；保持10min。30個(gè)循環(huán)。③PCR產(chǎn)物檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的純度，取Agarose0.3g，25mgTAE緩沖液在電熱爐上加熱至沸1～2min，加入EB染料3u1，冷卻至不燙手，倒入加有點(diǎn)樣梳的制膠漕中，直到凝膠變?yōu)椴煌该鲿r(shí)，取5u1PCR產(chǎn)物與2u16×1oading Buffer染料混勻，用點(diǎn)樣槍加入點(diǎn)樣孔中，90v電壓，30min后,紫外燈下檢查PCR產(chǎn)物的純度。結(jié)果如圖-1所示。

圖1

④PCR產(chǎn)物變性：加入變性劑在DNA熱變性儀中94℃變性10min，取出迅速放入冰盒中冷卻。

（3）SSCP分析：在研究以下條件時(shí)，其他條件保持一致。根據(jù)PAGE不同濃度配方表配制用0.1%硝酸銀溶液染色15min后，用蒸餾水再洗一次，直接用20%的氫氧化鈉溶液顯色約15min左右，最后直接用冰乙酸蒸餾水終止染色。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1.凝膠的濃度

實(shí)驗(yàn)中以豬血全基因組中的內(nèi)含子3基因?yàn)樵囼?yàn)材料，用8%、12%和15%的凝膠電泳，經(jīng)過銀染后比較發(fā)現(xiàn)12%的凝膠電泳的條帶較為清晰，效果最好，可用于SSCP分析（如圖2～4）。凝膠的組成見表1，電泳結(jié)果見圖-2-3-4。圖2的分析條件較為成熟。

圖2

圖3　

圖4

表1　不同濃度PAGE凝膠的配方表

2.電壓的大小

由于SSCP電泳凝膠的濃度較高，所以如果電泳電壓太大，如300v,則產(chǎn)熱量大，導(dǎo)致中間跑得快而兩邊較慢，使帶型成為弧形，有微笑效應(yīng)（圖6），影響電泳效果。經(jīng)過多次試驗(yàn)比較，在室溫下，一般垂直平板，電泳電壓以250v10min，120v10h為宜。而在4℃時(shí)以低電壓為宜，時(shí)間為10～12h效果更好（如圖5）。

圖5

圖6

3.甘油或其他變性劑

凝膠中加入低濃度的變性劑，如5%～10%甘油，5%尿素或甲酰胺，10%二甲亞砜（DMSo）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因?yàn)檩p微改變ssDNA的構(gòu)象，增加分子表面積，降低了DNA的泳動(dòng)率。甘油對(duì)不同樣品的SSCP條帶的泳動(dòng)影響效果不一樣，它對(duì)某些條帶的泳動(dòng)有促進(jìn)作用，而對(duì)另一些則可能有抑制作用［4］，所以有些變異序列只能在沒有甘油的凝膠中被檢出。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘油濃度為0%效果更明顯。

4.電泳溫度

溫度恒定是SSCP分析的關(guān)鍵因素，在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)室溫下的條帶明顯差于4℃。室溫下溫度較高，在電泳時(shí)，溫度還會(huì)繼續(xù)升高，試驗(yàn)結(jié)果顯示在室溫下條帶有“微笑”狀。為確保電泳溫度相對(duì)恒定，應(yīng)減少凝膠厚度，降低電壓，采取有效的空氣冷卻或循環(huán)水冷卻等措施，也可在冰箱的冷藏柜中電泳。在沒有冷卻裝置的情況下，可在開始的10min內(nèi)用較高的電壓如250v，然后在降低電壓到120v電泳10h，也可收到滿意的條帶。

5.豬基因PCR-SSCP試驗(yàn)的最佳優(yōu)化條件

經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)及對(duì)照，豬基因PCR-SSCP試驗(yàn)的最優(yōu)條件為：凝膠濃度12%，甘油濃度0%，電壓為室溫下在開始的10min內(nèi)用較高的電壓如250v，然后在降低電壓到120v電泳10h,但是4℃時(shí)低電壓（120v）為宜，溫度4℃時(shí)染色后條帶細(xì)而清晰，能夠準(zhǔn)確分辨各基因型（如圖7）。

圖7

四、討論

1.凝膠濃度

PCR產(chǎn)物電泳后條帶必須保證單一無(wú)雜帶，這是PCR-SSCP成功的基本和前提條件。魏太云等認(rèn)為，凝膠濃度只影響電泳遷移率，通常選用的凝膠濃度6%～12%，凝膠濃度越高DNA泳動(dòng)越慢，各單鏈之間距離越短［11］。而本實(shí)驗(yàn)恰恰說明凝膠濃度和交聯(lián)度對(duì)實(shí)驗(yàn)影響最大，因?yàn)槟z濃度和交聯(lián)度決定了凝膠的孔徑?？讖叫。瑔捂溨g就能夠分得更開，從而使條帶更清晰。凝膠的厚度盡量要薄，可減少在泳動(dòng)過程中產(chǎn)生的熱量而影響實(shí)驗(yàn)效果。

2.電壓大小

為了使單鏈DNA保持一定的穩(wěn)定立體構(gòu)象，SSCP應(yīng)在低溫下進(jìn)行（一般4～15℃之間）。在電泳過程中，電壓過高是引起溫度升高的主要原因。溫度過大會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)“微笑”條帶或其他問題。另外，凝膠薄一點(diǎn)更好，凝膠越厚，電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量就越大。因此，在沒有冷卻裝置的電泳槽上進(jìn)行SSCP時(shí)，開始的 5min應(yīng)用較高的電壓（250V），以后用低壓進(jìn)行電泳。這主要是由于開始的高電壓可以使不同立體構(gòu)象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會(huì)升高。本實(shí)驗(yàn)中，PCR產(chǎn)物經(jīng)變性電泳后，出現(xiàn)的條帶較多，主要因?yàn)橛械膯捂溞纬啥喾N構(gòu)象。如果上樣量一定，出現(xiàn)的條帶越多，那條帶就會(huì)越淡，所以應(yīng)該加大上樣量并提高PCR產(chǎn)物和變性緩沖液的比例。

3.甘油濃度

目前普遍對(duì)加不加甘油的看法是：有的片段加，對(duì)遷移有促進(jìn)作用；有的片段不加，反而促進(jìn)遷移。有些學(xué)者認(rèn)為甘油的濃度在5%～10%時(shí)SSCP分析的結(jié)果較好［5］。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在同等條件下0%甘油濃度的凝膠中條帶整齊、緊湊，帶型特征明顯，甘油濃度增加反而會(huì)使條帶不清或帶型特征不明，在膠中的遷移距離縮短。所以，在SSCP分析過程中是否添加甘油、濃度究竟多大，應(yīng)根據(jù)不同基因片段進(jìn)行調(diào)整。

4.溫度高低

本次試驗(yàn)中分離物條帶的分離程度受溫度變化的影響很大，由于在電泳時(shí)，溫度會(huì)升高，為確保電泳溫度相對(duì)恒定，應(yīng)減少凝膠厚度，降低電壓，采取有效的空氣冷卻或循環(huán)水冷卻等措施，也可在冰箱的冷藏柜中電泳。如果沒有冷卻裝置，則可在開始的幾分鐘用較高的電壓（250v），然后在降低電壓到100v左右開始電泳，這樣既能使單鏈的DNA初步分開，又不使溫度升高。

［1］魏太云，林含新，謝聯(lián)輝．PCR-SSCP分析條件的優(yōu)化［J］．福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，（3）：22-25．

［2］何俊,曲湘勇,黃生強(qiáng)等.鵝基因PCR-SSCP分析條件優(yōu)化的研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī),2006.

［3］歐陽(yáng)建華,黃建安.PCR-SSCP技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊,2002.

［4］李玉梅,姚紀(jì)元,吳靜等.PCR-SSCP技術(shù)的研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào),2007.

［5］蔡輝國(guó),陳佩貞,張立冬等.PCR-SSCP分析實(shí)踐［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1995.