花絨寄甲Prx6基因的確定和表達(dá)分析

郭瑞堅，郝春鳳，張正青，張　偉，王化鵬，李孟樓

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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花絨寄甲Prx6基因的確定和表達(dá)分析

郭瑞堅，郝春鳳，張正青，張偉，王化鵬，李孟樓

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 獲得花絨寄甲過氧化物還原酶 6基因(Prx6)，分析其在花絨寄甲發(fā)育和衰老過程中相對表達(dá)量的變化，以進(jìn)一步揭示花絨寄甲衰老的分子機(jī)制?！痉椒ā?基于花絨寄甲成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得Prx6基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)，分析Prx6在花絨寄甲發(fā)育和衰老階段的表達(dá)量?！窘Y(jié)果】 從花絨寄甲成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲取了2個Prx6基因，分別命名為Prx6-1和Prx6-2，其開放閱讀框長度依次為654和672 bp，分別編碼218和224個氨基酸。多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這2個基因均屬于1-Cys家族，并且與鞘翅目的赤擬谷盜Prx6-1和Prx6-2的同源性最高，分別為71%和82%。發(fā)育階段的定量結(jié)果表明，Prx6-1在2齡幼蟲、蛹和初孵成蟲體內(nèi)的表達(dá)量較高，在6齡幼蟲體內(nèi)的表達(dá)量最低；Prx6-2在2齡和4齡幼蟲體內(nèi)表達(dá)量較高，在6齡幼蟲體內(nèi)表達(dá)量最低。在成蟲衰老過程中，2個Prx6基因表達(dá)量整體上呈現(xiàn)出隨羽化后時間的延長而增加的趨勢?！窘Y(jié)論】 花絨寄甲Prx6基因影響其發(fā)育，特別是在2齡和6齡幼蟲期。在花絨寄甲衰老過程中，2個Prx6基因的表達(dá)量隨其羽化后時間的延長而升高。

花絨寄甲；Prx6基因； 實時熒光定量 PCR； 幼蟲發(fā)育階段；成蟲

好氧生物代謝活動中，活性氧(Reactive oxygen species， ROS)總是作為其副產(chǎn)物而產(chǎn)生，其主要包括超氧陰離子、過氧化氫、一氧化氮和羥自由基。ROS會對所有的生物大分子造成損傷，引起蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化和DNA鏈斷裂[1]。為了對抗ROS，好氧生物形成了抗氧化酶系統(tǒng)作為保護(hù)機(jī)制，抗氧化酶系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物還原酶(Prxs)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)[2]。其中Prxs包括很多從一系列真核和原核生物中鑒定出來的抗氧化蛋白，它們以硫氧還蛋白作為氫離子供體清除生物體內(nèi)的過氧化氫[3]。作為一種新的、硫醇特異性的抗氧化酶，Prxs近年來受到了廣泛關(guān)注[4]。根據(jù)催化反應(yīng)中半胱氨酸(Cysteine,Cys)的數(shù)目，Prxs目前分為2類：1-Cys型和2-Cys型。與1-Cys型相比，2-Cys型在C端還含有第2個保守的Cys殘基[4-5]。2-Cys根據(jù)Cys殘基的位置又進(jìn)一步分為典型2-Cys和非典型2-Cys 2類。所有的Prxs都有著相同的催化機(jī)制，它們的一個活性Cys殘基被過氧化底物還原成次磺酸。

在昆蟲中，Prxs基因已經(jīng)從果蠅、埃及伊蚊、意大利蜜蜂和家蠶等中分離出來[6-8]。果蠅的基因組有5個Prxs基因，所有的果蠅Prxs基因在二硫蘇糖醇存在條件下均可以清除H2O2，使果蠅DNA等大分子免受體內(nèi)氧化壓的破壞[9]。在家蠶中分離出一個屬于2-Cys型的Prxs基因，該基因可以被外界的溫度刺激和病毒侵染誘導(dǎo)[10]。最近，從家蠶體內(nèi)分離得到的另一個Prxs基因，其重組蛋白同樣表現(xiàn)出了清除H2O2的抗氧化性[11]。以上研究均表明，Prxs基因在清除昆蟲體內(nèi)的活性氧時具有重要作用。

花絨寄甲是大型天牛類林木蛀干害蟲最為有效的天敵昆蟲[12-13]，它的幼蟲寄生在天牛末齡幼蟲和蛹上[14-15]?；ńq寄甲的成蟲有著相對較長的壽命，在實驗室可以飼養(yǎng)8年以上[16]。到目前為止已經(jīng)有關(guān)于花絨寄甲分子方面的研究，但還沒有關(guān)于其Prxs基因的報道，另外對Prxs基因在花絨寄甲上的生理作用還不是很清楚。本研究從分子水平對花絨寄甲體內(nèi)Prxs的生理作用進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步揭示花絨寄甲衰老的分子機(jī)制提供參考。

1　材料與方法

1.1供試?yán)ハx

花絨寄甲的幼蟲、蛹和成蟲由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林害蟲生物防治實驗室提供。按照試驗需要收集1～6齡花絨寄甲幼蟲、蛹、初孵成蟲及羽化后2，4，10，12，18，20，26，30個月蟲齡的成蟲。花絨寄甲成蟲用人工飼料(主要成分為蠶蛹粉)飼養(yǎng)在溫度為(23±1) ℃、相對濕度70%～80%、光/暗周期為16 h/8 h的人工氣候箱內(nèi)。

1.2花絨寄甲Prxs基因的檢索

花絨寄甲轉(zhuǎn)錄組中的所有序列已經(jīng)通過美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI(National center for biotechnology information)的Blastx工具在非冗雜(Non-redundant,Nr)數(shù)據(jù)庫中得到注釋，注釋的截點E值為1.0×10-5。在轉(zhuǎn)錄組的注釋文件中檢索關(guān)鍵詞Prxs或者Peroxiredoxins,篩選出花絨寄甲的Prxs序列。

1.3序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

采用NCBI中的ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具，分析Prxs可能的開放閱讀框并翻譯為氨基酸。獲得的氨基酸序列通過ExPASy的compute pI/Mw工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測其分子質(zhì)量和等電點。通過Blast將花絨寄甲Prxs cDNA及其編碼的氨基酸序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的其他物種相應(yīng)序列進(jìn)行比較，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫下載其他物種的Prxs氨基酸序列，利用ClastalW軟件將其與花絨寄甲的Prxs進(jìn)行序列比對，然后用Mega 5.02分析其演化關(guān)系，采用Neighbor-joining (NJ)算法構(gòu)建進(jìn)化樹，置信度設(shè)置為1 000[17]。

1.4總RNA的提取和cDNA合成

分別取1～6齡的幼蟲、蛹和初孵成蟲等不同發(fā)育階段的花絨寄甲，每發(fā)育階段3個重復(fù)，每重復(fù)15頭，備用；同時取羽化后2，4，10，12，18，20，26，30個月不同蟲齡的花絨寄甲，每個時間點3個重復(fù)，每重復(fù)4頭(雌、雄各半)，備用。用Trizol reagent 試劑盒(Sangon，上海)提取上述花絨寄甲的總RNA，在Maestro-NANO UV spectrophotometer上用分光光度法測定總RNA的質(zhì)量和濃度?？俁NA用DNA I(Takara，日本)去除DNA污染后，每個重復(fù)各取1 μg總RNA，構(gòu)建20 μL的反應(yīng)體系，使用oligo (dT)18引物和Moloney Murine Leukemia virus (M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶(Sangon，上海)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。

1.5實時熒光定量表達(dá)分析

在Bio-rad IQ5儀器上用實時熒光定量(RT-qPCR)技術(shù)檢測Prx的表達(dá)量，染料選用SYBR Green Mix (CWBIO, 北京)，內(nèi)參基因根據(jù)宋旺等[18]的試驗結(jié)果選用EF-1α和α-Tubulin。引物用Primer premier 5.0軟件設(shè)計，由上海生工合成。每對定量引物(表1)通過5×稀釋的模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線驗證，Prx6-1、Prx6-2、EF-1α和α-Tubulin擴(kuò)增效率分別為1.060，1.030，1.005和 0.997。

RT-qPCR采用25 μL的反應(yīng)體系： 1 μL cDNA模板，1 μL上游引物，1 μL下游引物，9.5 μL無菌水，12.5 μL SYBR熒光染料。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min； 95 ℃ 30 s； 58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，50個循環(huán)。65～95 ℃ 每1 ℃保持10 s用于記錄熔解曲線，以確定擴(kuò)增條帶的特異性。

表 1　實時熒光定量試驗中所用引物的信息Table 1　Primes used for real-time PCR detection

1.6數(shù)據(jù)處理

試驗所得的數(shù)據(jù)用相對定量法(2-ΔΔCt)計算分析[19]。對于不同蟲態(tài)的Prx6-1和Prx6-2表達(dá)量分析以Prx6-1在1齡幼蟲的表達(dá)量為參照(設(shè)為1)；不同蟲齡的Prx6-1和Prx6-2表達(dá)量分析則以Prx6-1在羽化后2月的成蟲表達(dá)量為參照(設(shè)為1)。試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用SPSS中的Tukey方法;用origin 8.5作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1花絨寄甲Prxs基因的檢索和序列分析

本研究通過搜索花絨寄甲成蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，得到2個Prxs基因，通過NCBI的Blastp工具在線比對，發(fā)現(xiàn)其與其他昆蟲的Prx6基因同源性最高，分別命名為Prx6-1和Prx6-2 (GenBank 登錄號分別為KP191594和KP191595)?；ńq寄甲2個Prx6基因全長分析結(jié)果如圖1所示。圖1表明，Prx6-1和Prx6-2都含有1個保守的Cys，因此屬于Prxs基因的1-Cys型，并且都具有Prxs基因家族保守的信號模體(PVCT)。Prx6-1和Prx6-2基因的開放閱讀框長度分別為654和672 bp，分別編碼218和224個氨基酸，預(yù)測的等電點分別為5.53和5.89，分子質(zhì)量分別約為24.5和25.3 ku。

2.2花絨寄甲Prx6基因的序列同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

Blast分析結(jié)果(圖2)表明，花絨寄甲Prx6-1與赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)Prx6-1 氨基酸序列一致性最高，為71%；與埃及伊蚊(Aedesaegypti)的一致性較低。花絨寄甲Prx6-2與赤擬谷盜的Prx6-2同源性最高，為82%；與印度跳蟻的Prx6的同源性也較高，為78%。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖3) 表明，供分析物種的Prx6基因在進(jìn)化樹上分為昆蟲和脊椎動物2個獨立的進(jìn)化分支?；ńq寄甲的Prx6基因和NCBI中其他昆蟲已登錄的Prx6基因聚在一起，形成了昆蟲進(jìn)化支，其中花絨寄甲的Prx6-1基因與同屬鞘翅目的赤擬谷盜Prx6-1(XP_970660.2)遺傳距離最近。花絨寄甲Prx6-2也與赤擬谷盜的Prx6-2(XP_968419.1)遺傳距離最近，并與雙翅目埃及伊蚊和膜翅目印度跳蟻的Prx6基因聚在一簇。而脊椎動物進(jìn)化支中的智人、褐家鼠和家鼠的Prx6基因聚在一起，與昆蟲的Prx6基因遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖 1花絨寄甲Prx6-1和Prx6-2基因的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列

正方形為Prx6基因的起始密碼子和終止密碼子，下劃線為保守的特征序列，星號為保守的Cys殘基

Fig.1Nucleotide and predicted amino acid sequences ofPrx6-1 andPrx6-2 inDastarcushelophoroides

The start codon and the terminal codon are boxed with black square.The conserved motif (PVCT) is underlined,while the conserved Cys residue is indicated with an asterisk

圖 2　花絨寄甲與其他物種的Prx6蛋白氨基酸多序列比對結(jié)果 黑色背景表示一致性為100%，灰色背景表示一致性≥75%。星號標(biāo)示保守的Cys殘基，方框標(biāo)示保守的1-Cys Prx 信號模體(PVCT)。DhPrx6-1和DhPrx6-2.花絨寄甲Prx6-1和Prx6-2； TcPrx6-2.赤擬谷盜Prx6-2； HsPrx6.印度跳蟻 Prx6；AaPrx6.埃及伊蚊Prx6；HsPrx6-1.智人Prx6-1Fig.2　Multiple alignment of amino acid sequence of Prx6 from Dastarcus helophoroides and other species The dark black shade indicates 100% identity,the grey shade indicates ≥75% identity. The conserved Cys residues are indicated by an asterisk,while conserved 1-Cys Prx signature motifs (PVCT) are boxed with blue line.DhPrx6-1 and DhPrx6-2.Dastarcus helophoroides Prx6-1 and Prx6-2; TcPrx6-2.Tribolium castaneum Prx6-2;HsPrx6.Harpegnathos saltator Prx6; AaPrx6.Aedes aegypti Prx6;HsPrx6-1.Homo sapiens Prx6-1

圖 3　花絨寄甲Prx6基因與GeneBank中已登錄的其他物種Prx6基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3　Phylogenetic tree based on amino acid sequences of Prx6 from Dastarcus helophoroides and other species

2.3Prx6在不同發(fā)育階段花絨寄甲體內(nèi)的表達(dá)

采用RT-qPCR方法研究Prx6基因在花絨寄甲1～6齡幼蟲、蛹和初孵成蟲中的表達(dá)情況，結(jié)果見圖4。由圖4可知，Prx6-1和Prx6-2在花絨寄甲各個發(fā)育階段均有表達(dá)，并且整體上Prx6-2的表達(dá)量明顯高于Prx6-1，如在1齡幼蟲中Prx6-2的表達(dá)量是Prx6-1的4.08倍。Prx6-1 在2齡幼蟲、蛹和初孵成蟲中的表達(dá)量高于其他發(fā)育時期，分別是1齡幼蟲表達(dá)量的3.78，2.59和1.81倍。Prx6-1在6齡幼蟲體內(nèi)的表達(dá)量最低，僅為1齡幼蟲的21%。Prx6-2在4齡幼蟲體內(nèi)的表達(dá)量最高，在6齡幼蟲體內(nèi)的表達(dá)量最低。

圖 4Prx6基因在不同發(fā)育階段花絨寄甲體內(nèi)的相對表達(dá)量

1～6.1～6齡幼蟲；P.蛹；NA.初孵成蟲。柱上標(biāo)不同小寫字母表示Prx6-1或Prx6-2

在不同發(fā)育期的相對表達(dá)量差異顯著(P<0.05，Tukey’s多重比較檢驗)。下圖同

Fig.4Expression levels ofPrx6 genes at different life stages

1-6.1st-6th lava；P.Pupa;NA.Newly emerged adult.Different letters represent significant

difference (P<0.05) (Tukey’s multiple comparison test).The same below

2.4Prx6在不同蟲齡花絨寄甲體內(nèi)的表達(dá)

采用RT-qPCR方法研究Prx6基因在羽化后不同蟲齡花絨寄甲成蟲體內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果見圖5。圖5顯示，Prx6-2的整體表達(dá)水平明顯高于Prx6-1，這與其在不同發(fā)育期的表達(dá)情況是一致的。Prx6-1基因在20個月之前成蟲體內(nèi)表達(dá)量變化不大，之后表達(dá)量明顯上升，但差異均未達(dá)顯著水平。Prx6-2基因的表達(dá)與Prx6-1的變化規(guī)律相似，26月前的各齡成蟲表達(dá)量在小范圍上下浮動，差異不顯著，但30個月時表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

圖 5Prx6基因在羽化后不同蟲齡花絨寄甲體內(nèi)的相對表達(dá)量

Fig.5Expression levels ofPrx6 genes of adults at different ages

3　討　論

Prxs以硫氧還蛋白為電子供體，其清除過氧化氫的抗氧化功能已在許多昆蟲上得到了證實，并且Prxs在一些ROS的清除中起著核心作用[20-21]。1-Cys型Prxs在二硫蘇糖醇(DTT)存在的情況下可以清除H2O2，但是在硫氧還蛋白系統(tǒng)存在的情況下不表現(xiàn)過氧化物酶的活性[22-23]。為研究Prx6在花絨寄甲發(fā)育和衰老過程中的生理作用，本研究通過搜索花絨寄甲成蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得2個Prx6基因，分別為Prx6-1和Prx6-2。序列分析表明，Prx6-1和Prx6-2基因的開放閱讀框長度是654和672 bp，分別編碼218和224個氨基酸，其序列中只含有一個保守的半胱氨酸殘基(Cys)，均屬于1-Cys型Prxs，并且具有Prxs基因家族的保守信號模體(PVCT)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，花絨寄甲2個Prx6基因與赤擬谷盜的2個Prxs基因分別聚為一支，從分子層面表明花絨寄甲與赤擬谷盜親緣關(guān)系較近，與膜翅目昆蟲的距離較遠(yuǎn)。花絨寄甲的2個Prx6基因并沒有聚在同一支上，而是分別與赤擬谷盜的2個Prx6基因聚在2個不同的支上，這與它們的序列同源性比對結(jié)果一致，表明Prx6基因有可能發(fā)生了基因拷貝，不同拷貝在不同的環(huán)境影響下向不同的方向進(jìn)化，序列也就發(fā)生了變化。

有研究表明，在氧化壓下Prxs基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)[23]。如在果蠅S2細(xì)胞上進(jìn)行的Prxs體外功能研究表明，超表達(dá)Prxs的細(xì)胞系表現(xiàn)出較高的氧化壓抗性，而Prxs的沉默會使細(xì)胞對氧化壓更敏感[9]。本研究結(jié)果顯示，Prx6-1在花絨寄甲2齡幼蟲體內(nèi)表達(dá)量很高，在6齡幼蟲體內(nèi)表達(dá)量很低，這可能與2齡幼蟲剛接種到寄主上，其體內(nèi)的新陳代謝活動相對較高，而6齡幼蟲處于化蛹前的最后階段，新陳代謝和蟲體活性相對較低有關(guān)[24]。因此花絨寄甲在2齡幼蟲時代謝活動產(chǎn)生的ROS和H2O2較多，而在6齡幼蟲時產(chǎn)生的ROS和H2O2較少。另外Prx6-1在幼蟲體內(nèi)的表達(dá)整體上較蛹和成蟲低。Prx6-2在2、4和5齡幼蟲體內(nèi)表達(dá)量較高，在6齡幼蟲體內(nèi)的表達(dá)較低，在蛹和成蟲體內(nèi)的表達(dá)量略低于幼蟲。這2個Prx6基因在花絨寄甲發(fā)育過程中的不同表達(dá)情況說明其對花絨寄甲的發(fā)育作用有所不同。

為研究Prx6基因在花絨寄甲衰老過程中的可能作用，將成蟲根據(jù)羽化后的時間進(jìn)行分組并測定Prx6基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在不同蟲齡的花絨寄甲成蟲間Prx6-1的表達(dá)差異不顯著，整體呈上升趨勢；Prx6-2的表達(dá)也呈現(xiàn)相似的趨勢，在20個月之前的不同蟲齡成蟲間的表達(dá)差異不顯著。分析其原因認(rèn)為，隨著花絨寄甲羽化后時間的延長，其體內(nèi)新陳代謝活動所產(chǎn)生的ROS和H2O2都會逐漸積累，因此Prx6表達(dá)增加，以應(yīng)對氧化壓的升高。因此認(rèn)為Prx6隨花絨寄甲羽化后時間的延長表達(dá)量增加有利于緩解其體內(nèi)的氧化壓。

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Identification,characterization and expression analysis ofPrx6 genes inDastarcushelophoroides

GUO Ruijian,HAO Chunfeng,ZHANG Zhengqing,ZHANG Wei,WANG Huapeng,LI Menglou

(CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 Peroxiredoxin 6 (Prx6) genes were obtained fromDastarcushelophoroidesand their biological information and expression patterns during developmental and aging were analyzed to explore the possible physiological roles. 【Method】 ThePrx6 genes were obtained from the transcriptome database ofDastarcushelophoroidesand biological information was analyzed.The expression patterns ofPrx6 genes during developmental and aging were then analyzed by real-time qPCR.【Result】 TwoPrx6 genes were obtained from the transcriptome,namedPrx6-1 andPrx6-2,encoding 218 and 224 amino acids,respectively.Multiple alignments and phylogenetic analysis revealed that both genes belonged to 1-CysPrx,sharing the highest homology of 71% and 82% withPrx6 genes from Tribolium castaneum.Expression analyses ofPrxs at different growth stages showed that the expression level ofPrx6-1 was high in the 2nd larva,pupa and newly emerged adult stages,with the lowest level in the 6th larva stage.Prx6-2 showed the higher level in the 2nd and 4th larva stages,with the lowest level in the 6th larva stage.During aging,the expression levels of thePrx6 genes increased gradually with age after eclosion.【Conclusion】 ThePrx6 genes involved in the developmental process ofDastarcushelophoroides,especially at the 2nd and 6th larva stages.During aging,the expression increased with age after eclosion.

Dastarcushelophoroides;Prx6;real-time qPCR;development;aging

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.022

2015-01-30

國家自然科學(xué)基金項目(31170608)

郭瑞堅(1989-)，男，山東濟(jì)寧人，碩士，主要從事森林保護(hù)研究。E-mail：guoruijianbest@163.com

李孟樓(1957-)，男，陜西富平人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事森林害蟲防治及殺蟲劑毒理研究。

E-mail：limenglou@126.com

Q74

A

1671-9387(2016)08-0148-07

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