華蟾毒精對小鼠巨噬細胞功能的影響

孟顯華，于　洋，郝　璐，劉天明，付　越，李敬雙

(錦州醫(yī)科大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

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華蟾毒精對小鼠巨噬細胞功能的影響

孟顯華，于洋，郝璐，劉天明，付越，李敬雙

(錦州醫(yī)科大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

【目的】 闡明華蟾毒精(CBG)對巨噬細胞功能的影響，為CBG的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)?！痉椒ā?利用Balb/c小鼠制備與純化腹腔巨噬細胞，采用不同質(zhì)量濃度(0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L)CBG作用于巨噬細胞，采用MTT法檢測CBG對巨噬細胞吞噬金黃色葡萄球菌的影響；采用Griess法檢測CBG對巨噬細胞分泌NO的影響；采用ELISA法檢測CBG對巨噬細胞分泌IL-6、TNF-α和GM-CSF的影響?！窘Y(jié)果】 CBG質(zhì)量濃度為1.0，1.5和2.0 mg/L組均能極顯著提高巨噬細胞的吞噬功能；CBG質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 組能顯著促進巨噬細胞NO的分泌，而 1.0，1.5和2.0 mg/L CBG組均能極顯著促進巨噬細胞NO的分泌；CBG質(zhì)量濃度為1.0，1.5和2.0 mg/L組均能極顯著促進巨噬細胞IL-6的分泌； 1.0 mg/L CBG組能顯著促進巨噬細胞TNF-α的分泌， 1.5和2.0 mg/L CBG組均能極顯著促進巨噬細胞TNF-α的分泌；CBG質(zhì)量濃度為0.5，1.0，1.5和2.0 mg/L組均能極顯著促進巨噬細胞GM-CSF的分泌?！窘Y(jié)論】 CBG能提高巨噬細胞的吞噬功能和分泌功能，說明CBG具有良好的抗炎、抗腫瘤和提高免疫等作用。

華蟾毒精；巨噬細胞；吞噬功能；分泌功能

蟾酥為中國的傳統(tǒng)中藥，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、局部麻醉、升血壓等作用，在人類醫(yī)學(xué)上對各種疾病的治療作用已經(jīng)得到國內(nèi)外的認可。關(guān)于蟾酥在動物醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的研究較少，現(xiàn)有研究結(jié)果表明其具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗病毒等作用[1-9]。華蟾毒精(CBG)是從蟾酥中分離出的一種單體，也被稱為華蟾酥毒基，是含有醚鍵的甾體化合物，難溶于水，相對分布廣，在體內(nèi)半衰期短且具有很強的毒性。

巨噬細胞幾乎存在于機體的所有組織中，在機體眾多的生理和病理反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，具有較強的吞噬和殺傷能力，既能參與非特異性免疫的生理過程，又能呈遞抗原、產(chǎn)生細胞因子和參與特異性免疫應(yīng)答[10-11]。當(dāng)機體受到病原體、腫瘤細胞和有毒物質(zhì)等刺激時，巨噬細胞從未活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，激活的巨噬細胞除了可以直接殺傷病原微生物、吞噬機體衰老細胞，還可釋放大量生物活性因子，包括一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素6(IL-6)和粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)等以及其他可激活防御反應(yīng)的物質(zhì)[12-14]，這些生物活性因子參與機體的炎癥反應(yīng)，在先天性免疫預(yù)防和獲得性免疫應(yīng)答中更有不可替代的作用。CBG具有局麻、強心、升壓和提高機體免疫力等功效，前人對其免疫機制的研究多集中在機體特異性免疫方面，Remko等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CBG對免疫抑制劑環(huán)磷酰胺造成的免疫低下具有緩解作用。Jiang等[16]研究表明，CBG對環(huán)磷酰胺引起的小鼠脾臟和胸腺損害有一定的保護作用，可提高T、B淋巴細胞的刺激指數(shù)，緩解環(huán)磷酰胺引起的T淋巴細胞亞群紊亂。但對于CBG在機體非特異性免疫方面的研究很少，巨噬細胞主要參與機體的非特異性免疫反應(yīng)，因此本試驗研究了CBG對巨噬細胞功能的影響，為CBG的進一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物和菌株Balb/c小鼠，體質(zhì)量 18～22 g/只，購自吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部；金黃色葡萄球菌(編號AB91093)，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)提供。

1.1.2主要試劑CBG(生產(chǎn)批號：MUST-12062610，成都曼斯特生物有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)液(Invitrogen GIBICOTM)，胎牛血清(PAA Austria)，刀豆蛋白A(Con A)和脂多糖(LPS)(SIGMA，USA)，NO檢測試劑盒(Promega.USA)，IL-6、TNF-α、GM-CSF試劑盒(Bender Medsystem)，多粘菌素B硫酸鹽(PMB)(SIGMA，USA)，一次性0.22 μm除菌過濾器(Millpore公司)，D-Hank’s液(北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，Tris-NH4Cl溶液(上海優(yōu)選生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，DMEM培養(yǎng)基(北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠腹腔巨噬細胞的制備與純化選取體質(zhì)量為18～22 g/只 Balb/c小鼠，頸椎脫臼處死，于體積分數(shù)75%酒精中浸泡消毒3 min，取出瀝干，腹腔注射RPMI-1640培養(yǎng)液5 mL，沖洗腹腔，反復(fù)抽吸數(shù)次，輕揉小鼠腹部2～3 min,然后切開腹壁暴露腹膜，用注射器抽取腹腔液，Tris-NH4Cl溶液溶血，收集腹腔懸液，2 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌細胞2次。將細胞沉淀用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，Trypan Blue染色計數(shù)活細胞達95%以上，將細胞密度調(diào)整為5×106mL-1，最后制成懸液。向96孔細胞培養(yǎng)板的每孔加入100 μL細胞懸液，置 37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后去上清，再用RPMI-1640培養(yǎng)液洗細胞培養(yǎng)板1次，去上清，最后每孔加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)板孔內(nèi)貼壁細胞即為純化的小鼠腹腔巨噬細胞。

1.2.2CBG對巨噬細胞吞噬功能的影響取96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL上述巨噬細胞培養(yǎng)液，再加入不同質(zhì)量濃度(0，0.5，1.0，1.5和2.0 mg/L)CBG，CBG的質(zhì)量濃度依據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定。培養(yǎng)48 h 后，在每孔中加入107～109CFU/mL金黃色葡萄球菌菌液50 μL，每組均設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，沉淀用DMSO溶解，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的OD570值，OD570值越大表示巨噬細胞的吞噬能力越強。

1.2.3CBG對巨噬細胞分泌NO的影響刮取對數(shù)生長期的小鼠腹腔巨噬細胞，調(diào)整細胞密度為2×105mL-1，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL；每孔加入1 mL 含不同質(zhì)量濃度CBG的DMEM培養(yǎng)基，使CBG的質(zhì)量濃度分別為0，0.5，1.0，1.5和2.0 mg/L。每個質(zhì)量濃度均設(shè) 3個復(fù)孔，每孔溶液終體積為 2 mL，置 37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后離心，取細胞上清液，通過Griess試劑法測定NO濃度，具體操作按NO檢測試劑盒的說明書進行。

1.2.4CBG對巨噬細胞分泌IL-6、TNF-α和GM-CSF的影響巨噬細胞處理方法同1.2.3節(jié)，培養(yǎng)24 h取樣離心，收集上清，采用ELISA 方法檢測IL-6、TNF-α和GM-CSF質(zhì)量濃度，具體操作根據(jù)IL-6、TNF-α和GM-CSF檢測試劑盒的說明書進行。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)分析用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0進行。

2　結(jié)果與分析

2.1CBG對巨噬細胞吞噬功能的影響

不同質(zhì)量濃度華蟾毒精(CBG)對巨噬細胞吞噬功能的影響結(jié)果見圖1。

圖 1　不同質(zhì)量濃度華蟾毒精(CBG)對 巨噬細胞吞噬功能的影響圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)， 標(biāo)不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)，下圖同F(xiàn)ig.1　Effect of CBG at different concentrations on phagocytosis of macrophages Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05) between treatments,different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).The same below

由圖1可知，與對照組(0 mg/L)相比，0.5 mg/L CBG處理組巨噬細胞的吞噬能力無顯著變化，1.0，1.5，2.0 mg/L CBG處理組巨噬細胞的吞噬能力均極顯著提高；除1.0與1.5 mg/L CBG處理組差異不顯著外，其余質(zhì)量濃度CBG處理組之間差異均極顯著；巨噬細胞的吞噬能力隨著CBG質(zhì)量濃度的提高而增大，且對CBG質(zhì)量濃度具有依賴性。

2.2CBG對巨噬細胞分泌NO的影響

由圖2可知，與對照組(0 mg/L)相比，0.5和1.0 mg/L CBG處理組巨噬細胞NO的分泌量顯著提高，1.5和2.0 mg/L CBG處理組巨噬細胞NO的分泌量均極顯著提高；CBG不同質(zhì)量濃度組之間比較，除0.5與1.0 mg/L CBG處理組NO的分泌量差異顯著外，其余質(zhì)量濃度CBG處理組之間NO的分泌量差異均極顯著；巨噬細胞NO的分泌量隨著CBG質(zhì)量濃度的提高而增多，且對CBG質(zhì)量濃度具有依賴性。

圖 2不同質(zhì)量濃度華蟾毒精(CBG)對巨噬細胞分泌NO的影響

Fig.2Effect of CBG at different concentrations on NO secretion of macrophages

2.3CBG對巨噬細胞分泌IL-6、TNF-α和GM-CSF的影響

2.3.1對IL-6分泌的影響由圖3可知，與對照組(0 mg/L)相比，0.5 mg/L CBG處理組巨噬細胞IL-6的分泌量無顯著變化，1.0 mg/L CBG處理組巨噬細胞IL-6的分泌量顯著提高，1.5和2.0 mg/L CBG處理組巨噬細胞IL-6的分泌量均極顯著提高；除0.5與1.0 mg/L CBG處理組差異顯著外，其余質(zhì)量濃度CBG處理組之間差異均極顯著；巨噬細胞IL-6的分泌量隨著CBG質(zhì)量濃度的提高而增大，且對CBG質(zhì)量濃度具有依賴性。

2.3.2對TNF-α分泌的影響由圖4可知，與對照組(0 mg/L)相比，0.5 mg/L CBG處理組巨噬細胞TNF-α的分泌量無顯著變化，1.0 mg/L CBG處理組巨噬細胞TNF-α的分泌量顯著提高，1.5和 2.0 mg/L CBG處理組巨噬細胞TNF-α的分泌量均極顯著提高；0.5與1.0 mg/mL CBG處理差異不顯著，1.0與1.5 mg/L CBG處理差異顯著，其余質(zhì)量濃度CBG處理組之間差異均極顯著；巨噬細胞TNF-α的分泌量隨著CBG質(zhì)量濃度的提高而增多，且對CBG質(zhì)量濃度具有依賴性。

圖 3不同質(zhì)量濃度華蟾毒精 (CBG)對巨噬細胞分泌IL-6的影響

Fig.3Effect of CBG at different concentrations on IL-6 secretion of macrophages

圖 4不同質(zhì)量濃度華蟾毒精(CBG)對巨噬細胞分泌TNF-α的影響

Fig.4Effect of CBG at different concentrations on TNF-α secretion of macrophages

2.3.3對GM-CSF分泌的影響由圖5可知，與對照組(0 mg/L)相比，不同質(zhì)量濃度 CBG處理組巨噬細胞GM-CSF的分泌量均極顯著提高；0.5與1.0 mg/L CBG處理組及1.5與2.0 mg/L CBG處理組差異不顯著，1.0與1.5 mg/L CBG處理組差異顯著，其余質(zhì)量濃度CBG處理組之間差異均極顯著；巨噬細胞GM-CSF的分泌量隨著CBG質(zhì)量濃度的提高而增多，且對CBG質(zhì)量濃度具有依賴性。

圖 5　不同質(zhì)量濃度華蟾毒精(CBG)對 巨噬細胞分泌GM-CSF的影響Fig.5　Effect of CBG at different concentrations on GM-CSF secretion of macrophages

3　討　論

巨噬細胞可吞噬外來病原體和機體自身異變細胞，是非特異性免疫的組成部分。巨噬細胞吞噬能力的高低可直接反映機體的免疫水平。本研究結(jié)果表明，CBG能顯著提高巨噬細胞的吞噬能力，從而提高機體的非特異性免疫功能，這與姜峰等[1]的研究結(jié)果是一致的。

NO不僅可以增強巨噬細胞的活性，還在不同的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中起著重要的作用[17-19]。在單核/巨噬細胞中，NO由 iNOS催化底物左旋精氨酸(L-Arg)介導(dǎo)產(chǎn)生，iNOS 的活性可被 LPS或某些細胞因子，如 TNF-α和 IFN-γ 等激活[20]。本研究結(jié)果表明CBG可以誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞NO的分泌，從而增強巨噬細胞的活性。

免疫系統(tǒng)細胞的增殖、分化和功能受到一系列細胞因子的調(diào)節(jié)。IL-6可促進T細胞表面IL-2r的表達，增強IL-1和TNF對Th細胞的有絲分裂作用，促進B細胞增殖、分化并產(chǎn)生抗體；IL-6還能有效地促進TNF和IL-1誘導(dǎo)的惡病質(zhì)。IL-6主要免疫學(xué)功能是加強其他細胞因子的效果。本研究結(jié)果表明，CBG可以誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞IL-6的分泌，從而提高淋巴細胞的活性。

TNF-α主要通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、破壞腫瘤組織血管、介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用、放化療增敏作用等產(chǎn)生抗腫瘤作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強的細胞因子之一。本研究結(jié)果表明,CBG可以誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α的分泌，從而增強小鼠機體免疫功能，提高抗腫瘤作用。

目前普遍認為，GM-CSF能刺激粒細胞及巨噬細胞等白細胞的增殖、分化及活化作用，從而增強造血功能；能促使效應(yīng)細胞增強如吞噬細菌及消滅癌細胞等免疫活動。本研究結(jié)果表明,CBG可以誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞GM-CSF的分泌，從而增強小鼠機體免疫功能，提高抗腫瘤和抗炎作用。

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Effect of cinobufagin on macrophage function of mice

MENG Xianhua,YU Yang,HAO Lu,LIU Tianming,FU Yue,LI Jingshuang

(CollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China)

【Objective】 This study investigated the effect of cinobugagin (CBG) on macrophage function of mice to provide basis for its development and utilization. 【Method】 Balb/c mice were used for preparation and purification of peritoneal macrophages,and CBG with different mass concentrations (0.5,1.0,1.5,2.0 mg/L) were applied on macrophages with blank control.After samples were taken,MTT method was used to detect effect on macrophage phagocytosis of staphylococcus aureus,Griess method was used to detect effect on NO secretion of macrophages,and ELISA method was used to test the effect on secretion of IL-6,TNF-α and GM-CSF.【Results】 CBG groups with mass concentrations of 1.0,1.5,and 2.0 mg/L could significantly increase macrophage phagocytosis.CBG at concentration of 0.5 mg/L group significantly promoted NO secretion,and CBG at concentrations of 1.0,1.5,and 2.0 mg/L significantly promoted NO secretion.CBG at mass concentrations of 1.0,1.5,and 2.0 mg/L significantly promoted secretion of IL-6.CBG at mass concentration of 1.0 mg/L significantly promoted TNF-α secretion,and mass concentrations of 1.5 and 2.0 mg/L significantly promoted TNF-α secretion.CBG at mass concentrations of 0.5,1.0,1.5,and 2.0 mg/L significantly promoted GM-CSF secretion. 【Conclusion】 CBG can enhance macrophage phagocytosis function and secretion function,thus it has good function of anti-inflammatory,anti-tumor and improving immune.

cinobufagin;macrophage;phagocytosis function;secretion funtion

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.010

2014-08-21

遼寧省科技攻關(guān)計劃項目(2014214016)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-研究生科技創(chuàng)新基金項目(QM2014005)

孟顯華(1990-)，女，遼寧朝陽人，在讀碩士，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究。E-mail:549719090@qq.com

李敬雙(1963-)，女，遼寧錦州人，教授，碩士，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與免疫學(xué)的研究。E-mail:ljs4680399@163.com

S859.7

A

1671-9387(2016)08-0061-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160712.0845.020.html