產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

葉寶宏，鮑長(zhǎng)磊，付明哲，許信剛

(1 榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

葉寶宏1，鮑長(zhǎng)磊2，付明哲2，許信剛2

(1 榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 建立產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法。【方法】 將原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-β轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析純化、尿素梯度透析復(fù)性后進(jìn)行Western blot鑒定。用復(fù)性的β毒素重組蛋白作為包被抗原，通過(guò)優(yōu)化間接ELISA試驗(yàn)條件，建立其抗體間接ELISA檢測(cè)方法，對(duì)該方法的特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行考察，并用其對(duì)521份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)。【結(jié)果】 通過(guò)誘導(dǎo)、純化和復(fù)性，獲得了純度較高且具有良好反應(yīng)原性的β毒素重組蛋白。間接ELISA條件為：抗原最佳包被質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL，陽(yáng)/陰性血清最佳稀釋度為1∶50，酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1∶2 500，以含50 g/L脫脂奶粉的PBST作為封閉液，37 ℃封閉1 h，抗原抗體作用1 h，TMB顯色30 min。間接ELISA的判定標(biāo)準(zhǔn)為OD450≥0.313為陽(yáng)性，OD450<0.313為陰性；建立的間接ELISA方法的特異性為96%，敏感性為98%；批內(nèi)變異系數(shù)在3%～4%，批間變異系數(shù)在9%以下。利用間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)521份臨床山羊血清樣本的檢測(cè)結(jié)果表明，抗體陽(yáng)性率為72.5%。【結(jié)論】 對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素進(jìn)行了原核表達(dá)，成功建立了其抗體間接ELISA檢測(cè)方法，為產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體檢測(cè)試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

產(chǎn)氣莢膜梭菌；β毒素；原核表達(dá)；間接ELISA

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)舊名魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)或產(chǎn)氣莢膜桿菌(Bacillusperfringens)，在自然界分布非常廣泛。該菌屬于一種條件致病菌，致病作用主要取決于其所產(chǎn)生的毒素。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素至少有20種[1]，其中主要致死毒素為α、β、ε和ι。根據(jù)產(chǎn)生主要致死毒素的不同，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D和E 5個(gè)型[2-3]。β毒素分子質(zhì)量約為34.5 ku，由B型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生[4-6]，其編碼基因cpb1位于質(zhì)粒上[1]。β毒素具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性和致死性，主要作用部位是空腸，可引起壞死性腸炎，具體表現(xiàn)為腸黏膜出血性壞死，腸壁變薄，容易引起穿孔和破裂，顯微鏡下可見(jiàn)多核白細(xì)胞浸潤(rùn)和栓塞[7-9]。另外，β毒素也是一種神經(jīng)性毒素，能誘發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)的反應(yīng)，如使家畜出現(xiàn)痙攣、抽搐、角弓反張等癥狀，會(huì)對(duì)人體健康和畜牧業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[10-11]。

在現(xiàn)代養(yǎng)羊業(yè)中，以β毒素為主要致病因子的B型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌可導(dǎo)致羊發(fā)生致死性疾病，如羔羊痢疾、羊猝狙、腸毒血癥等。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于土壤、污水、飼料、糞便以及動(dòng)物腸道中，飼養(yǎng)管理不當(dāng)、氣候變化等諸多因素均極易誘發(fā)羊發(fā)病，導(dǎo)致羊的急性死亡，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響。目前，培養(yǎng)B、C和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌，經(jīng)甲醛滅活后制成疫苗是國(guó)內(nèi)外用于預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌所致疾病的常規(guī)手段。我國(guó)現(xiàn)有的商品化疫苗有羊快疫、羊猝狙、羔羊痢疾、羊腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗、羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗等[12]。本研究對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素進(jìn)行了原核表達(dá)，將其純化、復(fù)性后作為抗原，建立了針對(duì)β毒素抗體水平的間接ELISA檢測(cè)方法，旨在為產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗免疫后β毒素抗體的檢測(cè)提供技術(shù)支持，也為產(chǎn)氣莢膜梭菌引起疫病的預(yù)防提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

表達(dá)產(chǎn)物為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素的重組質(zhì)粒pET-28a-β，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)、Protein Marker、ProteinIso Ni-NTA Resin、BCA蛋白定量試劑盒，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體、牛血清白蛋白(BSA)，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)板，購(gòu)自BEAVER公司；TMB單組分顯色液、終止液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

β毒素抗體陽(yáng)性血清由免疫“羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗”的山羊血液分離獲得，經(jīng)Western-blot檢驗(yàn)?zāi)芘cβ毒素抗原發(fā)生特異性反應(yīng)；陰性血清由未免疫“三聯(lián)四防疫苗”的臨床健康山羊的血液分離獲得，該血清(未稀釋)經(jīng)Western-blot檢驗(yàn)不能與β毒素抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，證實(shí)其不含有β毒素抗體。

1.2β毒素重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化及表達(dá)形式分析

將重組質(zhì)粒pET-28a-β和pET-28a空載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，復(fù)蘇后涂布含卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落于37 ℃下220 r/min培養(yǎng)12 h，進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆按體積分?jǐn)?shù)1%轉(zhuǎn)接5 mL新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(3～3.5 h)時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)5 h后，取1 mL菌液，10 000 r/min離心2 min，收集菌體重懸于100 μL PBS，冰浴超聲裂解2 min(超聲功率為200 W，工作2 s，間歇3 s)，加入100 μL 2×Loading Buffer混勻，沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清5 μL進(jìn)行全菌SDS-PAGE。

其他條件不變，在不同IPTG終濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L)和不同誘導(dǎo)時(shí)間(2，3，4，5，6，7 h)下對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，從而確定重組蛋白表達(dá)的最佳條件。

在最佳條件下對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，取菌液，按上述方法處理后分別取菌液上清、菌體超聲裂解后12 000 r/min離心10 min的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，分析重組蛋白的表達(dá)形式。

1.3β毒素重組蛋白的純化和復(fù)性

大體積誘導(dǎo)培養(yǎng)重組菌，4 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS洗滌后重懸于適量細(xì)菌裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)，加入 PMSF(終濃度0.1 mmol/L)和溶菌酶(質(zhì)量濃度1 mg/mL)，冰浴超聲裂解至菌液不黏稠。細(xì)菌裂解物于4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，沉淀用冰冷的包涵體洗滌液(50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)0.5%的Triton X-100，pH 8.0)洗滌3次。將沉淀溶解于適量包涵體溶解液(8 mol/L尿素，100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl)，室溫孵育1 h后，12 000 r/min離心10 min，上清過(guò)0.45 μm濾膜后按ProteinIso Ni-NTA Resin說(shuō)明書(shū)純化目的蛋白。

將純化后的重組蛋白轉(zhuǎn)入透析袋中，于4 ℃緩慢磁力攪拌的條件下依次在含不同濃度尿素(6，4，2和1 mol/L)的透析液A(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)、透析液B(20 mmol/L Tris-HCl，0.6 mmol/L L-精氨酸，體積分?jǐn)?shù)10%的甘油，2 mmol/L EDTA，pH 8.0)和透析液C(20 mmol/L Tris-HCl，25 mmol/L NaCl 0.2 mol/L尿素)中透析復(fù)性12 h。收集復(fù)性蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定重組蛋白濃度后，于-20 ℃分裝保存。

1.4β毒素重組蛋白的Western blot分析

將復(fù)性蛋白進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)膜、封閉，用1∶200倍稀釋的陽(yáng)性血清于4 ℃孵育過(guò)夜，加HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG抗體(1∶10 000倍稀釋)，ECL反應(yīng)液孵育，暗室壓片曝光。

1.5β毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

1.5.1抗原、血清和酶標(biāo)二抗工作濃度的確定以純化、復(fù)性的β毒素為包被抗原，進(jìn)行抗原質(zhì)量濃度、血清稀釋度和酶標(biāo)二抗稀釋度的三水平三因素正交試驗(yàn)，抗原質(zhì)量濃度為2.5，5.0和7.5 μg/mL，陽(yáng)性和陰性血清的稀釋度為1∶50、1∶100和1∶200，酶標(biāo)二抗的稀釋度為1∶2 500、1∶5 000和 1∶10 000。用0.05 mol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原稀釋至所需濃度后，以100 μL/孔于4 ℃包被酶標(biāo)板過(guò)夜，于37 ℃封閉(封閉液用量為200 μL/孔)，用100 μL經(jīng)封閉液稀釋的血清和酶標(biāo)二抗孵育，TMB顯色和終止液終止后測(cè)定OD450值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以陽(yáng)性血清OD450值(P值)為1.0左右、陰性血清OD450值(N值)在0.1以下且P/N值最大為原則，確定抗原、血清和酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。

1.5.2其他試驗(yàn)條件的優(yōu)化在上述試驗(yàn)確定的最佳抗原質(zhì)量濃度和血清、酶標(biāo)二抗稀釋度下，分別進(jìn)行封閉液(含5 g/L BSA的PBST和含50 g/L脫脂奶粉的PBST)、封閉時(shí)間(1和2 h)、抗原抗體作用時(shí)間(0.5和1 h)、顯色時(shí)間(10，20和30 min)等條件的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.5.4特異性試驗(yàn)用建立的間接ELISA方法對(duì)50份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，以陰性血清的檢出率反映所建立的間接ELISA方法的特異性。

1.5.5敏感性試驗(yàn)用建立的間接ELISA方法對(duì)50份陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，以陽(yáng)性血清的檢出率反映所建立的間接ELISA檢測(cè)方法的敏感性。

1.5.6批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗(yàn)取3份陽(yáng)性血清，每份血清設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，用建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定每孔陽(yáng)性血清的OD450值，計(jì)算變異系數(shù)，用其評(píng)價(jià)批內(nèi)的可重復(fù)性。取3批次純化復(fù)性的蛋白包被酶標(biāo)板，對(duì)1份陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定每批次OD450值，計(jì)算變異系數(shù)，用其評(píng)價(jià)批間的可重復(fù)性。

1.5.7臨床樣本的檢測(cè)利用本試驗(yàn)建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自陜西省不同地區(qū)的521份山羊血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，初步評(píng)價(jià)間接ELISA方法的應(yīng)用效果。

2　結(jié)果與分析

2.1β毒素重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

使用不同濃度的IPTG對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示不同的IPTG終濃度對(duì)β毒素重組蛋白表達(dá)量影響不大(圖1)；在不同誘導(dǎo)時(shí)間(2～7 h)下的結(jié)果顯示，誘導(dǎo)7 h時(shí)的β毒素重組蛋白表達(dá)量明顯增加(圖2)。pET-28a空質(zhì)粒對(duì)照組和pET-28a-β未誘導(dǎo)對(duì)照組均未見(jiàn)重組蛋白的表達(dá)。

圖 1　IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素 重組蛋白表達(dá)的影響M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)pET-28a；2.未誘導(dǎo)pET-28a-β； 3～7.分別為經(jīng)終濃度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-βFig.1　Effects of IPTG concentration on expression of beta-toxin fusion proteinM.Protein Marker；1.Induced cells containing pET-28a； 2.Uninduced cells containing pET-28a-β； 3-7.Cells containing pET-28a-β induced with 0.2，0.4，0.6，0.8 and 1.0 mmol/L IPTG,respectively圖 2　IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素 重組蛋白表達(dá)的影響M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)pET-28a；2.未誘導(dǎo)pET-28a-β； 3～8. 分別為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2，3，4，5，6，7 h的pET-28a-βFig.2　Effects of different induction times on expression of beta-toxin fusion proteinM.Protein Marker；1.Induced cells containing pET-28a； 2.Uninduced cells containing pET-28a-β；3-8.Cells containing pET-28a-β induced for 2,3,4,5,6 and 7 h,respectively

2.2β毒素重組蛋白的表達(dá)形式分析及純化

SDS-PAGE分析結(jié)果(圖3)顯示，β毒素重組蛋白以包涵體的形式存在；包涵體蛋白經(jīng)ProteinIso Ni-NTA Resin純化后獲得了預(yù)期分子質(zhì)量的β毒素重組蛋白。

2.3β毒素重組蛋白的Western blot分析

Western blot分析顯示，β毒素重組蛋白與陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶(圖4)。

圖 3　產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素重組蛋白的表達(dá)形式分析及純化M.蛋白標(biāo)樣；1.pET-28a-β菌液上清；2，3.分別為 pET-28a-β菌體裂解上清和沉淀；4.純化的β毒素重組蛋白Fig.3　Expression of beta-toxin fusion protein and purificationM.Protein Marker；1.Supernatant of lysogeny broth of pET-28a-β；2,3.Cellular lysate supermatant and precipitation of pET-28a-β；4.Purification of beta-toxin fusion protein圖 4　產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素重組蛋白的 Western blot結(jié)果M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～2.β毒素重組蛋白Fig.4　Western blot analysis of beta-toxin fusion proteinM.Protein Marker；1-2.Beta-toxin fusion protein

2.4β毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1包被抗原質(zhì)量濃度及血清和酶標(biāo)二抗稀釋度的確定由表1可知，確定的β毒素的最佳包被質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL，血清的最佳稀釋度為 1∶50，酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度為1∶2 500。

2.4.2其他試驗(yàn)條件的優(yōu)化其他試驗(yàn)條件以含50 g/L脫脂奶粉的PBST作為封閉液、封閉1 h、抗原抗體作用1 h、TMB顯色30 min最佳。

2.5β毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法臨界值的確定

表 1　產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法最佳包被抗原質(zhì)量濃度及血清和酶標(biāo)二抗稀釋度的確定Table 1　ELISA results with different coating mass concentrations,serum concentrations and HRP-rabbit-anti-goat IgG concentrations

注：Ps代表陽(yáng)性血清，Ns代表陰性血清；A代表2.5 μg/mL抗原，B代表5.0 μg/mL抗原，C代表7.5 μg/mL抗原。

Note:Ps stands for positive sera,Ns stands for negative sera;A stands for 2.5 μg/mL antigen,B stands for 5.0 μg/mL antigen,C stands for 7.5 μg/mL antigen.

2.6間接ELISA檢測(cè)方法的特異性、敏感性和重復(fù)性檢測(cè)

在最優(yōu)的ELISA試驗(yàn)條件下，對(duì)50份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，β毒素抗體陰性的檢出率為96%，表明所建立的間接ELISA檢測(cè)方法特異性良好。

在最優(yōu)的ELISA試驗(yàn)條件下，對(duì)50份陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，β毒素抗體陽(yáng)性的檢出率為98%，表明所建立的ELISA檢測(cè)方法敏感性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，批內(nèi)變異系數(shù)在3%～4%，批間變異系數(shù)在9%以下，表明建立的間接ELISA檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

2.7間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)臨床樣本的檢測(cè)

利用本試驗(yàn)建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自陜西省不同地區(qū)羊場(chǎng)的521份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(表2)表明，392份血清β毒素抗體呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為75.2%。

表 2　陜西省不同地區(qū)羊場(chǎng)血清β毒素抗體水平檢測(cè)情況Table 2　Detection of beta-toxin antibodies in sheep farms in different regions of Shaanxi

3　討論與結(jié)論

原核表達(dá)重組蛋白具有產(chǎn)量高、成本低和生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，另外由于載體pET-28a含6個(gè)組氨酸組成的His-Tag，所以可以使用金屬螯合層析進(jìn)行純化。但原核表達(dá)存在易產(chǎn)生難溶包涵體蛋白的缺點(diǎn)，研究表明目的蛋白低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，高表達(dá)時(shí)容易形成包涵體，原因可能是蛋白合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)，使過(guò)多的蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從包涵體中純化重組蛋白已不是難題，因?yàn)榘w很容易與可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白分離，在多數(shù)情況下，調(diào)整洗滌的條件可使包涵體中重組蛋白的純度達(dá)到90%以上，然后使用高濃度尿素或鹽酸胍等變性劑即可進(jìn)行溶解[13]。本研究將β毒素重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-β轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)后，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，使目的蛋白在細(xì)菌中以包涵體形式大量表達(dá)，包涵體蛋白經(jīng)過(guò)8 mol/L尿素變性溶解后，通過(guò)鎳柱親和層析獲得了純度較高的目的蛋白。由于變性的蛋白無(wú)生物活性，所以本研究采用遞減尿素濃度的方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行復(fù)性。目前，蛋白復(fù)性通用的指導(dǎo)原則幾乎不存在，因?yàn)槟艽龠M(jìn)折疊的條件因蛋白而異，而且差別很大。通過(guò)查閱相關(guān)資料[13]，本研究選擇的復(fù)性條件對(duì)β毒素重組蛋白損失較少，而且復(fù)性后的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

使用復(fù)性的β毒素重組蛋白作為包被抗原，對(duì)間接ELISA試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)條件：抗原最佳包被質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL、血清和酶標(biāo)二抗最佳稀釋度分別為1∶50和1∶2 500。方法學(xué)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，本研究建立的間接ELISA方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好。采用本試驗(yàn)建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)陜西省不同羊場(chǎng)的521份山羊血清進(jìn)行檢測(cè)，抗體陽(yáng)性率為72.5%。而用之前建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)521份相同血清進(jìn)行檢測(cè)，抗體陽(yáng)性率為92.7%(文章待發(fā)表)。抗體陽(yáng)性率不同可能與疫苗中2種毒素含量的不同有關(guān)，因?yàn)楫a(chǎn)氣莢膜梭菌5個(gè)毒素型都能產(chǎn)生α毒素，而β毒素只有B、C型產(chǎn)生。經(jīng)市場(chǎng)調(diào)查，目前不同公司生產(chǎn)的產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗所選菌株不同，有的為B型和D型，有的為B型、C型和D型。由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的羊梭菌病的病死率較高，用抗菌藥物治療療效不明顯，而且不同菌型的產(chǎn)氣莢膜梭菌及其他微生物?；旌细腥綶14]。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌存在廣泛且屬于條件致病菌，所以加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和疫苗免疫是預(yù)防本病的關(guān)鍵[15]。雖然羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗等多聯(lián)疫苗已被廣泛應(yīng)用，但是由于起主要免疫保護(hù)作用的是機(jī)體中的毒素抗體，所以疫苗中毒素含量是關(guān)鍵，而目前傳統(tǒng)疫苗較難避免毒素含量低這一難題，所以提高疫苗中毒素含量、開(kāi)發(fā)新型疫苗是未來(lái)免疫防制發(fā)展的方向。

β毒素的原核表達(dá)、純化與復(fù)性為產(chǎn)氣莢膜梭菌其他毒素的研究提供了思路。β毒素抗體間接ELISA方法的初步建立為其間接ELISA試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment of an indirect enzyme-linked sorbent assay for detection of serum antibody of beta-toxin protein ofClostridiumperfringens

YE Baohong1,BAO Changlei2,FU Mingzhe2,XU Xingang2

(1SchoolofLifeScienceofYulinUniversity,Yulin,Shaanxi719000,China;2CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study was conducted to establish an indirect enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) to detect the serum antibody levels of beta-toxin protein.【Method】 The prokaryotic expression plasmids pET-28a-β containing beta-toxin gene was successfully transformed intoE.coliBL21(DE3) before being induced by IPTG.The expressed protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography and analyzed by SDS-PAGE.The purified protein was refolded by urea gradient dialysis,and its specificity was tested by Western-blot.The refolded beta-toxin recombinant protein was taken as coating antigen to determine the best reaction conditions by optimizing the indirect ELISA conditions.An indirect ELISA to detect the serum antibody of beta-toxin protein was then established and its specificity,sensitivity and repeatability were detected.【Result】 The optimal conditions of ELISA were:coating concentration of beta-toxin fusion protein was 5.0 μg/mL,the serum was diluted by 1∶50,the enzyme labeled antibody was diluted by 1∶2 500,using 50 g/L skim milk powder in PBST as sealing fluid for 1 h at 37 ℃,and the reaction time of substrate was 30 min.The cut-off value of the assay was 0.313,OD450≥0.313 means positive whileOD450<0.313 means negative.The specificity and sensitivity were 96% and 98%,respectively.The intra-assay and inter-assay variation coefficients were 3%-4% and <9%,respectively.A Total of 521 sera samples were detected and the positive rate was 72.5%.【Conclusion】 The beta-toxin fusion protein was obtained successfully.The establishment of an indirect ELISA provides solid foundation for development of ELISA kit to detect antibodies againstClostridiumperfringensbeta-toxin antibodies.

Clostridiumperfringens;beta-toxin;prokaryotic expression;indirect ELISA

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.009

2016-03-19

陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015NY162)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站(基地)科技成果推廣項(xiàng)目(TGZX2015-32)

葉寶宏(1980-)，男，陜西米脂人，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究。E-mail：79971294@qq.com

許信剛(1974-)，男，陜西武功人，副教授，博士，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。E-mail：286567031@qq.com

S855.1

A

1671-9387(2016)08-0055-05

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