L-肉堿對圓型臂尾輪蟲種群增長和個(gè)體大小的影響

陳玉珂，藺麗麗，劉洪建，王秋舉，楊翼羽，羅　莎，高永生，張東鳴

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春130118;2 吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，吉林 長春 130012)

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L-肉堿對圓型臂尾輪蟲種群增長和個(gè)體大小的影響

陳玉珂1，藺麗麗2，劉洪建2，王秋舉1，楊翼羽1，羅莎1，高永生1，張東鳴1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春130118;2 吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，吉林 長春 130012)

【目的】 探索L-肉堿對圓型臂尾輪蟲(Brachionusrotundiformis)(簡稱輪蟲)種群增長、懷卵率和個(gè)體大小的影響。【方法】 用0.012 5 mg/mL氯霉素作為輪蟲培養(yǎng)液中的抑菌藥物，1 mg/L L-肉堿作為輪蟲的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，以正常培養(yǎng)條件下不添加L-肉堿和氯霉素的培養(yǎng)組為對照，分別設(shè)添加L-肉堿、氯霉素和L-肉堿+氯霉素處理，以純酵母菌投喂培養(yǎng)輪蟲5 d。每天測定各組輪蟲的種群密度、培養(yǎng)液中的細(xì)菌含量以及第5天時(shí)各組輪蟲的背甲長、背甲寬?！窘Y(jié)果】 3～5 d L-肉堿組的細(xì)菌含量均顯著高于其他3組(P<0.05)；2～4 d氯霉素組和L-肉堿+氯霉素組的細(xì)菌含量顯著低于對照組(P<0.05)，但這兩組之間的差異不顯著(P>0.05)；第5天除L-肉堿組外其他3組之間細(xì)菌含量差異不顯著(P>0.05)。1～5 d各處理組輪蟲的種群密度均呈上升趨勢，L-肉堿組輪蟲的種群密度均高于其他3組。各組輪蟲的懷卵率差異不顯著(P>0.05)；添加氯霉素組輪蟲的背甲長和背甲寬顯著大于其他3組(P<0.05)?！窘Y(jié)論】 L-肉堿對輪蟲種群生長和繁殖的影響可能主要是通過影響細(xì)菌數(shù)量而起作用的。

圓型臂尾輪蟲；L-肉堿；氯霉素；種群增長；懷卵率

L-肉堿是生物體內(nèi)參與調(diào)控脂肪酸代謝的重要因子，也是重要的微量營養(yǎng)素。近年來，有關(guān)L-肉堿在水產(chǎn)動物營養(yǎng)領(lǐng)域的研究取得了許多成果[1-5]，但對其在水產(chǎn)生物餌料領(lǐng)域的研究很少[6-8]。Zhang等[6]研究了L-肉堿對圓型臂尾輪蟲(Brachionusrotundiformis)(以下簡稱輪蟲)種群增長、懷卵率和個(gè)體大小的影響，發(fā)現(xiàn)適宜質(zhì)量濃度(1～100 mg/L)的L-肉堿強(qiáng)化對輪蟲種群增長和繁殖均有顯著的促進(jìn)作用，并提出L-肉堿很可能是通過參與輪蟲的脂肪酸代謝來促進(jìn)輪蟲種群增長的。然而，Wilde等[7]研究發(fā)現(xiàn)，L-肉堿能夠促進(jìn)輪蟲種群增長與其參與輪蟲的脂肪酸代謝沒有關(guān)系，而是因?yàn)檩喯x培養(yǎng)水體中有很多細(xì)菌，這些細(xì)菌不僅對輪蟲的種群增長和繁殖起到調(diào)節(jié)作用，還會影響輪蟲對L-肉堿的利用程度。有研究報(bào)道，L-肉堿可以促進(jìn)細(xì)菌的生長，且不同種類的細(xì)菌會通過不同方式代謝L-肉堿[9-10]。因此，L-肉堿能夠促進(jìn)輪蟲種群增長和繁殖的作用機(jī)理可能主要有以下兩點(diǎn)：一是L-肉堿直接作用于輪蟲，通過參與輪蟲體內(nèi)的某種代謝促進(jìn)輪蟲的種群增長和繁殖；二是L-肉堿首先作用于細(xì)菌，促進(jìn)細(xì)菌的代謝和繁殖，為輪蟲提供豐富的餌料，進(jìn)而促進(jìn)輪蟲的種群增長和繁殖[6]。本試驗(yàn)以氯霉素作為抑菌劑，采用正常培養(yǎng)與抑菌培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式，探討L-肉堿對輪蟲種群增長和繁殖的影響，旨在探索輪蟲強(qiáng)化過程中L-肉堿、輪蟲和細(xì)菌的相互關(guān)系，為進(jìn)一步揭示細(xì)菌在L-肉堿強(qiáng)化輪蟲中的作用提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

圓型臂尾輪蟲，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；L-肉堿(貨號：C0158)，購自Sigma公司；97-B型“魚蝦寶”速溶海水晶，廣東茂名鹽業(yè)總公司生產(chǎn)；“安琪”牌高活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；氯霉素，成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，使用前將其配成高濃度的溶液。

1.2方法

1.2.1輪蟲的培養(yǎng)試驗(yàn)前輪蟲在裝鹽水的10 L廣口瓶中培養(yǎng)(鹽度為20‰(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同))，培養(yǎng)時(shí)保持連續(xù)充氣，自然光照，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，輪蟲餌料為酵母溶液，每天投餌一次，餌料投喂量為 8×106mL-1。

1.2.2培養(yǎng)用水的配制試驗(yàn)用海水有兩種：(1)人工海水。先用沸水將海水晶融化，再用自來水與其混合配制成鹽度為20‰的人工海水，經(jīng)55 μm篩絹過濾后再充分曝氣24 h，備用。(2)無菌海水。將人工海水高壓滅菌(103 kPa、121 ℃下滅菌30 min)。

1.2.3酵母投喂量的確定及純酵母的制備試驗(yàn)開始前，先進(jìn)行酵母投喂量預(yù)試驗(yàn)：選取活力較好且不攜卵的輪蟲作為試驗(yàn)對象，將輪蟲按照1 mL-1的密度接種在不同密度(1，5，8，10，12，15，20mL-1)的酵母溶液中，(25±1) ℃、自然光照下培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)體積為3 mL，培養(yǎng)液由酵母和人工海水配制而成，鹽度為20‰，期間每12 h更換1次培養(yǎng)液，確保各組培養(yǎng)液中酵母細(xì)胞密度的相對恒定。每個(gè)處理6次重復(fù)。最終根據(jù)各組輪蟲的瞬時(shí)增長率確定酵母的最佳投喂量為8×106mL-1。

純酵母的制備：用干酵母與無菌海水配成酵母菌溶液，將菌液接種于固體馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，然后挑取單個(gè)酵母菌落，接種于液體馬鈴薯培養(yǎng)基中，再置于恒溫水浴振蕩搖床中振蕩培養(yǎng)48 h。投喂前將純培養(yǎng)的酵母溶液用低溫冷凍離心機(jī)離心20 min(轉(zhuǎn)速為3 000 r/min)，棄去上清液，底部固體即為純酵母菌。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，分別為對照組、L-肉堿組、氯霉素組、L-肉堿+氯霉素組，各組培養(yǎng)條件見表1。培養(yǎng)容器為1 L錐形瓶，培養(yǎng)液體積為500 mL，輪蟲接種密度為250 mL-1,酵母投喂量為8×106mL-1，肉堿添加量為1 mg/L(僅在試驗(yàn)開始時(shí)添加)，氯霉素添加量為0.012 5 mg/mL[11](每24 h添加1次),每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度為(25±1) ℃，試驗(yàn)期5 d。所有儀器設(shè)備在試驗(yàn)開始前均進(jìn)行滅菌處理。

表 1　不同組圓型臂尾輪蟲的處理?xiàng)l件Table 1　Treatment conditions of Brachionus rotundiformis in different treatments

注：“+”表示添加；“-”表示不添加。

Note：“+” Indicates addition；“ -” Indicates no addition.

1.4測定指標(biāo)及方法

1.4.1細(xì)菌含量每24 h從各錐形瓶中抽取5 mL輪蟲培養(yǎng)液，經(jīng)孔徑55 μm篩絹過濾，將濾液稀釋10-2，10-3，10-4倍后涂布于2216E固體海水培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)[12]。

1.4.2輪蟲的種群密度和懷卵率每24 h從各錐形瓶中隨機(jī)取3 mL輪蟲培養(yǎng)液，統(tǒng)計(jì)輪蟲的種群密度和懷卵率[6]。取樣在無菌操作臺上進(jìn)行。

懷卵率=卵個(gè)數(shù)/輪蟲總數(shù)量×100%。

1.4.3輪蟲的個(gè)體大小在試驗(yàn)最后一天，從每試驗(yàn)組中隨機(jī)取120個(gè)輪蟲，用體積分?jǐn)?shù)6.5%的鹽酸固定，測定其背甲長和背甲寬[6]。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用單因子方差分析(One-way ANOVA)比較各試驗(yàn)組輪蟲的種群密度、懷卵率及背甲長、寬的差異顯著性；應(yīng)用LSD多重檢驗(yàn)比較各處理差異，差異顯著性水平值設(shè)為0.05，所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS16.0軟件完成。誤差和置信區(qū)間用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SE)”表示。

2　結(jié)果與分析

2.1L-肉堿對輪蟲培養(yǎng)液中細(xì)菌含量的影響

L-肉堿對圓型臂尾輪蟲培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)量的影響結(jié)果見圖1。

圖 1L-肉堿對圓型臂尾輪蟲培養(yǎng)液中細(xì)菌含量的影響

圖柱上不同字母表示各處理組間差異顯著(P<0.05)。圖2同

Fig.1Effects of L-carnitine on bacteria content ofBrachionusrotundiformisin different treatments

Different letters indicate significant difference among treatments(P<0.05).The same as Fig.2

由圖1可見，4個(gè)處理輪蟲培養(yǎng)液中細(xì)菌含量均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增多。3～5 d L-肉堿組的細(xì)菌含量均顯著高于其他3組(P<0.05)；2～4 d氯霉素組和L-肉堿+氯霉素組的細(xì)菌含量顯著低于對照組(P<0.05)，但這兩組之間的差異不顯著(P>0.05)；第5 天除L-肉堿組外其他3組之間細(xì)菌含量差異不顯著(P>0.05)。2～5 d氯霉素組的細(xì)菌含量分別為L-肉堿組的21.45%，51.53%，60.02%和 61.66%，L-肉堿組的細(xì)菌數(shù)量分別為對照組的1.21，1.4，1.05和1.55倍。

2.2L-肉堿對輪蟲種群密度的影響

圖2顯示，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，4個(gè)處理組輪蟲的種群密度均呈上升趨勢，其中L-肉堿組輪蟲的種群密度均高于其他3組。1～3 d各處理組輪蟲的種群密度無顯著差異(P>0.05)；4～5 d L-肉堿組輪蟲的種群密度顯著高于其他3組(P<0.05)，而其他3組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.3L-肉堿對輪蟲懷卵率的影響

圖2顯示，4個(gè)處理組輪蟲懷卵率均在試驗(yàn)第2天達(dá)到峰值。除第2天外，其他4 d對照組和L-肉堿+氯霉素組輪蟲的懷卵率均高于L-肉堿組和氯霉素組，但各組輪蟲的懷卵率差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

圖 2L-肉堿對圓型臂尾輪蟲種群密度和懷卵率的影響

Fig.2Effects of L-carnitine on population density and egg ratio ofBrachionusrotundiformis

2.4L-肉堿對輪蟲個(gè)體大小的影響

圖3顯示，氯霉素組和L-肉堿+氯霉素組輪蟲的背甲長差異不顯著，但均極顯著大于對照組和L-肉堿組(P<0.01)；L-肉堿組輪蟲的背甲長極顯著大于對照組(P<0.01)。氯霉素組的輪蟲背甲寬顯著大于其他3組(P<0.05)，而其他3組差異不顯著(P>0.05)。

圖 3　L-肉堿對輪蟲個(gè)體大小的影響(n=120)圖柱上不同大寫字母表示各處理組間 背甲長差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示各處理組間背甲寬差異顯著(P<0.05)Fig.3　Effects of L-carnitine on body size ofBrachionus rotundiformis (n=120) Different capitals letters indicate extremely significant difference in length among treatments(P<0.01) and different lowercase indicate significant difference in width among treatments(P<0.05)

3　討　論

高等動物體內(nèi)L-肉堿的主要功能是在線粒體內(nèi)參與機(jī)體的β氧化，但細(xì)菌對L-肉堿的利用與高等動物不同，因?yàn)榧?xì)菌體內(nèi)沒有線粒體[13]，可能不能進(jìn)行β氧化反應(yīng)[14-15]，所以細(xì)菌可能不是通過脂肪酸β氧化的方式利用L-肉堿的，而是將L-肉堿作為能量來源并將其代謝成其他物質(zhì)[9-10]。不同種類的細(xì)菌代謝L-肉堿的方式不同：第1種方式是一些腸道桿菌，如大腸桿菌(Escherichiacoil)、變形桿菌(Proteusvulgaris)和沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)等，能在厭氧及碳源、氮源存在的條件下將L-肉堿經(jīng)巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)變?yōu)棣?丁基甜菜堿；第2種方式是不動桿菌(Acinetobacter)等細(xì)菌以L-肉堿為惟一的碳源，分解其碳架而形成三甲胺；第3種方式是一些細(xì)菌在有氧條件下以L-肉堿為惟一的碳源及氮源，如假單胞菌(Pseudomonas)[10]。海水輪蟲培養(yǎng)水體中的細(xì)菌主要屬于假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、弧菌屬(Vibrio)、黃桿菌屬(Flavobacterium)[16]，其中假單胞菌屬和不動桿菌屬的細(xì)菌數(shù)量較多，所以本試驗(yàn)輪蟲培養(yǎng)液中的細(xì)菌應(yīng)是主要通過后2種方式利用L-肉堿。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，3～5 d L-肉堿組的細(xì)菌數(shù)量顯著高于其他3組(P<0.05)，4～5 d輪蟲種群密度顯著高于其他3組(P<0.05)，說明L-肉堿對細(xì)菌的影響比對輪蟲種群密度的影響明顯；各組細(xì)菌含量在第2 天就出現(xiàn)了顯著差異，而各組輪蟲的種群密度到第4 天才有顯著性差異。這說明L-肉堿很可能是先作用于細(xì)菌，促進(jìn)細(xì)菌的繁殖，之后細(xì)菌又作為輪蟲的餌料促進(jìn)了輪蟲的種群增長。輪蟲培養(yǎng)液中的一些細(xì)菌能夠?qū)-肉堿代謝成其自身需要的能量和營養(yǎng)物質(zhì)[10，16]，因此在輪蟲培養(yǎng)液中添加L-肉堿能夠促進(jìn)細(xì)菌的繁殖。細(xì)菌數(shù)量的增多，不僅為輪蟲提供了豐富的餌料，促進(jìn)輪蟲的生長繁殖，而且細(xì)菌在生長和繁殖過程中產(chǎn)生的大量代謝產(chǎn)物(包括氨基酸、核苷酸、多糖、脂類和維生素等[17])，對輪蟲的生長也有促進(jìn)作用[18-21]。本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，2～4 d氯霉素組和L-肉堿+氯霉素組的細(xì)菌數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05)，而到第5 天這3組的細(xì)菌含量沒有顯著差異(P>0.05)，這很可能與氯霉素的自身特性和細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。氯霉素在臨床上的抑菌給藥劑量為0.02～0.08 mg/(g·d)，在養(yǎng)殖實(shí)踐中為減少藥物對養(yǎng)殖動物的毒性常適當(dāng)降低其給藥劑量，本試驗(yàn)采用的氯霉素質(zhì)量濃度為0.012 5 mg/mL，比臨床用量略低，只能起到抑菌的效果，不能絕對殺死細(xì)菌[11]，且氯霉素在水生動物體內(nèi)的半衰期約為24 h，24 h后殺菌作用就會降低[22]；有研究表明，在連續(xù)使用低劑量抗生素的環(huán)境下，細(xì)菌會逐漸產(chǎn)生一定的抗藥性[23]。因此，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，對照組、氯霉素組和L-肉堿+氯霉素組之間細(xì)菌含量的變化是符合實(shí)際的。王金秋等[11]研究表明，0.012 5 mg/mL氯霉素在有效抑制細(xì)菌生長的同時(shí)，能夠通過影響輪蟲生殖方式促進(jìn)輪蟲種群增長，因此本試驗(yàn)中 2～4 d對照組與氯霉素處理組(氯霉素組和L-肉堿+氯霉素組)的細(xì)菌含量雖然差異顯著(P<0.05)，但輪蟲的種群密度并沒有顯著差異(P>0.05)。同時(shí)，本研究中各組輪蟲懷卵率并沒有顯著差異(P>0.05)，這與Zhang等[6]和王金秋等[11]的研究結(jié)果相似。添加的1 mg/L L-肉堿主要被輪蟲培養(yǎng)液中細(xì)菌代謝所利用，促進(jìn)了細(xì)菌的繁殖，不能影響輪蟲的生殖方式和懷卵率。而添加0.012 5 mg/mL氯霉素能夠抑制輪蟲種群中的有性生殖，保持輪蟲的孤雌生殖狀態(tài)，但不會提高輪蟲懷卵率。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，氯霉素對輪蟲個(gè)體大小有顯著影響(P<0.05)，氯霉素組輪蟲背甲長和背甲寬顯著大于L-肉堿組和對照組(P<0.05)。輪蟲是魚、蝦、蟹等水生動物的優(yōu)良餌料，其個(gè)體大小會影響某些開口魚苗的攝食率。大量研究結(jié)果表明，重金屬、食物含量等因素均會通過影響輪蟲的種群密度影響輪蟲的個(gè)體大小[24-25]。然而，本研究中氯霉素處理組(氯霉素組和L-肉堿+氯霉素組)與對照組輪蟲種群密度并沒有顯著差異，這說明氯霉素對輪蟲個(gè)體大小的影響不是通過影響輪蟲種群密度產(chǎn)生的。黨志超等[26]研究了三丁基錫(TBT)對褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)的影響，結(jié)果表明2.0 μg/L以上的三丁基錫(TBT)可以導(dǎo)致輪蟲個(gè)體變大。三丁基錫和氯霉素都有殺菌作用，它們在輪蟲培養(yǎng)液中很可能會抑制輪蟲的生物反應(yīng)速率，進(jìn)而影響輪蟲的個(gè)體大小，其具體機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of L-carnitine on population growth and body size of rotifers,Brachionusrotundiformis

CHEN Yuke1,LIN Lili2,LIU Hongjian2,WANG Qiuju1,YANG Yiyu1,LUO Sha1,GAO Yongsheng1,ZHANG Dongming1

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2FisheryTechnicalExtensionStationofJilinProvince,Changchun,Jilin130012,China)

【Objective】 The effects of L-carnitine(LC) on population growth,body size and egg ratio of rotifersBrachionusrotundiformiswere studied. 【Method】 Rotifers were enriched with 1 mg/L L-carnitine supplements dissolved in culturing medium on the first day in a 1 L batch culture trial for 5 days and fed with pure cultured yeast.The bacteria community in culture medium was controlled by daily addition of 0.012 5 mg/mL chloramphenicol.Four treatments including control group (no added chloramphenicol and carnitine),carnitine groups (LC groups),chloramphenicol groups (CAP groups),and carnitine+chloramphenicol groups(LC+CAP groups) were designed and the population density,bacterial quantity,lorica length and lorica width of each group were detected every day.【Result】 The bacteria number of carnitine groups was significantly (P<0.05) higher than that of other groups during 3-5 days.In comparison with the control,the bacteria numbers of CAP group and LC+CAP group were significantly lower (P<0.05) during 2-4 days,but there was no significant difference between them (P>0.05).There were no significant differences(P>0.05)in bacteria number among the control,CAP and LC+CAP in the 5th day.The population density in all treatments had an increase trend,with the highest value in LC treatment.No significant differences were found (P>0.05) in egg ratios of all groups.The daily addition of chloramphenicol significantly affected body size of treated rotifers,and the lorica length and lorica width of rotifers were significantly larger(P<0.05) in CAP treatment compared to other treatments.【Conclusion】 L-carnitine affected the population growth of rotifers through the effects on bacteria community.

Brachionusrotundiformis;L-carnitine;chloramphenicol;population growth;egg ratio

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2015-01-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671621，31372540,30972191)；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)青年啟動基金項(xiàng)目(201324)；吉林省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(2011002-1)；東北老工業(yè)基地外貿(mào)發(fā)展項(xiàng)目

陳玉珂(1983-)，男，河南鄭州人，博士，主要從事水生動物營養(yǎng)與飼料學(xué)研究。E-mail:chenyuke0316@163.com

張東鳴(1962-)，男，吉林長春人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事水生動物營養(yǎng)與飼料學(xué)研究。

E-mail:dongmingzhang0431@aliyun.com

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A

1671-9387(2016)08-0007-06

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