Fetuin-A基因多態(tài)性(rs4917，rs4918)與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系

李文君，　朱　可，　趙冬雪，　馮　娟

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Fetuin-A基因多態(tài)性(rs4917，rs4918)與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系

李文君，朱可，趙冬雪，馮娟

目的探討遼寧地區(qū)漢族人群胎球蛋白A(fetuin-A)基因的rs4917和rs4918多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)的相關(guān)性。 方法納入ACI患者167例作為病例組，135例同期體檢的健康人作為正常對(duì)照組。通過(guò)改良多重連接酶反應(yīng)技術(shù)(improved multiplex ligation detection reaction，IMLDR)檢測(cè)fetuin-A基因rs4917和rs4918多態(tài)性。應(yīng)用多因素Logistic回歸分析研究基因多態(tài)性與ACI的相關(guān)性。結(jié)果病例組與對(duì)照組rs4917和rs4918基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；病例組患者rs4917的T等位基因頻率和rs4918的G等位基因頻率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；進(jìn)一步構(gòu)建顯性模型和隱性模型，在隱性模型下兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在平衡了ACI各危險(xiǎn)因素后，Logistic回歸分析顯示在隱性模型下rs4917及rs4918仍與ACI易感性相關(guān)(OR3.039，P=0.017，95%CI1.217～7.589)。結(jié)論fetuin-A基因rs4917及rs4918多態(tài)性與遼寧地區(qū)漢族人群ACI易感性相關(guān)；rs4917的T/T基因型及rs4918的G/G基因型可能是遼寧地區(qū)漢族人群ACI的危險(xiǎn)因素。

動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死；胎球蛋白A；基因多態(tài)性

胎球蛋白A(fetuin-A)是一種在血液中含量豐富的糖蛋白，在人體中主要由肝臟和脂肪組織合成和分泌[1]。fetuin-A可抑制炎癥因子的產(chǎn)生和聚集[2]；可與血液中多余的鈣、磷等離子形成復(fù)合體，阻止鈣、磷在血管內(nèi)皮的沉積，因此可能在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成中起到保護(hù)作用[3]。然而，有研究顯示fetuin-A可促進(jìn)胰島素抵抗[4],影響脂肪代謝[5]，因此也有學(xué)者認(rèn)為fetuin-A可增加AS的風(fēng)險(xiǎn)[6]。動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)是以AS為疾病基礎(chǔ)的多基因相關(guān)性疾病。其病因復(fù)雜，遺傳和環(huán)境的共同作用促使了ACI的發(fā)生。近年來(lái)，隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)基因多態(tài)性的探討已成為疾病易感性研究的熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于fetuin-A基因多態(tài)性與心腦血管疾病的研究相對(duì)較少且結(jié)論并不統(tǒng)一，因此本研究旨在探討fetuin-A基因rs4917及rs4918多態(tài)性與ACI的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1病例組選取2015年6月-2016年2月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者，共167例，其中男117例,女50例。均為遼寧地區(qū)漢族人群，彼此無(wú)親緣關(guān)系。入選病例均符合第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議所制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)及改良TOAST分型標(biāo)準(zhǔn)[7,8]，經(jīng)頭部CT和(或)MRI證實(shí)，并且進(jìn)行顱多普勒、顱腦血管超聲、頭部MRA、心臟超聲等檢查。 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并出血的腦梗死；(2)合并腫瘤、自身免疫性疾病，嚴(yán)重心、肝、腎功能不全；(3)患急慢性感染者；(4)心源性或凝血機(jī)制異常所致的腦梗死；(5)先天血管畸形或動(dòng)脈炎導(dǎo)致腦梗死的患者；(6)既往或目前進(jìn)行血液透析患者；(7)既往冠心病患者或既往腦梗死患者等。

1.1.2對(duì)照組隨機(jī)選取同期在我院體檢中心的健康體檢者135 例，男90例，女45例。經(jīng)影像學(xué)證實(shí)無(wú)冠心病或既往腦梗死。均為遼寧地區(qū)人群，彼此無(wú)親緣關(guān)系，其年齡和性別與病例組均匹配。排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。

1.2臨床資料的采集該研究符合我院所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，入組者均簽署知情同意書。所有入組者進(jìn)行詳細(xì)的體格檢查和病史詢問(wèn)。病例組和對(duì)照組均晨起空腹抽血，進(jìn)行血脂、血糖等生化學(xué)檢測(cè)，并記錄其高血壓、糖尿病病史以及吸煙、飲酒等個(gè)人情況。

1.3基因多態(tài)性檢測(cè)所有受試者于清晨抽取靜脈血4 ml，其中2 ml用于血脂、血糖等生化學(xué)檢測(cè)。剩余2 ml加入EDTA抗凝，-80 ℃低溫保存待提取DNA。 按照天根公司DNA提取試劑盒上的操作步驟提取DNA后立即低溫保存。DNA的測(cè)序及引物設(shè)計(jì)由上海天昊生物有限公司完成。采用改良多重連接酶反應(yīng)技術(shù)(improved multiplex ligation detection reaction，IMLDR)對(duì)rs4917及rs4918進(jìn)行基因分型(PCR引物及連接引物見表1)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s(每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃),75 ℃ 1.5 min，以上步驟重復(fù)11次；94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，以上步驟重復(fù)24次；72 ℃延伸2 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后在10 μl PCR產(chǎn)物中加入5 U 蝦堿酶(SAP酶)和2 U核酸外切酶I(Exonuclease I)，37 ℃溫浴1 h,然后75 ℃滅活15 min。連接酶反應(yīng)體系：10×連接緩沖液 1 μl、高溫連接酶 0.25 μl、5’連接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μl、3’連接引物混合液(2 μmol/L)0.4 μl、純化后多重PCR產(chǎn)物 2 μl、dd H2O 6 μl 混勻。連接程序：94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min，進(jìn)行38次循環(huán)。連接結(jié)束后取0.5 μl 稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μl 500相對(duì)分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)(Liz500 sizestandard)、9 μl甲酰胺變性劑(Hi-Di)混勻， 95 ℃變性5 min后上ABI3730XL測(cè)序儀，測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems,USA) 來(lái)分析。隨機(jī)選取10%的樣本進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，評(píng)價(jià)基因型結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2　結(jié)　果

2.1病例組和對(duì)照組一般情況比較病例組和對(duì)照組比較，年齡、性別、甘油三脂、總膽固醇、低密度脂蛋白、載脂蛋白B無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；吸煙、飲酒、糖尿病、高血壓、血脂異常、高密度脂蛋白、載脂蛋白A1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

2.2等位基因頻率及基因型分布病例組和對(duì)照組2個(gè)SNP均滿足Hardy-Weinberg平衡：對(duì)照組rs4917(χ2=1.075，P=0.364)，rs4918(χ2=1.075，P=0.364)；病例組rs4917(χ2=0.823，P=0.2997)，rs4918(χ2=0.823，P=0.2997)；病例組rs4917，rs4918基因型分布與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；病例組rs4917的T等位基因頻率和rs4918的G等位基因頻率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表3)。

2.3rs4917及rs4918與ACI的相關(guān)性進(jìn)一步構(gòu)建模型分析rs4917和rs4918與ACI的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)隱性模型在病例組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；顯性模型在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

2.4Logistic回歸分析在平衡了高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒、血脂異常、高密度脂蛋白、載脂蛋白A1后Logistic回歸分析顯示在隱性模型下rs4917及rs4918仍與ACI易感性相關(guān)(OR=3.039，95%CI：1.217～7.589，P=0.017)。此結(jié)果提示rs4917T/T基因型和rs4918G/G基因型人群患ACI幾率增加3.039倍(見表5)。

表1　PCR引物及連接引物

表2　病例組和對(duì)照組一般情況分析

注: TG=甘油三酯；TC=總膽固醇；HDL=高密度脂蛋白；LDL=低密度脂蛋白；ApoA1=載脂蛋白A1；ApoB=載脂蛋白B。a=t檢驗(yàn)，b=χ2檢驗(yàn)，*為P<0.05

表3　基因型分布與基因頻率

表4　rs4917/rs4918基因多態(tài)性與ACI的相關(guān)性

注：rs4917隱性模型：TT比TC+CC;顯性模型：TC+TT比CC；rs4918隱性模型：GG比GC+CC;顯性模型：GC+GG比CC

表5　rs4917/rs4918與ACI相關(guān)性的Logistic回歸分析

注：HDL=高密度脂蛋白；ApoA1=載脂蛋白A1；rs4917即T/T比(T/C+C/C)；rs4918即G/G比(G/C+C/C)

3　討　論

Fetuin-A在人體血清中含量豐富，隨著年齡的增長(zhǎng)fetuin-A濃度逐漸下降，在成人血液中濃度大約為300～1000 μg/ml[9]。近年來(lái)，fetuin-A與血管性疾病的關(guān)系逐漸引起關(guān)注。Scialla[10]對(duì)602例透析患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)血清低濃度f(wàn)etuin-A會(huì)增加心血管疾病的死亡率。Jensen MK[11]分析了3810例大于65歲的非肥胖老年人，發(fā)現(xiàn)血清中fetuin-A增加可減少心血管疾病發(fā)生率。這些實(shí)驗(yàn)都說(shuō)明fetuin-A在血管性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起保護(hù)作用。這可能是因?yàn)閒etuin-A可與血液中多余的鈣、磷等礦化離子形成直徑約50～300 nm的膠體球，通過(guò)清道夫受體被單核巨噬系統(tǒng)識(shí)別并清除，從而抑制了血管的鈣化[12]。同時(shí)，fetuin-A還可滅活巨噬細(xì)胞；抑制與AS相關(guān)的炎癥前因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)等[1,2]。 然而fetuin-A也是一種胰島素受體酪氨酸激酶抑制劑，可以和胰島素受體的β亞基結(jié)合，抑制受體的自身磷酸化，從而抑制胰島素信號(hào)通路[4]。Mori K[13]發(fā)現(xiàn)fetuin-A濃度可能和胰島素抵抗成正相關(guān)。Obuchi A[14]還發(fā)現(xiàn)fetuin-A可促進(jìn)代謝綜合征的發(fā)生，可能與總膽固醇水平、低密度脂蛋白、非高密度脂蛋白、甘油三脂等成正相關(guān)，而與高密度脂蛋白成負(fù)相關(guān)。因?yàn)橐葝u素抵抗和代謝綜合征都是AS的危險(xiǎn)因素，因此，一些學(xué)者認(rèn)為fetuin-A可能是AS的危險(xiǎn)因素。Rittig[15]研究315例糖尿病高危因素人群，發(fā)現(xiàn)血清fetuin-A與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度正相關(guān)。Zhao ZW[16]的實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明在2型糖尿病患者中，fetuin-A和冠狀動(dòng)脈血管疾病的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。Roos[17]等認(rèn)為血清fetuin-A和血管性疾病的關(guān)系具有雙面性，這種雙面性取決于AS的程度。在無(wú)糖尿病和無(wú)既往血管性疾病的人群，fetuin-A濃度與血管性疾病成正相關(guān)，但在已經(jīng)患有血管性疾病的患者，fetuin-A的濃度與血管性疾病嚴(yán)重程度成負(fù)相關(guān)。這可能是因?yàn)?，在血管性疾病的早期，fetuin-A因促進(jìn)胰島素抵抗和血脂代謝異常導(dǎo)致血管功能紊亂。然而隨著血管疾病的發(fā)展，因其可抑制血管鈣化以及抑制炎癥因子，所以抑制血管性疾病的發(fā)展[16]。

編碼fetuin-A的基因位于人類3號(hào)染色(3q27)上，已有30多個(gè)位點(diǎn)被證實(shí)具有多態(tài)性，其中包括rs4917和rs4918。已有研究表明rs4917、rs4918突變與fetuin-A血清濃度明顯相關(guān)，野生純合子人群fetuin-A濃度最高，突變雜合子濃度次之；而突變純合子基因型人群中fetuin-A濃度最少[18]。因此，rs4917和rs4918位點(diǎn)突變可能通過(guò)改變fetuin-A濃度而影響心腦血管疾病的易感性。先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一致。Fisher[19]的實(shí)驗(yàn)表明rs4917C等位基因是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的危險(xiǎn)因素。Coker-Gurkan A[20]研究證明在歐洲>40歲的人群中rs4917位點(diǎn)T突變是心肌梗死的危險(xiǎn)因素,而Shanshan Ma[21]的實(shí)驗(yàn)則證明中國(guó)人群rs4918位點(diǎn)G等位基因突變與ACI發(fā)病相關(guān)，是其危險(xiǎn)因素。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在病例組中rs4917位點(diǎn)T等位基因頻率、T/T基因型分布以及rs4918位點(diǎn)G等位基因頻率、G/G基因型分布均與對(duì)照組有明顯差異，在校正了多種混雜因素后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rs4917位點(diǎn)T/T比(C/T+C/C)和rs4918位點(diǎn)G/G比(C/G+C/C),OR=3.039。此結(jié)果提示rs4917T/T基因型和rs4918G/G基因型人群ACI易感性增加3.039倍。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)rs4917位點(diǎn)T突變與rs4918位點(diǎn)G突變是存在連鎖關(guān)系的，這在歐洲人群中也有類似報(bào)道[20]。

雖然本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有測(cè)量fetuin-A濃度，不能直接證明fetuin-A基因突變是通過(guò)改變fetuin-A濃度來(lái)影響ACI易感性的，但是因?yàn)閒etuin-A的濃度在體內(nèi)變化較大，且與腎功能、炎癥、糖尿病等疾病狀態(tài)相關(guān)[18]，而fetuin-A基因序列相對(duì)恒定，因此從一定意義上來(lái)講，研究fetuin-A基因多態(tài)性更能說(shuō)明其與ACI易感性的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)樣本量相對(duì)較小，且只是單中心病例對(duì)照研究，可能導(dǎo)致結(jié)果的偏移，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，故仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。

[1]Li W,Zhu S,Li J,et al.A hepatic protein,fetuin-A,occupies a protective role in lethal systemic inflammation[J].PLoS One,2011,6(2):16945.

[2]Celebi G,Genc H,Gurel H,et al.The relationship of circulating fetuin-a with liver histology and biomarkers of systemic inflammation in nondiabetic subjects with nonalcoholic fatty liver disease[J].Saudi J Gastroenterol,2015,21(3):139-145.

[3]Herrmann M,Sch A Fer C,Heiss A,et al.Clearance of fetuin-A-containing calciprotein particles is mediated by scavenger receptor-A[J].Circulation Res,2012,111(5):575-584.

[4]Goustin AS,Derar N,Abou-Samra AB.Ahsg-fetuin blocks the metabolic arm of insulin action through its interaction with the 95-kD β-subunit of the insulin receptor[J].Cellular Signalling,2013,25(4):981-988.

[5]Noureldein MH,El-Razek RSA,El-Hefnawy MH,et al.Fenofibrate reduces inflammation in obese patients with or without type 2 diabetes mellitus via sirtuin 1/fetuin A axis[J].Diabetes Res Clinic Practice,2015,109(3):513-520.

[6]Dogru T,Genc H,Tapan S,et al.Plasma fetuin-A is associated with endothelial dysfunction and subclinical atherosclerosis in subjects with nonalcoholic fatty liver disease[J].Clinic Endocrinol,2013,78(5):712-717.

[7]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)科學(xué)會(huì).各類腦血管病診斷要點(diǎn)[J].中華神經(jīng)科雜志,1996,29:379.

[8]Han SW,Kim SH,Lee JY,et al.A new subtype classification of ischemic stroke based on treatment and etiologic mechanism [J].Eur Neurol,2007,57:96-102.

[9]Trepanowski JF,Mey J,Varady KA.Fetuin-A:a novel link between obesity and related complications[J].Int J Obesity,2015,39(5):734-741.

[10]Scialla JJ,Kao WL,Crainiceanu C,et al.Biomarkers of vascular calcification and mortality in patients with ESRD[J].ClinicJ Am Societ Nephrol,2014,9(4):745-755.

[11]Jensen MK,Bartz TM,Mukamal KJ,et al.Fetuin-A,Type 2 diabetes,and risk of cardiovascular disease in older adults,The Cardiovascular Health Study[J].Diabetes Care,2013,36(5):1222-1228.

[12]Heiss A,DuChesne A,Denecke B,et al.Structural basis of calcification inhibition by α2-HS glycoprotein/fetuin-A formation of colloidal calciprotein particles[J].J Biologic Chemist,2003,278(15):13333-13341.

[13]Mori K,Emoto M,Yokoyama H,et al.Association of serum fetuin-A with insulin resistance in type 2 diabetic and nondiabetic subjects[J].Diabetes Care,2006,29(2):468-468.

[14]Obuchi A,Adachi H,Enomoto M,et al.High plasma fetuin-A levels are associated with metabolic syndrome among males but not females in a Japanese general population[J].Diabetes Res Clinic Practice,2014,106(1):128-135.

[15]Rittig K,Thamer C,Haupt A,et al.High plasma fetuin-A is associated with increased carotid intima-media thickness in a middle-aged population[J].Atherosclerosis,2009,207(2):341-342.

[16]Zhao Z,Lin C,Wu L,et al.Serum fetuin-A levels are associated with the presence and severity of coronary artery disease in patients with type 2 diabetes[J].Biomarkers,2013,18(2):160-164.

[17]Roos M,Oikonomou D,von Eynatten M,et al.Associations of fetuin-A levels with vascular disease in type 2 diabetes patients with early diabetic nephropathy[J].Cardiovasc Diabetol,2010,9(1):48-54.

[18]Laugsand LE,Ix JH,Bartz TM,et al.Fetuin-A and risk of coronary heart disease:A Mendelian randomization analysis and a pooled analysis of AHSG genetic variants in 7 prospective studies[J].Atherosclerosis,2015,243(1):44-52.

[19]Fisher E,Stefan N,Saar K,et al.Association of AHSG gene polymorphisms with fetuin-A plasma levels and cardiovascular diseases in the EPIC-Potsdam study[J].Circulation:Cardiovascular Genetics,2009,2(6):607-613.

[20]Coker-Gurkan A,Coskun D,Arisan E D,et al.Fetuin-A 742 (C/T) and 766 (C/G) polymorphic sites are associated with increased risk of myocardial infarction in older patients (≥ 40 years of age)[J].Molecular Med Reports,2015,12(1):1356-1362.

[21]Ma S,He Z,Zhao J,et al.Association of AHSG gene polymorphisms with ischemic stroke in a Han Chinese population[J].Biochemical Genetics,2013,51(11/12):916-926.

Correlation between fetuin-A gene polymorphism(rs4917，rs4918) and atherosclerosis cerebral infarction

LIWenjuan,ZHUKe,ZHAODongxue,etal.

(DepartmentofNeurology,ShengjingHospitalAffiliatedtoChinaMedicalUniversity,ShenyangofLiaoningProvince,Shenyang110004,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between fetuin-A rs4917 and rs4918 gene polymorphism and atherosclerosis cerebral infarction (ACI) in Han population of Liaoning area.MethodsA total of 167 patients with ACI were enrolled as the case group and 135 healthy subjects over the same period were enrolled as the control group.The improved multiplex ligase chain reaction (IMLDR) was used to perform genotyping for fetuin-A gene rs4917 and rs4918.And the correlation between the gene polymorphism and ACI was analyzed with multivariate logistic regression analysis.ResultsGenotype distribution of rs4917 and rs4918 in the case group was different(P<0.05) from the control group;T allele frequency in rs4917 and G allele frequency in rs4918 in the case group were different (P<0.01) from the control group;when build the dominant and recessive model,there was difference(P<0.01) between the two groups in recessive model;After adjusting for risk factors of ACI,multiple logistic regression analysis showed rs4917 and rs4918 still have correlation with susceptibility of ACI(OR=3.039，P=0.017，95%CI：1.217～7.589).ConclusionFetuin-A gene rs4917 and rs4918 polymorphisms have correlation with susceptibility of ACI in Han population of Liaoning area.The T/T genotype of rs4917 and G/G genotype of rs4918 may be risk factors for ACI susceptibility.

Fetuin-A;Atherosclerosis cerebral infarction;Gene polymorphis

1003-2754(2016)08-0719-05

2016-04-22；

2016-05-29

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110000)

馮娟，E-mail：cmufengjuan@sina.com

R743.1

A