創(chuàng)傷后應激障礙大鼠海馬中腦源性生長因子的表達變化

張偉國，　杜　喆，　杜惠蓮

?

創(chuàng)傷后應激障礙大鼠海馬中腦源性生長因子的表達變化

張偉國1，杜喆2，杜惠蓮2

目的研究創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)大鼠血漿、海馬CA1區(qū)和齒狀回神經元內腦源性生長因子(BDNF)的變化。方法用單一連續(xù)刺激(SPS)方法刺激大鼠產生PTSD模型,另進行強迫游泳(FS)刺激作為對照，ELISA檢測不同時間(正常、刺激后2 h、12 h、1 d、7 d以及7 d后再次給予強迫游泳后2 h)大鼠血漿BDNF；取SPS后2 h、7 d、SPS+再次游泳后2 h和FS+再次游泳后2 h鼠腦組織，正常腦組織為對照，免疫組織化學技術觀察大鼠海馬神經元內BDNF的表達，以及采用熒光實時定量PCR法檢測大鼠海馬神經元內的BDNF-mRNA相對表達。結果大鼠經SPS刺激后2 h時血漿BDNF明顯高于正常，7 d時與正常大鼠無明顯差異，SPS+再游泳-2 h時明顯高于各時間段及FS+再游泳后2 h；大鼠海馬CA1區(qū)、齒狀回內BDNF的表達以及海馬內BDNF-mRNA相對表達也出現(xiàn)相似的改變。結論PTSD大鼠血漿中BDNF濃度變化與海馬內BDNF表達相關，BDNF的改變影響PTSD大鼠對創(chuàng)傷刺激的恐懼記憶形成、鞏固和再攝取。

創(chuàng)傷后應激障礙;單一連續(xù)刺激;海馬;腦源性生長因子

腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作為一種神經生長因子廣泛存在于哺乳動物腦內各結構(尤其海馬和皮質)，其作用是促進神經細胞生存、神經發(fā)生、增加突觸可塑性，進而影響學習過程和記憶形成[1]。創(chuàng)傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是受到嚴重應激后心理失去平衡而產生的一種異常的心理障礙和行為異常表現(xiàn)。例如：反復的創(chuàng)傷性體驗重現(xiàn)、持續(xù)性回避、持續(xù)的警覺增高等。因此，海馬作為應激反應的整合部位，對動物的記憶、學習有著基本的作用，與PTSD發(fā)病有著重要的相關性[2,3]。因此，本研究通過觀察，檢測PTSD樣大鼠海馬內BDNF和血漿中BDNF的變化，揭示BDNF與PTSD的發(fā)病有密切的聯(lián)系。

1　材料和方法

1.1實驗動物雄性Wistar大鼠，體質量180～200 g[沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供，SCXK(遼)2014-0001]，隨機分為：正常組(8只)、單一連續(xù)刺激(Single prolonged stress，SPS)組(繼續(xù)分為刺激后2 h、7 d及再游泳后2 h，每組8只，合計24只)和強迫游泳組(forced swimming，F(xiàn)S)(8只)。

1.2動物模型制備實驗組采用單一連續(xù)刺激(single prolonged stress,SPS)方法刺激大鼠(該方法于2005年日本文部省召開的國際PTSD科學會議確定為關于大鼠PTSD模型)[2～5],具體步驟：禁錮2 h；強迫游水20 min；乙謎麻醉；無干擾常規(guī)喂養(yǎng)。在第7天時，再次給予大鼠強迫游泳，同時以正常大鼠和給予大鼠強迫游泳(forced swimming,FS)做為對照。

1.3ELISA檢測大鼠血漿中BDNF (大鼠腦源性神經生長因子ELISA試劑盒，美國R&D公司進口分裝),取各組大鼠(每組8只)，分別于刺激(SPS或FS)后2 h、12 h、1 d、7 d和再游泳后2 h時進行眼眶后靜脈叢采血，正常大鼠作對照，0.5 ml/次，壓迫眼球止血30 s。4 ℃、3000 r/min、離心10 min，取血漿，在相應反應板孔中加入20 μl標準品，20 μl標本，37 ℃、90 min；每板孔再加辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應孔，37 ℃溫育60 min，0.01 mol TBS洗滌3次；每孔加入100 μl顯色液，37 ℃避光孵育30 min，0.01 mol TBS洗滌5次；每孔加入50 μl終止液，15 min內在450 nm波長處測定各孔的OD值，繪制標準品線性回歸曲線，計算各樣本濃度，換算成質量濃度。

1.4免疫組織化學技術及圖像分析

1.4.1免疫組織化學技術分別取正常、SPS刺激后2 h、SPS刺激后7 d、SPS再游泳后2 h以及FS再游泳后2 h的大鼠(每組8只)，腹腔注射2%戊巴比妥麻醉，4%的多聚甲醛灌流固定，取腦，續(xù)固定3 h，浸于40%蔗糖-0.1 mol/LPBS中2～3 d至下沉。 取腦，冷凍切片，厚12 μm，3% H2O2-DH2O 10 min、PBS漂洗10 min×3，5%BSA 封閉20 min，滴加兔抗鼠BDNF抗體(1∶200，博士德生物有限公司)，0.01 mol/L PBS代替一抗作陰性對照，4 ℃過夜,羊抗兔IgG 37 ℃、30 min， 滴加SABC液37 ℃、20 min，以上各步間用0.01 mol/L PBS漂洗,DAB顯色,蘇木精復染，常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封片,根據(jù)大鼠腦立體定位圖(第5版)，光學顯微鏡(OLYMPUS,BX60,Japan)下觀察海馬CA1、齒狀回(DG)內BDNF表達，攝片。

1.4.2圖像分析免疫組織化學結果采用Image J 137圖像分析系統(tǒng)，測海馬CA1、齒狀回內每高倍鏡(10×40)視野內BDNF的光密度(OD)值，選7～9個神經元/切片，計算各組平均光密度值。

1.5熒光實時定量RT-PCR檢測分別取正常、SPS刺激后2 h、SPS刺激后7 d、SPS再游泳后2 h以及FS再游泳后2 h的大鼠(每組8只)，4 ℃ DEPC水洗去血跡，依據(jù)大鼠腦立體定位圖取出海馬新鮮組織，置于EP管中，-80 ℃保存。取出凍存各組樣品，置于冰上，室溫解凍，Trizol法提取各組大鼠海馬內RNA，提取總RNA，應用紫外分光光度計測其濃度和純度，260/280值為1.8～2.0，經逆轉錄后得到cDNA，-20 ℃ 凍存?zhèn)溆谩Ｒ院ｑR內BDNF的cDNA為模板進行熒光實時定量PCR檢測(ABI 7300型定量PCR儀)，以GAPDH作為內參。熒光定量試劑盒購自寶生物生物工程公司，具體實驗步驟參照試劑盒說明。采用Prime primer5.0軟件設計引物，委托寶生物生物工程公司合成(引物序列：BDNF上游引物：3’-CAGCGCGAATGTGTTAGTGGTTA-5’，下游引物：5’-CAGTGGACAGCCACTTTGTTTCA-3’；GADPH上游引物：3’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-5’，下游引物：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’)。采用2-ΔΔCT方法[6]對大鼠海馬內BDNF基因表達的數(shù)據(jù)進行相對實時熒光定量分析。

2　結　果

2.1ELISA檢測大鼠血清BDNF變化SPS刺激后2 h時，BDNF濃度明顯升高，12 h時，BDNF濃度較正常略高，24 h、7 d時接近于正常;再次強迫游泳后2 h時，BDNF再次增高，且較SPS刺激后2 h時的BDNF的濃度更高，同時也高于FS刺激大鼠再游泳后2 h時血漿內BDNF含量(見表1)。

2.2大鼠海馬內BDNF免疫組織化學表達高倍鏡下可見BDNF的陽性表達產物主要分布于海馬CA1區(qū)、齒狀回中神經元的胞體及突起中(見圖1A、1F)。經SPS-2 h后，海馬CA1區(qū)、齒狀回中神經元內BDNF的表達均比正常對照組增加(見圖1B、1G),SPS-7 d時表達減低，接近于正常(見圖1C、1H)；當SPS-7 d的大鼠再次強迫游泳后2 h時CA1區(qū)和齒狀回神經元內BDNF表達再次升高(見圖1D、1I)，且均明顯高于上述各組。另外,FS-再游泳后2 h時海馬CA1區(qū)、齒狀回神經元內BDNF表達較正常對照組增高，但低于SPS-再游泳-2 h(見圖1E、1J)(見表2)。

2.3熒光實時定量RT-PCR檢測海馬內BDNF mRNA的相對表達水平大鼠經SPS刺激后2 h時海馬內BDNF mRNA的相對表達水平較正常對照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表3)；SPS刺激后7 d時海馬內BDNF mRNA的相對表達水平與正常對照無明顯差異；SPS刺激后第7天再次給予大鼠強迫游泳后2 h時，海馬內BDNF mRNA的相對表達水平再次增高，高于其余各實驗組，也高于FS-再游泳2 h，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01，見表3)。

表1　各組大鼠血清BDNF的水平

與正常組比較*P<0.01,#P<0.05,^P<0.01；與SPS-2 h比較△P<0.01；與FS-再游泳-2 h比較P<0.01

表2　圖像分析海馬CA1和齒狀回內BDNF免疫反應光密度值±s)

海馬CA1區(qū)BDNF免疫反應：與正常aP<0.01，與SPS-2 h比較bP<0.01，與SPS-再游泳-2 h比較cP<0.01;海馬齒狀回BDNF免疫反應：與正常比較dP<0.01，與SPS-2 h比較eP<0.01，與SPS-再游泳-2 h比較fP<0.01

表3　大鼠海馬內BDNF mRNA的相對表達水平

3　討　論

PTSD明顯區(qū)別于一般的應激反應，它是對嚴重刺激產生的異乎尋常的精神障礙。大量文獻已證實海馬與PTSD發(fā)病有密切的關系[2，3]。海馬是合成BDNF的主要場所，而BDNF作為一種神經營養(yǎng)因子，可調控神經細胞的生存、生長、分化和凋亡，并對應激具有保護作用。研究證明，BDNF對突觸可塑性的影響是不可缺少的，其在動物的社會學習行為和記憶功能中發(fā)揮關鍵作用[7，8]。目前有很多關于PTSD研究的動物模型，其中SPS模型被認為能夠更恰當?shù)胤磻狿TSD發(fā)病的特征。大鼠受到SPS刺激后，HPA軸負反饋抑制增強、動物產生持續(xù)且過度的驚嚇反應以及焦慮行為增強等[9,10]。因此SPS模型的確定，為深入研究創(chuàng)傷應激的發(fā)病機制提供了行之有效的方法。我們采用SPS方法刺激大鼠，經過7 d的無干擾常規(guī)喂養(yǎng)后，再次給予大鼠強迫游泳作為再刺激，使大鼠對創(chuàng)傷應激情景再體現(xiàn)，產生PTSD模型，同時以單一強迫游泳刺激做對照，進一步證實SPS方法不同于一般的應激刺激。應用ELISA檢測大鼠血漿BDNF的變化，觀察大鼠海馬CA1區(qū)、齒狀回中神經元內BDNF表達的變化，以及檢測海馬內BNDF的基因水平的改變，為研究PTSD的發(fā)病提供實驗依據(jù)。

BDNF廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)中，如海馬、皮質等，此外，動物的外周血中也含有豐富的BDNF,考慮到BDNF能夠雙向穿過血腦屏障，循環(huán)中的BDNF可能產生于大腦神經元，血漿中的BDNF水平可以部分反映大腦BDNF水平[11,12]。目前，關于PTSD患者血中BDNF情況，有兩種不同的結果。Dell等測得PTSD患者血漿中BDNF減低[13]，而Hauck等證實創(chuàng)傷早期階段的PTSD患者的血清中BDNF增高[14]。兩種不同測量結果證實了PTSD發(fā)病機制的錯綜復雜，我們認為這兩種不同結果可能與以下原因有關：(1)PTSD發(fā)病受刺激強度、方式和持續(xù)時間等影響；(2)PTSD患者發(fā)病過程不同，發(fā)病后接受治療情況不同；(3)PTSD患者存在個體差異，發(fā)病后所表現(xiàn)出的臨床癥狀不同，并且此兩個實驗僅反映了小樣本病例。本實驗中，我們測得大鼠經SPS刺激后以及SPS-再刺激后(兩組大鼠均處于創(chuàng)傷急性期)，血漿中BDNF均增高，并且后者高于前者，證明了大鼠遭受SPS 刺激后應激和創(chuàng)傷同時存在，PTSD樣大鼠在創(chuàng)傷刺激后早期血漿中BDNF增高，使其加強了對恐懼記憶的形成和強化。另外本實驗結果也顯示再刺激大鼠血中BDNF也高于僅經過一次強迫游泳大鼠組血中BDNF含量，提示大鼠經過強烈刺激后再次給予其刺激后，使受刺激大鼠對創(chuàng)傷場景重現(xiàn)，故而反應更為強烈。但本實驗僅反映了大鼠經過急性刺激后早期階段的大鼠血漿中BDNF的變化，那么這種強烈的反應對PTSD樣大鼠后期的表現(xiàn)具有何種影響，有待進一步研究證實。同時我們也檢測到SPS刺激后大鼠海馬CA1區(qū)、齒狀回內BDNF蛋白表達以及海馬內BDNFmRNA得出相似結果，推測PTSD樣大鼠血漿中BDNF的含量變化與腦內神經元內BDNF產生變化具有相關性，但是海馬和血漿之間的BDNF如何相互影響及作用，需要進一步證實。

海馬是對應激反應進行調節(jié)的一個重要腦區(qū),在應激反應中對HPA軸起負反饋調節(jié)作用。另外，海馬幫助哺乳動物處理長期學習和記憶，信息是從齒狀回進入海馬后經CA3區(qū)到CA1區(qū)再輸出到腦下腳。PTSD患者HPA軸負反饋抑制增強，患者血中糖皮質激素(Glucocorticoid,GC)處于持續(xù)較低水平。我們在早期實驗中發(fā)現(xiàn)，大鼠經SPS刺激后，曾有一過性增高，然后處于較低水平，同時海馬內糖皮質激素受體(Glucocorticoid Receptor，GR)的表達呈現(xiàn)出一過性增高后處于較低水平，鹽皮質激素受體(Mineralocorticoid Receptor，MR)呈持續(xù)減低狀態(tài)[2,3]。MR或GR可誘導調節(jié)BDNF的表達，進而影響了BDNF/cAMP反應元件結合蛋白(CREB)對記憶的調節(jié)作用[15]。糖皮質激素受體激活導致海馬BDNF的表達減少，影響到動物對事物的認知和突觸可塑性的赤字[16]?；谇捌诘膶嶒?，本實驗中我們檢測到大鼠經SPS刺激后BDNF水平高于正常，尤其當大鼠再次經歷強迫游泳后,大鼠海馬CA1區(qū)及齒狀回內BDNF的表達進一步增高,提示了PTSD樣大鼠在對創(chuàng)傷記憶的形成鞏固以及記憶的再攝取過程中，可能存在著酪氨酸激酶受B(Tyrosine kinase receptors，TrkB)和糖或鹽皮質激素受體的相互作用，從而導致PTSD樣大鼠海馬內BDNF的增加，BDNF進而影響長時程增強(long-term-ptentiati，LTP)，影響到PTSD樣大鼠對創(chuàng)傷刺激的記憶形成，當刺激再體驗時產生強烈的驚嚇和恐懼，但其中的具體機制有待于進一步研究。

[1]Lu B,Nagappan G,Lu Y.BDNF and synaptic plasticity,cognitive function,and dysfunction[M].Handb Exp Pharmacology,2014,220:223-250.

[2]Du Z,Han F,Shi YX.Expressions of hippocampal mineralocorticoid receptor (MR) and glucocorticoid receptor (GR) in the single-prolonged stress-rats[J].Acta Histochem Cytochem,2008,41(4):89-95.

[3]杜喆,張偉國,曹桂范,等.鹽皮質激素受體和糖皮質激素受體在創(chuàng)傷后應激障礙大鼠海馬區(qū)的共存表達[J].實用醫(yī)學雜志,2013,29(19):3143-3145.

[4]張偉國，曹桂范，杜惠蓮,等.多巴胺D2受體在創(chuàng)傷后應激障礙樣大鼠伏隔核內的表達[J].解剖學雜志,2014,37(2)：185-187.

[5]張玉靜,周焱,許艷,等.豐富環(huán)境對創(chuàng)傷后應激障礙樣大鼠自發(fā)活動和海馬c-Fos、5-HT表達的影響[J].中華行為醫(yī)學與腦科學雜志,2015,24(1) ：8-11.

[6]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2ΔΔCt Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[7]Serra MM.Are the changes in the peripheral brain-derived neurotrophic factor levels due to platelet activation[J].World J Psychiatry,2016,6(1):84-101.

[8]Lamb YN,Mckay NS,Thompson CS,et al.Brain-derived neurotrophic factor Val66Met polymorphism,human memory,and synaptic neuroplasticity[J].Wiley Interdiscip Rev Cogn Sci,2015,6(2):97-108.

[9]Yamamoto S,Morinobu S,Takei S,et al.Single prolonged stress:toward an animal model of posttraumatic stress disorder [J].Depression and Anxiety,2009,26(12):1110-1117.

[10]Patki G,Li L,Allam F,et al.Moderate treadmill exercise rescues anxiety and depression-like behavior as well as memory impairment in a rat model of posttraumatic stress disorder[J].Physiol Behav，2014,10(130):47-53.

[11]Masi G,Brovedani P.The hippocampus,neurotrophic factors and depression:possible implications for the pharmacotherapy of depression[J].CNS Drugs,2011,25(11):913-931.

[12]Kim YK,Lee HP,Won SD,et al.Low plasma BDNF is associated with suicidal behavior in major depression[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2007,31(1):78-85.

[13]Dell'osso L,Carmassi C,Del Debbio A,et al.Brain-derived neurotrophic factor plasma levels in patients suffering from post-traumatic stress disorder[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2009,33(5):899-902.

[14]Hauck S,Kapczinski F,Roesler R,et al.Serum brain-derived neurotrophic factor in patients with trauma psychopathology[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2010,34(3):459-462.

[15]Finsterwald C,Alberini CM.Stress and glucocorticoid receptor-dependent mechanisms in long-term memory:From adaptive responses to psychopathologies[J].Neurobiol Learn Mem,2014,112:17-29.

[16]Wosiski KM,Erion JR,Gomez SE,et al.Glucocorticoid receptor activation impairs hippocampal plasticity by suppressing BDNF expression in obese mice[J].Psychoneuroendocrinology,2014,42:165-177.

海馬CA1區(qū)：A：正常大鼠；B：SPS-2 h；C：SPS-7 d；D：SPS-再游泳-2 h；E：FS-再游泳-2 h;海馬齒狀回：F:正常大鼠；G：SPS-2 h；H：SPS-7 d；I：SPS-再游泳-2 h；J：FS-再游泳-2 h

圖1各組大鼠海馬CA1區(qū)、齒狀回內BDNF的免疫組織化學結果(×400)

The changes in the expression of BDNF in hippocampal neurons of PTSD-rats

ZHANGWeiguo,DUZhe,DUHuilian.

(OrthopedicsDepartmentofCenterHospitalAffiliatedtoShenyangMedicalCollege,Shenyang110024,China)

ObjectiveTo study the changes of brain-derived growth factor (BDNF) in plasma、hippocampal CA1and dentate gyrus of PTSD-rats.MethodsUsed the single prolonged stress (SPS) method to stimulate the rat in order to set up PTSD model of rat,and the normal rats were stimulated by forced swimming (FS) as control group.Detected the plasma BDNF of rats at different time points (normal,2 h、 12 h、1 d、7 d after stimulating,and 2 h after re-forced swimming 7 days later) by ELISA;In addition,the brain of rats were got in 2 h、7 d after SPS,2 h after SPS+re-forced swimming,2 h after FS+re-forced swimming and the rat brain of control group.The expression of BDNF in hippocampal neurons in rats was observed with immunohistochemical technique;Real time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR) was used to detect the relative expression of BDNF-mRNA in hippocampus of rats.ResultsRats’plasma BDNF in SPS-2 h was significantly higher than normal rats.It was back in SPS-7 d,and it had no obvious difference with the normal rats.The concentration of BDNF in SPS+re-forced swimming-2 h was significantly higher than others experimental periods and FS+re-forced swimming-2 h.The expression of BDNF in rats’hippocampal CA1,dentate gyrus and the relative expression of BDNF-mRNA in the hippocampus also appeared the similar change like it in plasma.ConclusionThe changes of BDNF concentration in PTSD-rats’plasma are associated with the expression of BDNF in the hippocampus.The changes of BDNF result the rats to produce fear memory after they have been suffered a traumatic stimuli,and the memory can be consolidated and re-extracted easily.

Post-traumatic stress disorder;Single prolonged stress;Hippocampus;Brain-derived growth factor

1003-2754(2016)08-0715-04

2016-04-15；

2016-08-03

遼寧省科技廳科學技術計劃(No.2011225020)

(1.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院骨一科，遼寧 沈陽110024；2.沈陽醫(yī)學院組織胚胎學教研室，遼寧 沈陽110034)

杜喆，E-mail:775112283@qq.com

R322.81

A