湖北地區(qū)炎癥因子基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系

艾志兵，　杜　玲，　李龍倜，　羅國君

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湖北地區(qū)炎癥因子基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系

艾志兵1，杜玲2，李龍倜1，羅國君2

目的探討相關(guān)炎癥因子基因多態(tài)性與中國湖北地區(qū)漢族人群動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)的關(guān)系。方法在湖北漢族人群中篩選260例腦梗死患者為腦梗死組;200例健康體檢者為對(duì)照組，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFIP)方法測(cè)定炎癥因子基因多態(tài)性。結(jié)果腦梗死組與對(duì)照組比較，BRAP基因外顯子90A/G分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=11.2,P<0.05)，IL-15基因的C/A基因型分布不存在組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=3.220，P>0.05)，Logistic回歸分析提示，BRAP基因外顯子90GG等位基因攜帶者發(fā)生ACI的風(fēng)險(xiǎn)是CC等位基因的1.8倍(OR=1.476，95%CI1.142～2.268)，且該關(guān)聯(lián)獨(dú)立于性別、年齡、吸煙、高血壓等風(fēng)險(xiǎn)因素。沒有證據(jù)表明IL-15基因13687C/A位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死易感性相關(guān)。結(jié)論BRAP 90A/G外顯子基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病有關(guān)，可能是中國湖北地區(qū)漢族人群動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病的遺傳易感基因。

動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死；腦梗死基因多態(tài)性；白細(xì)胞介素-15；乳腺癌易感基因相關(guān)蛋白基因

動(dòng)脈粥樣硬化是引發(fā)缺血性腦血管病的重要病理基礎(chǔ)。隨著對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展研究的深入，新的觀點(diǎn)認(rèn)為，炎癥因子基因多態(tài)性可能在動(dòng)脈粥樣硬化過程中具有重要作用[1]。IL-15是一種在腦梗死早期即表達(dá)增高的前炎性因子，有研究認(rèn)為IL-15含量的測(cè)定可作為早期診斷急性腦梗死腦損害程度的指標(biāo)[2]。乳腺癌易感基因相關(guān)蛋白基因(BRAP)的單核苷酸多態(tài)性較為常見，而位于其外顯子90的基因多態(tài)性已被證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)[3,4]。

本研究擬通過PCR-RFLP技術(shù)，檢測(cè)湖北地區(qū)漢族人BRAP基因外顯子90A/G和IL-15基因13687C/A的多態(tài)性，旨在探討其與ACI的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1一般資料選擇2010年5月-2012年11月在中國湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院就診的湖北漢族ACI住院患者，共260例，其中男146例，女114例，平均年齡(52.3±6.7)歲。所有患者均符合中國腦血管病防治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)頭部CT和/或MRI確診，不包括心源性栓塞、腫瘤、血管畸形或動(dòng)脈瘤等引起的腦梗死、血液病、無癥狀性腦梗死；排除腦出血等。對(duì)照組則選取200例湖北漢族健康體檢者，均經(jīng)過臨床檢查或影像學(xué)檢查排除腦血管病，無腦血管病家族史，其中男108例，女92例，平均(53.4±7.5)歲。腦梗死組和對(duì)照組在年齡、體重指數(shù)、性別差異等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有研究對(duì)象均經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并征得所有入選對(duì)象的知情同意。

1.2研究方法

1.2.1基因組DNA的提取抽取外周靜脈血2 ml,置入EDTA抗凝管，采用Qiagen公司DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2PCR擴(kuò)增參考相關(guān)文獻(xiàn)，利用NCBI設(shè)計(jì)引物，BRAP基因外顯子90A/G的引物序列如下：上游引物為5’-TCATCTCCCCCTTCCTCTGA-3’，下游引物為5’-ATCTGCCCAAGCTCCCTCTA-3’；IL-15基因13687C/A的引物如下：上游為5’-AGCTAAATGTGTGGGTGGGC-3’，下游為5’-CCAGAAGAAGGGGGAGATGA-3’。PCR引物均由上海生工合成。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)周期后再72 ℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存。

1.2.3限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析取10 μl PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.6%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，加MbiI限制性內(nèi)切酶配置Pstl 0.6 μl的反應(yīng)體系，37 ℃酶切過夜后，1.6%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析處理系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并確定基因型。所有樣本均接受重復(fù)檢驗(yàn)，以驗(yàn)證檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，不同基因型導(dǎo)致食管癌的風(fēng)險(xiǎn)值采用單因素和多因素Logistic回歸分析計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1一般資料腦梗死組和對(duì)照組患者在肌酐(cr)、體重指數(shù) (BMI)、尿素氮(BUN)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等各因子水平方面無統(tǒng)汁學(xué)差異(P>0.05)；腦梗死組的甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBS)及高密度脂蛋白(HDL-C)等指標(biāo)高于對(duì)照組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腦梗死組低密度脂蛋白(L-DLC)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、總膽固醇(TC)、高血壓病史、冠心病史、糖尿病史高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)則低于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2基因多態(tài)性分析BRAP基因和IL-15基因PCR產(chǎn)物均為特異條帶，無雜帶。BRAP基因PCR產(chǎn)物經(jīng)MbiI限制性內(nèi)切酶酶切后，呈現(xiàn)3種基因型：CC純合子型(含163 bp 1條片段);CG雜合子型(含163 bp，101 bp，62 bp 3條片段);GG純合子型(含101 bp，62 bp 2條片段)。IL-15基因PCR產(chǎn)物經(jīng)SphI限制性內(nèi)切酶切后，呈現(xiàn)3種基因型：AA純合子型(含284 bp 1條片段);CA雜合子犁(含284 bp，166 bp，118 bp 3條片段);CC純合子型(含166 bp，118 bp 2條片段)。

2.3基因多態(tài)性分布分析ACI組及對(duì)照組基因型和等位基因頻率分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.05)。BRAP基因外顯子90A/G基因型在ACI組及對(duì)照組人群中的分布差異有顯著性(χ2=11.2，P<0.05)，等位基因頻率在兩組人群中的分布也存在明顯差異(χ2=8.52，P<0.05)。經(jīng)等位基因頻率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn)，GG等位基因攜帶者發(fā)生ACI的風(fēng)險(xiǎn)是CC等位基因的1.8倍(OR=1.476，95%CI1.142～2.268)。IL-15 13687C/A等位基因及基因型在病例組和對(duì)照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1　炎癥因子基因各多態(tài)性位點(diǎn)等位基因和基因型頻率的分布

與對(duì)照組人群相比BRAP基因外顯子90A/G基因型在ACI組分布差異有顯著性(χ2=11.2，P<0.05);與對(duì)照組人群IL-15 13687C/A等位基因及基因型與ACI組比較的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05

3　討　論

隨著社會(huì)發(fā)展腦梗死的發(fā)病率明顯升高，已成為高發(fā)病之一，其基本病因是動(dòng)脈粥樣硬化。動(dòng)脈粥樣硬化的早期病變表現(xiàn)為內(nèi)膜脂質(zhì)、復(fù)合碳水化合物和血液成分的灶狀沉積、平滑肌細(xì)胞增生和膠原纖維增多導(dǎo)致脂紋形成等[5]。不同類型的腦梗死患者動(dòng)脈粥樣硬化有不同的特點(diǎn)，國外研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化始于血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，粥樣硬化斑塊的形成是管壁對(duì)于各種損傷因子刺激作出的“炎性-增殖”應(yīng)答，炎性因子參與這一過程的始終[6]。但國內(nèi)有關(guān)這一方面的研究還比較少見。在該項(xiàng)研究中，我們參照既往文獻(xiàn)，對(duì)可能的動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死造成影響的炎癥因子的多態(tài)性進(jìn)行了探索。

IL-15是一種細(xì)胞因子，其生物學(xué)活性主要有促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞的激活、刺激Th1細(xì)胞克隆的增殖與活化等[7]，有文獻(xiàn)表明，IL-15與血管內(nèi)皮受損修復(fù)密切相關(guān)[6]。已經(jīng)證明，IL-15基因的13687C/A多態(tài)性與高血壓、冠心病等多種疾病相關(guān)[5]。BRAP最初被證實(shí)為一種細(xì)胞質(zhì)蛋白,其作用是識(shí)別乳腺癌易感基因的信號(hào)肽。隨著進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其可能是半乳凝素2的結(jié)合對(duì)象[5]?？赏ㄟ^調(diào)整Ras激酶抑制劑(KSR)的結(jié)構(gòu)活性來調(diào)整促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的信號(hào)，而激酶信號(hào)途徑具有調(diào)節(jié)細(xì)胞存活生長、分化、增殖及促進(jìn)分泌多種炎癥因子的作用。2009年，Ozaki等人[6]進(jìn)行的一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)性研究發(fā)現(xiàn)，BRAP270 T/C與心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而Hinohara等[8]則進(jìn)一步證實(shí)該基因多態(tài)性與日本和韓國人群動(dòng)脈粥樣硬化易感性相關(guān)，從而使BRAP基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化腦梗死風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)受到了廣泛關(guān)注。

不同的種族和地區(qū)之間，各炎癥因子基因多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布情況存在較大差異[6]，這是我們開展該項(xiàng)研究的主要原因。我們的研究發(fā)現(xiàn)中國湖北地區(qū)漢族人群ACI組與對(duì)照組患者相比，BRAP 90A/G等位基因頻率及基因型分布均有顯著性組間差異，BRAP基因外顯子90A/G基因型在ACI組及對(duì)照組人群中的分布差異有顯著性(χ2=11.1，P<0.05)，等位基因頻率在兩組人群中的分布也存在明顯差異(χ2=8.57，P<0.05)，經(jīng)等位基因頻率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn)，G等位基因攜帶者發(fā)生ACI的風(fēng)險(xiǎn)是C等位基因的1.8倍(OR=1.472，95%CI1.144～2.267)，提示G等位基因可能是ACI的遺傳易感基因。IL-15 13687C/A等位基因頻率及基因型分布在病例組和對(duì)照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A等位基因攜帶者發(fā)生ACI的風(fēng)險(xiǎn)與C等位基因攜帶者也無顯著性差異(P>0.05)，提示A等位基因不是ACI的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。

BRAP促發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制尚未完全明確。我們的研究結(jié)果顯示BRAP 90A/G多態(tài)性位點(diǎn)處于強(qiáng)烈的連鎖不平衡狀態(tài)中，這與Ozaki等人[9]的研究結(jié)果一致。這一SNPs位點(diǎn)并未導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中氨基酸序列的變化，然而，既往研究顯示，BRAP 90A/G導(dǎo)致了BRAP轉(zhuǎn)錄水平的差異，而BRAP表達(dá)水平的變化可能影響到動(dòng)脈粥樣硬化腦梗死相關(guān)信號(hào)通路[10,11]。

我們的研究初步顯示，BRAP 90A/G基因多態(tài)性是中國湖北地區(qū)漢族人群的動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死易感因素，而IL-15 13687C/A基因多態(tài)性則與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死易感性無相關(guān)。動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而BRAP 90A/G基因多態(tài)性等遺傳學(xué)標(biāo)記物檢測(cè)的鑒別可能為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死人群的篩查、疾病的預(yù)防和治療提供新的臨床線索。

[1]Dexing MA,Chunli M,Long P,et al.Vaccination of chickens with DNA vaccine encoding Eimeriaacervulina 3-1E and chicken IL-15 offers protection against homologous challenge[J].Experimental Parasitology,2011,90:72-77.

[2]van der Meer JJ,de Boer OJ,Teeling P,et al.Smooth muscle homeostasisin human atherosclerotic plaques through interleukin 15signallingInt[J].J Clin Exp Pathol,2011,4(3):287-294．

[3]金可可,徐峰,徐力辛,等.炎癥因子基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的相關(guān)性[J].中華遺傳學(xué)雜志,2012,29(2):200-205.

[4]劉淼,紀(jì)求尚,張運(yùn),等.不同炎癥標(biāo)志物對(duì)冠狀動(dòng)脈病變的預(yù)測(cè)價(jià)值[J].中國動(dòng)脈硬化雜志,2010,18(9):725-728．

[5]Xiaoyi Tang.Adoptive cellular immunotherapy in metastatic renal cell carcinoma:A systematic review and meta-analysis[J].Plos One,2009,3:79-82.

[6]Ozakik K,Sato H，Inoue K，et al.SNPs in BRAP associated wim risk of myocardial iIlfarction in Asian populations[J].Nat Genet,2009,41(3):329-333．

[7]Wolchok JD,Hoos A,O’Day S,et al.Guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors:immune-related response criteria[J].Clin Cancer Res,2009,15:7412-7420.

[8]Lertmemongkolchai G,Cai G,Hunter CA,et al.Bystander activation of CD8+T cells contributes to the rapid production of IFN-gamma in response to bacterial pathogens[J].J.Immunol,2001,166:1097-1105.

[9]Ma A,Koka R,Burkett P.Diverse functions of IL-2,IL-15,and IL-7 in lymphoid homeostasis[J].Annu Rev Immunol,2006,24:657-679.

[10]Takeuchi F,Yokota M,Yamamoto K,et al.Genome-wide association study of coronary artery disease in the Japanese[J].Eur J Hum Genet,2012,20:333-340.

[11]Nina W,van der Hoeven,Maurits R,et al.The emerging role of galectins in cardiovascular disease[J].Vascular Pharmacology,2016,10:1016.

The observation of the relationship between polymorphisms of inflammatory factors and susceptibility of atherosclerotic cerebral infarctionin a Han population in Hubei province

AIZhibing,DULing,LILongti,etal.

(DepartmentofNeurology，TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between polymorphisms of inflammatory factors and susceptibility of atherosclerotic cerebral infarction (ACI) in a Han population in Hubei province.Methods260 patients were assigned to the ACI group,the other 200 normal patients were assigned to the control group.Then the distributions of allele and genotype frequencies of inflammatory factors were detected by polymerase chain reactionk-restriction fragment length polymorphism.ResultsWe found significant difference in genotype of 90A/G polymorphism of BRAP gene (χ2=11.2,P<0.05) and no difference in genotype of 13687C/A polymorphism of IL-15 gene (χ2=3.220,P>0.05) between ACI patients and controls;Compared with BRAP gene exon 90 CC carrier,90 GG genotypes had a significantly increased ACI risk by Logistic regression analysis(OR=1.476，95%CI1.142～2.268),this association was still significant after adjustment for the sex,age,smoke,hypertension.No evidence of association was found for IL-15 gene 13687C/A polymorphisms.ConclusionThe 90 A/G polymorphism in the BRAP gene may be associated with increased risk one of the predisposing genes of ACI and among Hubei province Chinese Han population.

ACI;Single nucleotide polymorphism;IL-15；BRAP

1003-2754(2016)08-0693-03

2016-04-12；

2016-05-29

(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000;2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院金山分院神經(jīng)科,上海 201500)

羅國君，E-mail：junlgsy@163.com

R743.1

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