納豆固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

黃　婷，劉良忠，曹宇翔，賈維寶（武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

納豆固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

黃婷，劉良忠*，曹宇翔，賈維寶
（武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

為了得到高品質(zhì)的納豆，以優(yōu)質(zhì)黃豆為原料，采用納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率為評價指標，研究初始含水量、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率的影響。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對納豆固體發(fā)酵工藝進行正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計的優(yōu)化，得到納豆固體發(fā)酵工藝的最佳參數(shù)為初始含水量為51%，接種量為0.15%，發(fā)酵溫度為43℃，發(fā)酵時間為24 h，該條件下納豆激酶含量為0.076mg/m L，黏液產(chǎn)率為17.60%。

納豆；納豆激酶含量；黏液產(chǎn)率

納豆是以黃豆為主要原料，蒸煮后接入納豆菌（枯草桿菌）發(fā)酵而成的具有獨特風(fēng)味的一種食品。具有抗血栓降血壓抗腫瘤等多種生理功能［1］，經(jīng)常食用可預(yù)防或治療多種亞健康體質(zhì)長期積累引起的疾?。?］。SUM IH等［3］在1987年從納豆中提取出一種具有溶栓功能的物質(zhì)并將其命名為納豆激酶（nattokinase，NK），納豆激酶屬于納豆枯草芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶，體內(nèi)體外試驗都已證明具有高效的溶栓活性［4-5］，其不僅可以直接溶解交聯(lián)狀的血栓，而且可以催化血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成有活性的血纖維蛋白原溶酶，增加體內(nèi)血栓溶解因子的合成，增強體內(nèi)血栓的溶解活性［6］。納豆激酶是一種安全的理想的預(yù)防和治療栓塞的生化藥物［7］。因此食用納豆制品、納豆激酶產(chǎn)品可以達到預(yù)防和治療血栓類疾病的目的。

1　材料與方法

1.1料與試劑

黃豆：市售；納豆菌：試驗室自制；硫酸銨：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司。

1.2器與設(shè)備

BXM-30R高壓滅菌鍋、GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；AR214O Adventure電子分析天平：美國Ohaus公司；GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗設(shè)備有限公司；TGL205冷凍離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；PHS-3C pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；7200型分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3法

1.3.1備工藝流程

黃豆→浸泡→蒸煮→接種→發(fā)酵→后熟

稱取適量的黃豆清洗干凈，加入黃豆質(zhì)量4倍的水，在40℃水浴鍋中保溫2.5 h，加入3%豆質(zhì)量的食鹽，121℃高壓滅菌鍋蒸煮20m in，冷卻后加入0.1%納豆菌，42℃發(fā)酵22 h，轉(zhuǎn)入4℃冰箱后熟18 h。

1.3.2酶液制備

將發(fā)酵完成的納豆，按1∶4（g∶m L）的比例用0.9%無菌生理鹽水于搖床分兩次浸提1 h，合并提取液，10 000 r/m in冷凍離心10min，上清液即為納豆激酶粗酶液［8］。

1.3.3析法分離純化納豆激酶

將研細的（NH4）2SO4按照20%的飽和度加入到上述上清液中，4℃保存過夜，10 000 r/min離心30min，棄去沉淀（沉淀為初步分離的雜蛋白），取上清液加入硫酸銨至60%飽和度，4℃保存過夜后10 000 r/min離心30min，棄去上清液，沉淀用10mmol/L的磷酸緩沖液溶解［9］。

1.3.4因素試驗

初始含水量的確定：在蒸煮時間20min，接種量0.1%，發(fā)酵溫度42℃，發(fā)酵時間22 h的條件下，選擇大豆初始含水量分別為40%、45%、50%、55%、60%，以納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率為評價指標，確定最佳初始含水量。

接種量的確定：在初始含水量50%，蒸煮時間20min，發(fā)酵溫度42℃，發(fā)酵時間22 h的條件下，選擇接種量分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%，以納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率為評價指標，確定最佳接種量。

發(fā)酵溫度的確定：在初始含水量50%，蒸煮時間20min，接種量0.1%，發(fā)酵時間22 h的條件下，選擇發(fā)酵溫度分別為34℃、38℃、42℃、46℃、50℃，以納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率為評價指標，確定最佳發(fā)酵溫度。

發(fā)酵時間的確定：在定初始含水量50%，蒸煮時間20min，接種量0.1%，發(fā)酵溫度42℃的條件下，選擇發(fā)酵時間分別為18 h、20 h、22 h、24 h、26 h，以納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率為評價指標，確定最佳發(fā)酵時間。

1.3.5因子（1/2實施）二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計優(yōu)化納豆固態(tài)發(fā)酵工藝

在單因素的基礎(chǔ)上，以納豆激酶含量、黏液產(chǎn)率為指標，采用四因子二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計，取3次平行測量的平均值，利用Excel軟件進行回歸分析。試驗的因素水平編碼見表1。

表1　納豆固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal rotation combination design for natto solid-sta te ferm entation technology optim ization

1.3.6測方法

納豆黏液產(chǎn)率：準確稱取5.000 0 g納豆2份，一份直接在105℃烘箱中烘至質(zhì)量恒定，另一份用溫水輕輕地洗掉納豆表面的黏液，再移入烘箱中烘至質(zhì)量恒定［10］。

式中：W1為直接烘干至質(zhì)量恒定的納豆質(zhì)量，g；W2為水洗后烘干至質(zhì)量恒定的納豆質(zhì)量，g。

納豆激酶含量：取1m L樣品液，加入5m L考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻后放置5min，在紫外-可見分光光度計波長595 nm處測定吸光度值。根據(jù)牛血清蛋白標準曲線回歸方程A=0.009 1C+0.010 9（相關(guān)系數(shù)R2=0.992 2），計算樣品液中納豆激酶含量［11］。

2　結(jié)果與分析

2.1始含水量對NK含量及黏液產(chǎn)率的影響

圖1　大豆初始含水量對NK含量及黏液產(chǎn)率的影響Fig.1 Effecto f initialwater contentof soybean on NK content and mucus yield

由圖1可知，大豆初始含水量為40%～50%時，隨著初始含水量的增加，納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率不斷升高。隨后隨著含水量增加，納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率不斷下降。可能原因是納豆發(fā)酵過程中，大豆中的含水量主要影響營養(yǎng)基質(zhì)的溶解是否完全和傳遞是否均勻，從而影響產(chǎn)酶量。當(dāng)大豆初始含水量為40%～50%時含水量少，則隨著發(fā)酵的進行，物料水分的蒸發(fā)，菌體不能很好地生長和積累產(chǎn)物［12］；初始含水量為50%～60%時，由于大豆吸水膨脹，使菌體得不到良好的氧氣供應(yīng)，發(fā)酵結(jié)束后觀察到的培養(yǎng)皿底部有乳白色的液體，將菌絲浸泡，致使菌絲不能生長，進而影響到納豆激酶的產(chǎn)量［13］。大豆初始含水量為50%時納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率達到最大值，此時納豆激酶含量為0.075mg/m L，黏液產(chǎn)率為14.45%。因此，選擇大豆初始含水量為50%。

2.2種量對NK含量及黏液產(chǎn)率的影響

圖2　接種量對NK含量及黏液產(chǎn)率的影響Fig.2 Effectof inoculum on NK contentand mucus yield

由圖2可知，納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率在接種量0.10%時達到最大值，此時納豆激酶含量為0.075mg/m L，黏液產(chǎn)率為9.11%，此后隨著接種量的增加，納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率逐漸降低。接種量過大，微生物可能會因為生長過于旺盛而營養(yǎng)物質(zhì)過快消耗，并且氧氣量不足，從而不利于菌體生長以及酶的合成；接種量小，不能使菌液均勻的分布到大豆表面，難以實現(xiàn)發(fā)酵完全，不利于目標產(chǎn)物的積累［14］。因此，選擇0.10%為最佳接種量。

2.3酵溫度對NK含量及黏液產(chǎn)率的影響

圖3　發(fā)酵溫度對NK含量及黏液產(chǎn)率的影響Fig.3 Effectof fermentation tem perature on NK contentand mucus yield

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的增大納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率先增大后減小，在發(fā)酵溫度為42℃時達到最大值，納豆激酶含量為0.062mg/m L，黏液產(chǎn)率為15.78%。納豆呈黃褐色，黏液呈乳白色，且納豆黏液黏稠度較好，拉絲不易斷裂［15］。發(fā)酵溫度在34～42℃時，隨著溫度的升高，反應(yīng)速度增大，細胞生長旺盛；當(dāng)溫度＞42℃時，由于溫度過高使得細胞內(nèi)部的酶促反應(yīng)所需的酶的酶活降低，并且納豆發(fā)酵時中心的溫度會更高，發(fā)酵產(chǎn)熱的速率過快使得熱量無法散出，從而使得環(huán)境不利于菌體的生長，使其生長速率過快或過慢，發(fā)酵不均勻或者副產(chǎn)物增多，進一步影響納豆激酶的酶活，而且高溫會使納豆激酶部分失活。因此，選擇42℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.4酵時間對NK含量及黏液產(chǎn)率的影響

圖4　發(fā)酵時間對NK含量及黏液產(chǎn)率的影響Fig.4 Effectof fermentation time on NK contentand mucus yield

由圖4可知，發(fā)酵時間為18～22 h時，納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加，到22 h時達到最大值，此時納豆激酶含量為0.072mg/m L，黏液產(chǎn)率為10.97%；超過22 h之后，納豆激酶含量和黏液產(chǎn)率逐漸減少，可能是由于發(fā)酵時間過長而導(dǎo)致有害產(chǎn)物的積累，納豆激酶產(chǎn)量下降［7］。因此，選擇22 h為最佳發(fā)酵時間。

2.5豆固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計

試驗以納豆激酶含量為指標，利用Excel對其進行回歸分析及方差分析，結(jié)果見表2。

表2　納豆固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal rotation combination design for natto solid-state ferm entation technology optim ization

表3　以NK含量為評價指標的方差分析Table 3 Analysis of variance w ith NK content as evalua tion index

以納豆激酶含量為響應(yīng)值，進行回歸擬合，由表4得到回歸方程為：Y=-1.643 3+0.027 8X1+0.035 2X2+0.045 7X3+0.001 1X4-0.000 3X12-0.000 5X32。由表3知P＜0.01，表明回歸方程非常顯著有意義。由表4知因素的主次順序是：X3＞X1＞X4＞X2，即發(fā)酵溫度＞初始含水量＞發(fā)酵時間＞接種量。

表4　以NK含量為評價指標的回歸分析Table 4 Analysis of regression with NK content as eva luation index

表5　以黏液產(chǎn)率為評價指標的方差分析Table 5 Analysis of variance w ithmucus yield as evaluation index

表6　以黏液產(chǎn)率為評價指標的回歸分析Table 6 Analysis of regression w ith m ucus yield as evaluation index

以黏液產(chǎn)率為響應(yīng)值，進行回歸擬合，由表6得到回歸方程為：Y=-351.593+6.729 9X1+12.554 9X2+8.862 1X3+ 0.403 6X4-0.028 9X1X3-0.054 3X12-0.087 7X32。由表5知P＜0.01，表明回歸方程非常顯著有意義。由表5知因素的主次順序是：X3＞X1＞X4＞X2，即發(fā)酵溫度＞初始含水量＞發(fā)酵時間＞接種量。

在兩個回歸方程的基礎(chǔ)上分別進行規(guī)劃求解，保證一定黏液產(chǎn)率的基礎(chǔ)上，盡量增加納豆激酶產(chǎn)量，經(jīng)過規(guī)劃求解，得到最佳納豆激酶發(fā)酵工藝為初始含水量為51.42%，接種量為0.15%，發(fā)酵溫度為42.61℃，發(fā)酵時間為24h，納豆激酶含量為0.078mg/m L，黏液產(chǎn)率為17.66%?？紤]實際操作條件，修改納豆激酶發(fā)酵工藝為初始含水量為51%，接種量為0.15%，發(fā)酵溫度為43℃，發(fā)酵時間為24 h，在此條件下，進行驗證試驗，納豆激酶含量達到了0.076mg/m L，黏液產(chǎn)率為17.60%，和預(yù)測值基本相吻合，說明該模型具有較好的預(yù)測性。

3　結(jié)論

通過試驗得到納豆固體發(fā)酵工藝的最佳參數(shù)為初始含水量為51%，接種量為0.15%，發(fā)酵溫度為43℃，發(fā)酵時間為24h，該條件下納豆激酶含量為0.076mg/m L，黏液產(chǎn)率為17.60%。

［1］MUROOKA Y，YAMSHITA M.Traditional healthful fermented productsof Japan［J］.J Ind M icrobiol Biotechnol，2008（35）:795-796.

［2］代增英，馮建嶺，李迎秋，等.納豆及納豆激酶的研究進展［J］.山東食品發(fā)酵，2013（1）：46-50.

［3］SUM IH，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese Natto:A typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］.Experientia，1987，43（10）:1110-1111.

［4］FUJITA M，HONG K，ITO Y，etal.Transportof nattokinase across the rat intestinal tract［J］.Biol Pharm Bull，1995，18（9）:1194-1196.

［5］SUM IH，HAMADA H，NAKANISHIK，etal.Enhancementof the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase［J］.Acta Haematol，1990，84（3）:139-143.

［6］FUJITA M，NOMURA K，HONG K，etal.Purification and characterization of astrong fibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan［J］.Biochem Biophys Res Comm，1993，197（3）:1340-1347.

［7］李永飛，王正剛，盧澤民，等.固體發(fā)酵納豆激酶培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.糧食加工，2008，33（1）：58-60.

［8］張莉.納豆加工工藝的研究和產(chǎn)品開發(fā)［D］.濟南：山東輕工業(yè)學(xué)院碩士論文，2012.

［9］高大海.納豆激酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究［D］.杭州：浙江大學(xué)碩士論文，2005.

［10］高澤鑫，王常蘇，黃勛，等.雙菌混合發(fā)酵生產(chǎn)豆豉的條件優(yōu)化［J］.中國釀造，2014，33（9）：49-52.

［11］Bradford M M.A rapid and sensitivemethod for the quantitation ofmicrogramquantitiesof protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72（1）:248-254.

［12］郭海勇，王波，喬繼偉，等.納豆激酶固體發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.吉林師范大學(xué)學(xué)報，2008，5（2）：66-68.

［13］王剛.納豆激酶的固體發(fā)酵、分離純化及應(yīng)用研究［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2005.

［14］蘇雪燕.納豆激酶分離、純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究［D］.濟寧：曲阜師范大學(xué)碩士論文，2013.

［15］祖國仁，孔繁東，劉陽，等.納豆菌固體發(fā)酵條件及產(chǎn)品成分分析［J］.食品工業(yè)科技，2006，27（12）：122-124.

Optimization of solid-state fermentation technology ofnatto

HUANG Ting，LIU Liangzhong*，CAO Yuxian，JIAWeibao
（College ofFood Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

In order to obtain high quality natto，using the superior quality soybean as raw material and natto kinase contentand mucus yield asevaluation index，the effects of initialwater content，inoculum，fermentation tem perature，time on natto kinase content and mucus yield were researched. According to the resultsof single factor experiments，natto solid-state fermentation technologywasoptimized by orthogonal rotation combination design.The optimum parameters of natto solid-state fermentation technology were initialwater content 51%，inoculum 0.15%，fermentation temperature43℃，time24 h.Under the conditions，natto kinase contentandmucusyieldwere0.076mg/m land 17.60%，respectively.

natto；nattokinase content；mucusyield

TS214．2

0254-5071（2016）01-0141-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．031

2015-11-06

黃婷（1990-），女，碩士研究生，研究方向為新資源開發(fā)與利用。

劉良忠（1963-），男，教授，博士，研究方向為新資源開發(fā)與利用。