滇黃芩總黃酮酶解超聲提取工藝及抗氧化活性研究

劉海鷗，虎春艷，趙聲蘭，普春霞，劉曉玲，林玉萍（云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

滇黃芩總黃酮酶解超聲提取工藝及抗氧化活性研究

劉海鷗，虎春艷，趙聲蘭，普春霞，劉曉玲，林玉萍*
（云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

該文研究了滇黃芩總黃酮酶解超聲提取的工藝條件及總黃酮的抗氧化活性。結(jié)果表明，纖維素酶解超聲工藝對(duì)滇黃芩總黃酮的提取具有協(xié)同作用，提高總黃酮提取得率。在超聲功率100W條件下，通過單因素和正交試驗(yàn)，得出酶解超聲最佳工藝條件為提取時(shí)間4 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、加酶量50U/g（干原料）、液料比30∶1（m L∶g）、提取溫度50℃，在此條件下，平均提取得率為24.03%?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)研究表明，滇黃芩總黃酮對(duì)超氧陰離子和羥自由基的清除率IC50分別為0.14mg/m L、0.20mg/m L。

纖維素酶；超聲；滇黃芩總黃酮；得率；抗氧化活性

滇黃芩（Scutellaria amoena C.H.W right）是云南道地中藥材，地方本草《滇南本草》（明朝）記載其“味苦，性寒，上行瀉肺火，下降瀉膀胱火”。滇黃芩為多年生草本，生于向陽(yáng)坡草地、石隙或雜草叢中［1］。

滇黃芩是我國(guó)西南地區(qū)藥用黃芩的主流品種，具有較高的利用價(jià)值?，F(xiàn)代研究表明，黃芩主要含有黃酮類成分及揮發(fā)油類、萜類、甾醇類等成分［2］；具有抗菌、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)脂代謝、抗腫瘤、保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用［3-6］。滇黃芩與黃芩相似，主要含有黃酮類化合物。目前對(duì)黃酮類化合物的提取方法有水提、醇提、酶解等提取方法［7］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道纖維素酶可以提高藥材有效成分的溶出率［8］，魏鳳玉等［9］研究發(fā)現(xiàn)乙醇和纖維素酶提取黃芩中總黃酮類成分具有協(xié)同作用，王新等［10］用超聲-酶解法提取麥麩總黃酮成分時(shí)同樣具有協(xié)同作用。為了進(jìn)一步提高滇黃芩中總黃酮的提取得率，縮短提取時(shí)間，用纖維素酶-乙醇-超聲提取，通過單因素和正交試驗(yàn)得到滇黃芩中總黃酮的最佳提取工藝條件，并對(duì)滇黃芩總黃酮進(jìn)行了抗氧化活性研究。本研究為滇黃芩總黃酮的提取及其抗氧化活性提供了理論依據(jù)，有利于滇黃芩的進(jìn)一步開發(fā)利用。

1　材料與方法

1.1料與試劑

滇黃芩樣品：采自云南玉溪新平；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品、纖維素酶（酶活力35U/mg）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、濃鹽酸、雙氧水、無(wú)水乙醇、濃硫酸均為國(guó)產(chǎn)分析純：汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2器與設(shè)備

H.H.S11-4電熱恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；SK 2200H超聲儀：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；電子天平：美國(guó)KUDOS公司；UV 759S紫外-可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長(zhǎng)200～400 nm處紫外掃描，結(jié)果在波長(zhǎng)278 nm有最大吸收，即λmax=278 nm。精密稱取黃芩苷對(duì)照品7.1mg，置于25m L容量瓶，用70%乙醇水溶液定容，搖勻，分別取0、0.5m L、1.0m L、1.5m L、2.0m L、2.5m L、3.0m L于25m L容量瓶，用無(wú)水乙醇定容至刻度。用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在波長(zhǎng)278 nm處的吸光度值（A），以吸光度值A(chǔ)對(duì)黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品含量（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=63.248C-0.010 8（R2=0.999 8）。

1.3.2黃酮提取方法及提取得率計(jì)算

精確稱取3.0 g干燥的滇黃芩粉末，加入60m L一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，另加纖維素酶，一定溫度水浴，超聲功率100W條件下回流提取，抽濾，濾液置于沸水浴中3min，冷卻至室溫，用無(wú)水乙醇定容至100m L，稀釋后測(cè)波長(zhǎng)278 nm處的吸光度值?？傸S酮得率計(jì)算公式如下：

式中：η為總黃酮提取得率，%；C為滇黃芩總黃酮溶液的質(zhì)量濃度，mg/m L；V為濾液體積，mL；m為滇黃芩粉末質(zhì)量，g。

1.3.3黃酮提取工藝條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響：選取提取溫度50℃，液料比20∶1（m L∶g），乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，加酶量50 U/g（干原料），控制提取時(shí)間分別為2 h、3 h、4 h、5 h、6 h進(jìn)行提取，計(jì)算總黃酮的得率，分析提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響：確定提取時(shí)間5 h，溫度50℃，液料比20∶1（m L∶g），加酶量50U/g，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%，計(jì)算總黃酮的得率，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取得率的影響。

料液比對(duì)總黃酮提取得率的影響：確定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時(shí)間5 h，溫度50℃，加酶量50U/g，控制料液比分別為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1（m L∶g），計(jì)算總黃酮的得率，分析液料比對(duì)總黃酮提取得率的影響。

加酶量比對(duì)總黃酮提取得率的影響：確定液料比30∶1（m L∶g），乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時(shí)間5 h，溫度50℃，控制加酶量分別為30 U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g，計(jì)算總黃酮的得率，分析加酶量對(duì)總黃酮提取得率的影響。

溫度對(duì)總黃酮提取得率的影響：確定加酶量50 U/g，液料比30∶1（m L∶g），乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時(shí)間5 h，控制溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，計(jì)算總黃酮的得率，分析溫度對(duì)總黃酮提取得率的影響。

（2）正交試驗(yàn)

為確定最佳工藝條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在溫度50℃條件下，以總黃酮提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取L9（34）正交表對(duì)滇黃芩總黃酮提取得率進(jìn)行研究，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　總黃酮提取得率優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factor and levels of orthogonalexperiments for total flavonoid extraction yield optimization

1.3.4黃酮體外抗氧化活性研究

稱取滇黃芩300 g，按照上述工藝條件進(jìn)行提取得到滇黃芩粗提取物，按照文獻(xiàn)條件［11］，利用AB-8型大孔樹脂純化得滇黃芩總黃酮。

（1）清除超氧陰離子（O2-·）活性測(cè)定［12］

采用鄰苯三酚自氧化法，取10m L具塞試管，依次加入0.1mol/L pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液4.5m L，蒸餾水4.2m L，搖勻，25℃恒溫水浴20m in，取出后立即加入25℃預(yù)熱3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 m L，迅速混勻，在波長(zhǎng)319 nm處每隔30 s測(cè)一次吸光度值，計(jì)算鄰苯三酚的自氧化速率△A對(duì)照，按上法在加入鄰苯三酚前，先加入滇黃芩總黃酮溶液，測(cè)定△A樣品。超氧自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：△A對(duì)照為1min內(nèi)對(duì)照管吸光度的變化值；△A樣品為1m in內(nèi)對(duì)照管吸光度的變化值。

（2）清除羥自由基（·OH）的活性測(cè)定［13］

采用H2O2/Fe體系法，利用鄰二氮菲與Fe2+反應(yīng)生成配合物，該配合物在波長(zhǎng)536 nm處有最大吸收。當(dāng)有羥自由基（·OH）存在的情況下，F(xiàn)e2+會(huì)被氧化成Fe3+，從而降低產(chǎn)物在波長(zhǎng)536 nm處的吸光度值。待測(cè)樣品如果對(duì)羥自由基具有清除作用，會(huì)抑制A536nm的減少。取10m L具塞試管，以維生素C（vitamicC，VC）為陽(yáng)性對(duì)照，分別依次加入滇黃芩總黃酮溶液或等濃度VC溶液1m L，0.75mmol/L FeSO4溶液1m L，0.75mmol/L鄰二氮菲1m L，0.01%H2O2溶液1m L，37℃保溫1 h，測(cè)定吸光度值A(chǔ)。損傷管和未損傷管不加抑制劑，損傷管含1m LH2O2，未損傷管不加H2O2。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為未損傷管的吸光度值；A1為損傷管的吸光度值；A2為樣品未損傷管的吸光度值；A3為樣品損傷管的吸光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1黃酮提取工藝條件的優(yōu)選

2.1.1因素試驗(yàn)

（1）提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的影響

圖1　提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響Fig.1 Effectof extraction time on extraction yield

提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，滇黃芩總黃酮的提取得率在2～4h內(nèi)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取得率急劇升高；4～5h總黃酮的提取得率趨于穩(wěn)定；超過5h，提取得率微微下降。由于黃酮類成分具有酚羥基，長(zhǎng)時(shí)間提取結(jié)構(gòu)容易發(fā)生改變，故提取時(shí)間5h為宜。

（2）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取得率的影響

圖2　不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取得率的影響Fig.2 Effecto f ethano lcontenton extraction yie ld

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取得率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在35%～60%時(shí)總黃酮的提取得率較高，是由于乙醇和酶具有協(xié)同作用破壞細(xì)胞壁，提高總黃酮的溶出率；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞60%時(shí)，脂溶性雜質(zhì)溶出率增高，并對(duì)酶的活性產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致總黃酮溶出率反而減低。故乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇45%為宜。

（3）不同液料比對(duì)總黃酮提取得率的影響

圖3　不同液料比對(duì)提取得率的影響Fig.3 Effecto f liquid-to-solid ratio on extraction yield

料液比對(duì)總黃酮提取得率結(jié)果的影響見圖3。由圖3可知，隨著液料比的增大，提取得率增加，當(dāng)料液比超過30∶1（m L∶g）后，提取得率趨于穩(wěn)定。溶劑增多可加大濃度差，有利于有效成分的溶出，但雜質(zhì)的溶出率也會(huì)增加，從經(jīng)濟(jì)學(xué)角度考慮，液料比以30∶1（m L∶g）為宜。

（4）加酶量對(duì)總黃酮提取得率的影響

圖4　加酶量對(duì)提取得率的影響Fig.4 Effectof enzyme addition on extraction yield

加酶量對(duì)總黃酮提取得率的影響見圖4。從圖4可知，纖維素酶量在30～50U/g間時(shí)，提取得率增加，纖維素酶量超過50U/g以后，提取得率趨于穩(wěn)定，則選取纖維素酶添加量為50U/g。

（5）提取溫度對(duì)總黃酮提取得率的影響

圖5　不同溫度對(duì)提取得率的影響Fig.5 Effectof extraction tem perature on extraction ratio

溫度對(duì)總黃酮提取得率的影響見圖5。由圖5可知，當(dāng)溫度在30～50℃時(shí)，提取率隨著溫度的升高而增加，超過50℃后，提取率呈下降趨勢(shì)。溫度的升高有利于有效成分的溶出，但過高的溫度會(huì)抑制纖維素酶的活性，也會(huì)導(dǎo)致黃酮類成分分解，故溫度以50℃為宜。

2.2交試驗(yàn)

為確定最佳工藝條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，因溫度對(duì)總黃酮提取影響不顯著，故固定溫度50℃條件下，選取L9（34）正交表對(duì)滇黃芩總黃酮提取進(jìn)行研究，重復(fù)試驗(yàn)3次。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3　總黃酮提取率優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab le 3 Results and analysis of orthogonalexperiments for total flavonoid extraction yield optim ization

表4　正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonalexperiments results

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳試驗(yàn)方案為A1B3C3D2，即提取時(shí)間4 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，加酶量60U/g，液料比30∶1（m L∶g）。方差分析表明，提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、纖維素酶添加量以及液料比對(duì)滇黃芩總黃酮的提取率均有顯著影響（P＜0.05）。按照此試驗(yàn)方案，重復(fù)3次，總黃酮提取得率分別為24.27%、23.68%、24.13%，平均提取得率為24.03%。

2.3黃酮體外抗氧化活性

2.3.1超氧陰離子的清除作用

圖6　滇黃芩總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除率Fig.6 Superoxide anion scavenging activity o f total flavones from Scute llaria amoena

滇黃芩總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除結(jié)果見圖6。由圖6可知，低質(zhì)量濃度的滇黃芩總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除效果接近于VC，當(dāng)質(zhì)量濃度＞0.25mg/m L時(shí)清除率超過了VC。滇黃芩總黃酮清除超氧陰離子的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.14mg/m L，表明高質(zhì)量濃度的滇黃芩總黃酮對(duì)超氧陰離子具有較強(qiáng)的清除作用。

2.3.2羥自由基（·OH）的清除作用

圖7　滇黃芩總黃酮對(duì)除羥自由基的清除率Fig.7 Hydroxyl free radical scavenging ac tivity of to tal flavones from Scute llaria am oena

滇黃芩總黃酮對(duì)除羥自由基的清除效果見圖7，由圖7可以看出，滇黃芩總黃酮對(duì)羥自由基具有明顯的清除作用，當(dāng)質(zhì)量濃度＞0.2mg/m L時(shí)，清除作用超過了同濃度的維生素C，滇黃芩總黃酮清除羥自由基IC50為0.200 1mg/m L，表明滇黃芩總黃酮對(duì)羥自由基具有較強(qiáng)的清除作用。

3　結(jié)論

研究表明，纖維素酶超聲提取法能有效破解藥材細(xì)胞的細(xì)胞壁，有利于成分的溶出［13］，對(duì)滇黃芩中總黃酮的提取具有協(xié)同作用，能有效提高滇黃芩中總黃酮的提取得率。在超聲功率100W條件下，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到滇黃芩總黃酮的最佳提取工藝條件，即提取時(shí)間4 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，加酶量60U/g，液料比30∶1（m L∶g）。在此最佳條件下，總黃酮得率達(dá)到24.03%。純化后的滇黃芩總黃酮對(duì)超氧自由基和羥自由基均具有有較強(qiáng)的的清除作用，具有良好的抗氧化活性，對(duì)滇黃芩資源的利用開發(fā)具有一定意義。

［1］李婭瓊，游春，楊耀文，等.民族藥滇黃芩的本草考證李婭瓊［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，28（1）：13-15，21.

［2］王雅芳，李婷，唐正海，等.中藥黃芩的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（1）：206-211.

［3］TAKAHASHIH，CHEN M C，PHAM H，etal.Baicalein a componentof Scutellaria baicalensis，induces apoptosis by M cl-1 down-regulation in human pancreatic cancer cells［J］.BBA-M ol Cell Biol L，2011，13（8）: 1465-1474.

［4］WAISUNDARA V Y，SIU SY，etal.Baicalin upregulates thegenetic expression of antioxidant enzymes in Type-2 diabetic Goto-Kakizaki rate［J］.Life Sci，2011，88（23-24）:16-25.

［5］DU G J，HAN G，ZHANG S，et al.Baicalin suppresses lung carcinoma and lung metastasis by SOD mimic and HIF-1αinhibition［J］.Eur J Pharm Biopharm，2010，630（1-3）:1-30.

［6］何曉山，彭林，林青.滇黃芩總黃酮對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞電壓依賴性鈉通道電流的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（6）：192-195.

［7］黃賢榮，于燕莉，董淑榮.國(guó)內(nèi)常用的黃芩有效成分提取分離方法簡(jiǎn)介［J］.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2012，29（3）：267-269.

［8］喻春皓，張萍，王宏志.正交試驗(yàn)優(yōu)選蒸制黃芩的纖維素酶輔助提取工藝［J］.中國(guó)藥房，2009，20（36）：2826-2827.

［9］魏鳳玉，王欣纖.維素酶-乙醇協(xié)同提取黃芩總黃酮［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26（4）：575-578.

［10］王新，肖凱軍.纖維素酶-超聲輔助提取麥麩總黃酮的工藝研究［J］.食品科技，2009，34（12）：230-234.

［11］呂子明，李志宏，梁俊清，等.大孔吸附樹脂純化黃芩總黃酮工藝研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（10）：143-145.

［12］梁杏，張旭，陳朝銀，等.核桃餅粕多酚純化工藝及其抗氧化活性的研究［J］.中國(guó)釀造，2015，34（4）：55-61.

［13］虎春艷，林玉萍，魯瑞，等.紫色胡蘿卜汁體外抗氧化活性的研究［J］.中國(guó)釀造，2015，34（1）：85-88.

［14］伏慧慧，譚梅，郭艷秋.響應(yīng)面法優(yōu)化“酶法-超聲波”連續(xù)提取核桃青皮多酚［J］.食品研究與開發(fā)，2015，36（7）：42-47.

［15］李小龍，雍其歡，崔秋兵.纖維素酶-超聲波輔助提取泡姜姜辣素的研究［J］.中國(guó)釀造，2015，34（6）：103-106.

Enzymatic-ultrasonic extraction of total flavonoids from Scutellariaamoena and itsantioxidantactivities

LIU Haiou，HU Chunyan，ZHAO Shenglan，PU Chunxia，LIU Xiaoling，LIN Yuping*
（College of TraditionalChinese Medicine，Yunnan University ofTraditional Chinese Medicine，Kunm ing 650500，China）

The enzymatic-ultrasonic extraction condition of total flavonoids from Scutellaria am oena and its antioxidant activities were studied.The results indicated that enzymatic-ultrasonic method had synergistic effect on total flavonoids extraction from S.am oena，and had higher extraction rate.The optimum condition ofenzymatic-ultrasonic extraction wasobtained through single factor testand orthogonal testat the ultrasound power of 100W.The optimal conditionswere determined as follows:extraction time 4 h，ethanol concentration 55%，enzyme addition 50 U/g（drymaterial），liquid to solid ratio 30∶1，extraction temperature50℃.Under thecondition，the total flavonoidswere24.03%.Theantioxidant testsresults indicated that scavenging capacity（IC50）of S.amoena total flavonoids towardssuperoxideanionand hydroxyl radicalswere0.14mg/m land 0.20mg/m l，respectively.

cellulase；ultrasonic；total flavonoidsof Scutellaria amoena；extraction yield；antioxidantactivity

R282．71

0254-5071（2016）01-0110-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．024

2015-10-23

云南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2014z119），云南省教育廳項(xiàng)目（2013y239）

劉海鷗（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物活性成分。

林玉萍（1975-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘钚猿煞帧?/p>