食用菌發(fā)酵液體外對白色念珠菌生長和生物被膜形成影響

竇會娟，暢靈麗，孫連海，郭文濤（漯河醫(yī)學高等專科學校 基礎醫(yī)學部，河南 漯河 462002）

食用菌發(fā)酵液體外對白色念珠菌生長和生物被膜形成影響

竇會娟，暢靈麗，孫連海，郭文濤
（漯河醫(yī)學高等?？茖W校 基礎醫(yī)學部，河南 漯河 462002）

該文研究食用菌液體發(fā)酵液體外對白色念珠菌（Candidaalbicans）生長及生物被膜形成的影響。采用紙片擴散法測定食用菌液體發(fā)酵液中白色念珠菌的抑菌活性；甲基四氮鹽（XTT）減低法測定其對白色念珠菌生物被膜形成的影響。結果表明，各種食用菌發(fā)酵液對白色念珠菌均有不同程度的抑制作用，其中對發(fā)酵液抑菌作用從強到弱依次為香菇發(fā)酵液、雞腿菇發(fā)酵液，抑菌圈直徑分別為（2.967±0.160）mm、（2.433±0.214）mm。對白色念珠菌生物被膜形成的抑制作用強弱依次為雞腿菇發(fā)酵液和香菇發(fā)酵液，其相對抑菌率分別為（39.25±1.87）%、（28.72±2.59）%。雞腿菇和香菇均對白色念珠菌在培養(yǎng)12 h時形成的生物被膜的抑制作用最強，相對抑菌率分別達到（46.37±3.14）%和（42.86±3.38）%。香菇及雞腿菇發(fā)酵液對白色念珠菌生長及其生物被膜的形成有一定的抑制作用，有進一步的開發(fā)價值。

食用菌；液體發(fā)酵；白色念珠菌；生物被膜；抑制

隨著廣譜抗生素、糖皮質激素和免疫抑制劑等的廣泛應用，免疫受損人群不斷增加，條件致病真菌中念珠菌的感染率日漸升高［1-2］。白色念珠菌（Candidaalbicans）是臨床最常見的致病真菌，在機體免疫功能低下時，可引起黏膜和全身性的感染［3］。隨著抗真菌藥物的廣泛應用，白色念珠菌的耐藥現象越來越嚴重［4］。該菌對傳統(tǒng)抗菌藥物產生耐藥性是治療此類感染的難點。研究顯示，真菌的耐藥性與生物被膜有著密切關聯(lián)［5］。念珠菌的耐藥性與其形成生物被膜密切相關，以生物被膜狀態(tài)存在的念珠菌對抗菌藥物的敏感性要下降幾十倍甚至上千倍［6］。白色念珠菌生物被膜活性隨培養(yǎng)時間延長而增加，48 h后代謝活性相對穩(wěn)定［7］。故本研究中對生物被膜的培養(yǎng)時間的選擇，確定為48 h。CHANDRA J等［8］發(fā)現白色念珠菌生物被膜的形成分為3個階段：早期（0～11 h），中期（12～30 h）和成熟期（38～72 h）。早期的黏附尤為重要，隨著培養(yǎng)時間的延長，生物被膜逐漸發(fā)育成熟，故抑制黏附是抗白色念珠菌生物被膜感染的關鍵措施。近幾年，食用菌的抑菌作用逐漸受到研究者的關注。我國食用真菌資源豐富，而且大型食用真菌可以較方便地通過菌絲體或孢子發(fā)酵培養(yǎng)［9］，但食用菌液體發(fā)酵液對白色念珠菌的生長和生物被膜形成的影響，相關研究較少。

本研究采用液態(tài)發(fā)酵的方法制備金針菇（Flammulinavelutipes）、香菇（Lentinula edodes）、茶樹菇（Agrocybe aegerita）、雞腿菇（Coprinuscomaus）、杏鮑菇（Pleurotus eryngi）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、木耳（Auricularia auricula）的液態(tài)發(fā)酵液。Kirby-Bauer（K-B）紙片擴散法測定發(fā)酵液對白色念珠菌的抑菌活性，甲基四氮鹽（XTT）減低法測定其對白色念珠菌生物被膜形成的影響，為更好地解決白色念珠菌的感染和耐藥問題提供新的思路。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1用菌與指示菌

供試7種食用菌（金針菇、香菇、茶樹菇、雞腿菇、杏鮑菇、猴頭菇、木耳）：本實驗室保存菌種；白色念珠菌（Candida albicans）ATCC10231：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基及食用菌一級搖瓶液體培養(yǎng)基分別按照參考文獻［10-11］配制。

食用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖30 g，玉米粉20 g，麩皮40 g，加水至1 000m L，調節(jié)pH值為7.0。

沙氏瓊脂（Sabouraud'sagar，SDA）培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，加水至蒸餾水1 000m L，調節(jié)pH值為4.0～6.0。

RPM I-1640培養(yǎng)基：賽齊（上海）生物工程有限公司。

1.1.3學試劑

KH2PO4（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；硫酸銨（分析純）：鄭州辰尼化學試劑廠；MgSO4·7H2O、葡萄糖（分析純）：天津市科密歐科技有限公司；甲基四氮鹽（超純級）：上海寶曼生物科技有限公司；CountessC10227自動血細胞計數儀：南京貝登生物科技有限公司。

1.2器與設備

DHZ-CA大容量恒溫振蕩器：江蘇太倉市實驗設備廠；LRH-250-HS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；DG3022A酶標儀：南京華東電子醫(yī)療裝備有限公司。

1.3法

1.3.1用菌液體發(fā)酵液的制備

參照文獻［12］中食用菌菌種活化方法和液體種子制備方法進行菌種活化和液體種子制備，然后按照香菇液體發(fā)酵產抑菌物質活性最高的發(fā)酵條件［13］，發(fā)酵液初始pH值為5，裝液量為100m L/300m L，接入7%的液體菌種，于28℃、180 r/m in搖床培養(yǎng)8 d，即得食用菌液體發(fā)酵液。

1.3.2同食用菌液態(tài)發(fā)酵產物抑菌活性的測定

取200μL發(fā)酵液加于制備好的6mm滅菌紙片，同時制作蒸餾水紙片作為空白對照。37℃干燥后分裝于小瓶中，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肒-B紙片擴散法［14］，取菌懸液200μL均勻涂于SDA固體培養(yǎng)基。取制備好的藥敏紙片5片貼于瓊脂培養(yǎng)基表面，并放置空白對照紙片于正中心，25℃培養(yǎng)24 h，十字交叉法測量抑菌圈直徑。

發(fā)酵液抑菌圈直徑（mm）=待測發(fā)酵液抑菌圈直徑-6（滅菌紙片直徑）

1.3.3色念珠菌菌懸液的配制

將白色念珠菌接種于SDA液體培養(yǎng)基中，35℃搖床培養(yǎng)48 h，用RPM I-1640培養(yǎng)基稀釋，血細胞計數板計數，調整菌懸液濃度為1×106～5×106CFU/m L。

1.3.4色念珠菌生物被膜制備

以100μL/孔菌液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)2 h后棄去RPM I-1640培養(yǎng)基，用pH 7.4、0.01 mol/L磷酸緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）洗3次，加入100μL RPM I-1640培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)的零點，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)基。

1.3.5同食用菌液體發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響

在生物被膜培養(yǎng)的零點，加入食用菌液體發(fā)酵液100μL，空白對照孔加入200μL培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，聚丁二酸丁二醇酯（poly butylenes succinate，PBS）洗滌3次，用XTT減低法測量各孔在波長490 nm處的OD490nm值。每組設3個重復孔，根據OD490nm值計算相對抑制率［15-16］。相對抑制率計算公式如下：

1.3.6用菌液體發(fā)酵液對不同生長階段白色念珠菌生物被膜的影響

將100μL白色念珠菌液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，分別在生物被膜培養(yǎng)的0、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h時棄去培養(yǎng)基，加入食用菌液體發(fā)酵液100μL，空白對照組僅加入培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。XTT法測量各孔在波長490 nm處的OD490nm值，根據OD490nm值計算相對抑制率。

1.3.7計學分析

所有數據均應用SPSS 17統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。

2　結果與分析

2.1同食用菌發(fā)酵液對白色念珠菌的生長抑制作用

采用K-B紙片擴散法測定不同食用菌發(fā)酵液對白色念珠菌的生長抑制作用，結果如表1所示。

表1　不同食用菌發(fā)酵液對白色念珠菌的抑菌作用Table 1 Inhibition effect of diffe rent edible fungus ferm entation liquid on C.albicans

由表1可知，7種食用菌液體發(fā)酵液對白色念珠菌的生長均有不同程度的抑制作用，其中香菇、雞腿菇對白色念珠菌的抑菌作用最強，抑菌圈直徑分別是（2.967±0.160）mm和（2.433±0.214）mm，杏鮑菇發(fā)酵液的抑菌作用最弱，抑菌圈直徑只有（0.233±0.107）mm。

2.2同食用菌液體發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響

調節(jié)發(fā)酵液初始pH值為5，在300m L三角瓶中裝入液體發(fā)酵培養(yǎng)100m L，接入7%的液體菌種，于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)8d，即得食用菌液體發(fā)酵液。不同食用菌液體發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的影響，結果如表2所示。

表2　不同食用菌液體發(fā)酵物對白色念珠菌生物被膜的影響Table 2 Effect of different edible fungus ferm entation liqu id on biofilm formation of C.albicans

由表2可知，雞腿菇發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的抑制作用是最強的，相對抑制率達到了（39.25±1.87）%，香菇的抑制作用次之，相對抑制率為（28.72±2.59）%。金針菇、杏鮑菇、木耳和猴頭菇對白色念珠菌生物被膜形成的抑制作用不明顯。生物被膜是一種黏附于非生物或生物表面的微生物菌落，生物被膜中菌的生物學特性與浮游菌顯著不同［7］。雖然香菇發(fā)酵液對白色念珠菌的抑菌活性是最高的，但對白色念珠菌的生物被膜來說，雞腿茹發(fā)酵液的抑制作用是最強的。

2.3腿菇及香菇發(fā)酵液對不同生長階段白色念珠菌生物被膜的影響

表3　雞腿菇及香菇液體發(fā)酵液對不同生長階段白色念珠菌生物被膜形成的影響Tab le 3 Effec t of C.com aus and L.edodes ferm entation liqu id on biofilm formation of C.albicans at differentgrow th phases

結合食用菌發(fā)酵液對白色念珠菌的抑菌作用和對生物被膜形成的影響，選定雞腿菇、香菇發(fā)酵液為對白色念珠菌生物被膜抑制效果較好的菌種，進一步測定了其發(fā)酵液對不同生長階段生物被膜的影響，結果如表3所示。

由表3可知，隨著生物被膜形成時間的延長，雞腿菇和香菇對其抑制率增強，到12 h時，相對抑制率達到最高值，分別為（46.37±3.14）%和（42.86±3.38）%，隨后逐漸降低。表明雞腿菇和香菇發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的早中期有較強的抑制作用。

3　結論

本研究選取具有較強生物被膜形成功能的白色念珠菌（ATCC10231）為標準菌株，研究食用菌液體發(fā)酵液體外對白色念珠菌生長及生物被膜形成的影響。采用紙片擴散法測定食用菌液體發(fā)酵液對白色念珠菌的抑菌活性；甲基四氮鹽（XTT）減低法測定其對白色念珠菌生物被膜形成的影響。結果表明，各種食用菌發(fā)酵液對白色念珠菌均有不同程度的抑制作用，其中香菇發(fā)酵液抑菌作用最強，抑菌圈直徑為（2.967±0.160）mm；雞腿菇發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的抑制作用最強，相對抑菌率為（39.25±1.87）%，香菇發(fā)酵液對白色念珠菌生物被膜形成的抑制作用次之，相對抑菌率為（28.72±2.59）%。雞腿菇和香菇對白色念珠菌培養(yǎng)12 h時形成的生物被膜的抑制作用最強，相對抑制率分別達到（46.37±3.14）%和（42.86±3.38）%。對于抑制白色念珠菌感染，香菇、雞腿菇發(fā)酵液有進一步的開發(fā)價值。

［1］PERLROTH J，CHOIB.Nosocom ial fungal infections:epidem iology，diagnosis，and treatment［J］.M ed M ycol，2007，45（4）:321-346.

［2］W ILSON D，THEWES S，ZAKIKHANY K，et al.Identifying infection-associated genes of Candida albicans in the postgenomic era［J］. FEMSYeast Res，2009，9（5）:688-700.

［3］SENEVIRATNE C J，WANG Y，JIN L，etal.Candida albicans biofilm formation is associated with increased anti-oxidative capacities［J］.Proteomics，2008，8（14）:2936-2947.

［4］王曉麗，白麗.白色念珠菌耐藥的研究進展［J］.中國病原生物學雜志，2009，4（12）：946-947.

［5］DONLAN R M，COSTERTON JW.Biofilms:Survialmechanisms of clinically relevantm icroorganisms［J］.C lin M icrobiol Rev，2002，15（2）: 167-193.

［6］張夢翔，施高翔.姜黃素對5種非白念珠菌菌絲及生物被膜形成的抑制作用［J］.中草藥，2015，46（4）：549-553.

［7］王丹敏，靳穎.白色念珠菌生物被膜生長動力學分析和形態(tài)學觀察［J］.武警醫(yī)學院學報，2010，19（9）：698-700.

［8］CHANDRA J，KUHND.Biofilm formation by the fungal pathogen Candidaalbicans:development，architectureand drug resistance［J］.Bacteriol，2001，183（18）:5385-5394.

［9］潘春磊，盛春鴿.食用菌保健功能及產品開發(fā)技術研究進展［J］.北方園藝，2014，15（8）：197-200.

［10］李阜棣.農業(yè)微生物學實驗技術［M］.北京：中國農業(yè)出版社，1999.

［11］金紅，楊孝麗.食用菌深層發(fā)酵物中生物活性物質含量的比較［J］.食品研究與開發(fā)，2015，36（2）：93-96.

［12］竇會娟，孫連海.食用菌發(fā)酵液對耐藥菌的抑菌活性研究［J］.中國釀造，2015，34（7）：40-42.

［13］竇會娟，張群芝.香菇產抑菌活性物質液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.中國釀造，2014，33（9）：45-48.

［14］徐叔云，卞如濂.藥理實驗方法學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

［15］尉玲芬.八角茴香提取液抑菌效果的藥理研究［J］.海峽藥學，2011，23（4）：45-47.

［16］張曉玲，于翠香.鹽酸小檗堿、黃芩苷與抗菌藥物聯(lián)用對多重耐藥鮑曼不動桿菌作用研究［J］.中南藥學，2014（5）：411-414.

Effectofedible fungus fermentation liquid on grow th and biofilm formation of Candidaalbicans in vitro

DOU Huijuan，CHANG Lingli，SUN Lianhai，GUOWentao
（Faculty ofBasic Medicine，Luohe Medical Co llege，Luohe462002，China）

The effect of edible fungus fermentation liquid on grow th and biofilm formation of Candida albicans in vitro was researched in the paper. The bacteriostatic activity of C.albicans in fermentation liquid was determined by Kirby-Bauer，and the biofilm formation of C.albicans was determ ined by XTT reductionmethod.The resultsshowed thatallkindsof edible fungus fermentation liquid had a certain inhibiting effecton C.albicans. The bacteriostasisof Lentinus edodes fermentation liquid was the strongest，and the antibacterial circle diameterwas（2.967±0.160）mm，followed by thatof Coprinus comatus was（2.433±0.214）mm.The inhibiting effectof C.comatus fermentation liquid on biofilm formation of C.albicans was the strongest；the relative bacteriostatic ratewas（39.25±1.87）%，followed by that of L.edodes was（28.72±2.59）%.C.comatus and L.edodes had the strongest inhibitory effecton biofilm formation of C.albicans at12 h，the relative bacteriostatic rate reached to（46.37±3.14）%and（42.86±3.38）%，respectively.The fermentation liquid of C.comatus and L.edodes had a certain inhibiting effect on grow th and biofilm formation of C.albicans，which had furtherdevelopmentvalue.

edible fungus；submerged fermentation；Candidaalbicans；biofilm；inhibition

TS261．9

0254-5071（2016）01-0086-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．019

2015-11-18

河南省科技發(fā)展計劃基礎與前研科研課題（142300410430）

竇會娟（1977-），女，副教授，碩士，研究方向為微生物資源開發(fā)及微生物生態(tài)學。