鞘氨醇單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)韋蘭膠培養(yǎng)基優(yōu)化研究

劉元濤，董學前，王　偉，張永剛，吉武科（1.齊魯工業(yè)大學 生物工程學院，山東 濟南 50300；.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，山東 濟南 50013；3.阜豐集團有限公司，山東 莒南 76600）

鞘氨醇單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)韋蘭膠培養(yǎng)基優(yōu)化研究

劉元濤1，3，董學前2*，王偉2，張永剛2，吉武科2
（1.齊魯工業(yè)大學 生物工程學院，山東 濟南 250300；2.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，山東 濟南 250013；3.阜豐集團有限公司，山東 莒南 276600）

韋蘭膠是由鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）分泌的一種可溶性胞外多糖。該研究以實驗室保存的一株韋蘭膠生產(chǎn)菌Sphingomonas sp.511的產(chǎn)膠率為指標，在單因素試驗確定顯著因素的基礎上，通過最陡爬坡試驗確定顯著因素的較優(yōu)水平，再經(jīng)響應面法設計試驗優(yōu)化韋蘭膠發(fā)酵培養(yǎng)基，得出韋蘭膠最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖35.5 g/L，豆粕6.3 g/L，K2HPO42.4 g/L，在此條件下韋蘭膠的產(chǎn)膠率達24.87 g/L。

韋蘭膠；鞘氨醇單胞菌；響應面

韋蘭膠又名威蘭膠或溫倫膠，是由鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）發(fā)酵產(chǎn)生的一種微生物胞外多糖［1］，其結(jié)構與結(jié)冷膠相似［2-3］，主鏈結(jié)構由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重復單元構成，側(cè)鏈由單一的L-吡喃鼠李糖基或L-吡喃甘露糖基構成［4-5］，此外約半數(shù)的主鏈重復單元含有乙?；案视突鶊F。韋蘭膠是美國C.P.Kelco公司20世紀80年代繼黃原膠、結(jié)冷膠之后開發(fā)的一種具有廣闊市場前景的微生物胞外多糖［6］，其水溶液是一種典型的假塑性流體，與黃原膠相比，同等濃度條件下黏度高，特別是在低濃度條件下能保持較好的黏度；并且韋蘭膠溶液耐酸堿能力強，在pH 2～12范圍內(nèi)黏度幾乎保持不變；另外溫度對韋蘭膠溶液黏度的影響較小［4-5］。目前韋蘭膠作為增稠劑、黏合劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、潤滑劑和成膜劑在工業(yè)領域已被推廣應用，特別是在石油開采、建筑材料等領域［7-9］，但居高不下的生產(chǎn)成本使其的生產(chǎn)規(guī)模及應用受到嚴重制約，因此提高韋蘭膠生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本對于促進韋蘭膠產(chǎn)業(yè)化規(guī)模及其推廣應用具有重要意義。

目前國外關于韋蘭膠的結(jié)構和應用性的相關報道較多，但韋蘭膠的研究在國內(nèi)尚屬于起步階段，近幾年很多院校［1，10-17］都已開展關于韋蘭膠的研究，研究工作主要是韋蘭膠菌種選育、搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化、韋蘭膠流變學性質(zhì)及其影響因素等方面。

為了提高韋蘭膠生產(chǎn)效率，本研究采用單因素試驗，確定影響韋蘭膠發(fā)酵的主要因素，然后進行最陡爬坡試驗確定最大響應值區(qū)域，最后通過Box-Behnken試驗設計進行響應面［18］優(yōu)化，確定鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）511發(fā)酵生產(chǎn)韋蘭膠培養(yǎng)基較優(yōu)組成，從而提高韋蘭膠生產(chǎn)效率。

1　材料和方法

1.1料與試劑

鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）511：本實驗室利用Sphingomonas sp.ATCC31555為出發(fā)菌株篩選優(yōu)化的一株高產(chǎn)韋蘭膠的鞘氨醇單胞菌。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl5.0 g/L、瓊脂20.0 g/L，pH 7.0；

種子培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g/L、酵母膏1.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，pH 7.0；

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g/L、豆粕粉4.0 g/L、K2HPO42.0 g/L，pH 7.5。

1.2器與設備

GB-303梅特勒-托利多電子分析天平：梅特勒-托利多集團；PB-10精密pH計：德國賽多利斯集團；ZQWY-200恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；NDJ-1黏度計：上海天平儀器廠。

1.3法

1.3.1瓶發(fā)酵培養(yǎng)

取低溫冰箱保藏的甘油管1支，接到新鮮斜面培養(yǎng)基上活化，于32℃恒溫培養(yǎng)3 d。將活化的斜面種子刮取兩環(huán)接入裝有100m L種子培養(yǎng)基的500m L三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為300 r/min，溫度為32℃，培養(yǎng)14 h，再以10%（V/V）的接種量接入裝有80m L發(fā)酵培養(yǎng)基的500m L三角瓶中，轉(zhuǎn)速為300 r/min，溫度為32℃，搖床培養(yǎng)72 h。

1.3.2因素試驗

碳源選擇：分別采用30.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、木薯淀粉作碳源，以韋蘭膠的產(chǎn)膠率為指標，發(fā)酵液黏度為參考，考察碳源種類對發(fā)酵的影響。

氮源選擇：分別采用4.0 g/L的酵母膏、蛋白胨、豆粕粉、玉米漿、NH4NO3、尿素作氮源，以韋蘭膠的產(chǎn)膠率為評價指標，發(fā)酵液黏度為參考，考察氮源種類對發(fā)酵的影響。

添加量確定：分別選取不同質(zhì)量濃度的碳源、氮源、K2HPO4，以韋蘭膠的產(chǎn)膠率為評價指標，發(fā)酵液黏度為參考，考察碳源、氮源、K2HPO4質(zhì)量濃度對發(fā)酵的影響。

1.3.3陡爬坡試驗設計

根據(jù)單因素影響顯著的性和初步確定的添加量進行最陡爬坡試驗設計，具體設計見表1。

表1　最陡爬坡試驗設計Table 1 Design of the steepest ascentexperiments

1.3.4應面優(yōu)化設計

在單因素及最陡爬坡試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken，采用Design-Expert8.05b設計3因素3水平，進行響應面的分析試驗，以韋蘭膠產(chǎn)率（Y）為響應值，確定各因素對韋蘭膠產(chǎn)率的影響及最佳組合，試驗設計具體見表2。

表2　Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experim ents

1.3.5定方法

產(chǎn)膠率測定：取適量體積的發(fā)酵液，加入2倍體積的體積分數(shù)95%的乙醇沉淀析出韋蘭膠。過濾、烘干、稱質(zhì)量，提取的韋蘭膠質(zhì)量與發(fā)酵液體積之比即產(chǎn)膠率。

2　結(jié)果與分析

2.1因素試驗

2.1.1源對產(chǎn)膠率的影響

分別以葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、木薯淀粉作碳源進行搖瓶試驗，研究不同碳源對產(chǎn)膠率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，該菌株以葡萄糖為碳源時發(fā)酵液的產(chǎn)膠率最高，以蔗糖為唯一碳源時也能獲得較高的產(chǎn)膠率，但以玉米淀粉和木薯淀粉為碳源時，產(chǎn)膠率都較低，說明該菌水解玉米淀粉和木薯淀粉的能力較低，因此選擇葡萄糖為發(fā)酵碳源。

圖1　碳源對韋蘭膠產(chǎn)膠率的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on welan gum yield

2.1.2源對產(chǎn)膠率的影響

圖2　氮源對韋蘭膠產(chǎn)膠率的影響Fig.2 Effectof differentnitrogen sources on welan gum yield

分別以酵母膏、蛋白胨、豆粕粉、玉米漿、NH4NO3、尿素作為氮源進行搖瓶試驗，研究不同氮源對產(chǎn)膠率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株以豆粕粉為氮源時，發(fā)酵液的產(chǎn)膠率最高，以蛋白胨、酵母膏和玉米漿為氮源時也可獲得較高的產(chǎn)膠率，而以無機氮為氮源時相比有機氮源要差得多，因此選擇豆粕粉為發(fā)酵氮源。

2.1.3適添加量的確定

葡萄糖質(zhì)量濃度對產(chǎn)膠率的影響見圖3。由圖3可知，韋蘭膠產(chǎn)膠率隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，葡萄糖質(zhì)量濃度為35.0 g/L時，韋蘭膠的產(chǎn)膠率達到最大，葡萄糖質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，產(chǎn)膠率有所降低。所以葡萄糖質(zhì)量濃度初定為35.0 g/L。

圖3　葡萄糖質(zhì)量濃度對韋蘭膠產(chǎn)膠率的影響Fig.3 Effectof glucose concentration on welan gum yield

豆粕粉質(zhì)量濃度對產(chǎn)膠率的影響見圖4。由圖4可知，韋蘭膠產(chǎn)膠率隨豆粕粉質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢，豆粕粉質(zhì)量濃度為5.0 g/L時，韋蘭膠的產(chǎn)膠率達到最大，豆粕粉質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，產(chǎn)膠率有所降低。所以豆粕粉質(zhì)量濃度初定為5.0 g/L。

圖4　豆粕粉質(zhì)量濃度對韋蘭膠產(chǎn)膠率的影響Fig.4 Effect of soybean m eal concentra tion on we lan gum yield

K2HPO4質(zhì)量濃度對產(chǎn)膠率的影響見圖5。由圖5可知，韋蘭膠產(chǎn)膠率隨K2HPO4質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢，K2HPO4質(zhì)量濃度為2.0 g/L時，韋蘭膠產(chǎn)膠率達到最大，K2HPO4質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，產(chǎn)膠率有所降低。所以K2HPO4質(zhì)量濃度初定為2.0 g/L。

圖5　不同濃度K2HPO4對韋蘭膠產(chǎn)膠率的影響Fig.5 Effec t of different K2HPO4concentration on welan gum yield

2.2陡爬坡試驗Box-Behnken試驗結(jié)果

以產(chǎn)膠率為考察指標，對葡萄糖、豆粕粉、K2HPO4質(zhì)量濃度進行最陡爬坡試驗，其試驗設計及結(jié)果見表3。

表3　最陡爬坡試驗結(jié)果Table 3 Results of the steepest ascent experiments

由表3可知，最優(yōu)條件在第4組附近，根據(jù)最陡爬坡試驗確定Box-Behnken設計的中心點，設計3因素3水平試驗，結(jié)果見表4。采用Design-Expert8.05b對表4數(shù)據(jù)進行整理分析，得到響應面試驗方差分析，結(jié)果見表5。

表4　Box-Behnken試驗設計結(jié)果Table 4 Experiment results of Box-Behnken design

表5　響應面試驗方差分析Table 5 Variance analysis of response surface test results

采用Design-Expert 8.05b對表4數(shù)據(jù)進行多元擬合，得到擬合方程：

Y=24.40-0.46A-0.32B+1.83C-0.55AB+0.27AC+ 0.36BC-1.25A2-1.78B2-1.14C2

由表5可知，模型的線性相關系數(shù)R2=98.57%，經(jīng)調(diào)整后的決定系數(shù)R2Adj=95.36%，說明經(jīng)過Design-Expert8.05b設計出來的模型與實際試驗擬合程度較好，該模型可以很好的預測培養(yǎng)基組分與韋蘭膠產(chǎn)率之間的關系。且該模型P＜0.05，說明該模型是顯著的，失擬項P=0.37＞0.05，表明試驗誤差較小。

由表5的試驗結(jié)果可以看出，K2HPO4的影響極顯著，葡萄糖的影響顯著，豆粕粉的影響不顯著，影響順序為C＞A＞B。

為了更直觀的描述3因素以及兩兩因素交互作用對響應面的影響，做了響應面分析圖，結(jié)果見圖6。

由圖6可以看出，AB（葡萄糖、豆粕粉）交互作用影響顯著，C曲線最陡，影響最為顯著，其次為A、B，這與表5方差分析結(jié)果一致。

利用Design-Expert8.05b，以韋蘭膠得率為目標進行分析計算得最優(yōu)培養(yǎng)基為葡萄糖35.41 g/L，豆粕粉6.27 g/L，K2HPO42.42 g/L，此時韋蘭膠產(chǎn)率最高預測值為24.99 g/L。

圖6　葡萄糖、豆粕粉、K2HPO4質(zhì)量濃度交互作用對產(chǎn)膠率影響的響應曲面和等高線Fig．6 Response surface p lots and contour line of effects of interaction between glucose，soybean m eal pow der and K2HPO4concentration on welan gum yield

2.4證試驗

對上述的優(yōu)化條件進行3次驗證試驗，并根據(jù)實際情況，將配方調(diào)整為葡萄糖35.5 g/L，豆粕粉6.3 g/L，K2HPO42.4 g/L，最終韋蘭膠產(chǎn)膠率為24.87 g/L，較優(yōu)化前的產(chǎn)膠率17.60 g/L提高了41%，預測值與實際值實際偏差為0.48%，兩者具有很好擬合性，通過本研究韋蘭膠得率有了明顯的提高，因此利用響應面法尋求韋蘭膠最佳培養(yǎng)基的方法是可行的。

3　結(jié)論

通過對韋蘭膠發(fā)酵培養(yǎng)基進行響應面優(yōu)化研究，最終確定最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為葡萄糖35.5 g/L，豆粕粉6.3 g/L，K2HPO42.4 g/L，韋蘭膠的產(chǎn)率達24.87 g/L，較優(yōu)化前的產(chǎn)膠率17.60 g/L提高了41%，優(yōu)化效果明顯，試驗方案設計合理。

［1］陳芳，李建科，徐昶.新型微生物多糖-韋蘭膠的流變特性影響因素研究［J］.食品科學，2007，28（9）：49-52.

［2］TAKOM，KIRIAKIM.Rheologieal properitiesofwelan gum in aqueous media［J］.J Biol Chem，1990，54（12）:3079-3084.

［3］KANG K S，WEEDER G T.Heteropolysaccharide S-130.United States Patent，4342866［P］.1981.

［4］FIALHOM A，MOREIRA M L，POPESCU O A.Occurrence，production，and applications of gellan:current state and perspectives［J］.Appl M icrobiol Biotechnol，2008，79（6）:889-900.

［5］LIH，XU H，XU H，et al.Enhanced welan gum production using a two-stage agitation speed control strategy in A lcaligenes sp.CGMCC 2428［J］.Biop roc Biosyst Eng，2010，33（8）:1-8.

［6］JANSSON PE，W IDMALM G.W elan gum（S-130）contains repeating unitsw ith random ly distributed l-mannosyland l-rhamnosyl terminalgroups，asdeterm ined by FABMS［J］.Carbohyd Res，1994，256（2）:327-330.

［7］O'NEILLM A，SELVENDRANRR，MORRISV J，etal.Structure of the extracellular polysaccharide produced by the bacterium Alcaligenes（ATCC 31555）species［J］.Carbohyd r Res，1986，147（2）:295-313.

［8］XUHM，ZHAO L，WUH，etal.Experimental research on thenew foam drilling fluid system［J］.Adv M ater Res，2013，2857:781-784.

［9］PRAJAPATIV D，JANIG K，ZALA B S，et al.An insight into the emerging exopolysaccharide gellan gum asa novel polymer［J］.Carbohydr Polym，2013，92（2）:670-678.

［10］李莎，徐虹，石寧寧.微生物聚多糖PS-238合成條件的研究［J］.食品與發(fā)酵工藝，2004，30（12）：6-9.

［11］李莎，徐虹，姜岷.產(chǎn)堿桿菌NX-3胞外多糖的結(jié)構與性能［J］.微生物學通報，2005，32（6）：37-41.

［12］郭朝江，喬紅群，李莎，等.低能N+注入誘變選育威蘭膠高產(chǎn)菌的研究［J］.輻射研究與輻射工藝學報，2007，25（5）：266-269.

［13］郭建軍，李建科，陳芳，等.黃原膠和韋蘭膠混凝黏度的影響因素研究［J］.食品科學，2007，28（10）：96-98.

［14］郭建軍，李建科，陳芳，等.韋蘭膠的特性、生產(chǎn)和應用研究進展［J］.中國食品添加劑，2008（2）：87-91.

［15］郭建軍，李建科，陳琳，等.韋蘭膠生產(chǎn)菌的選育［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（2）：126-128.

［16］蔣蕓，詹曉北，李艷，等.Brookfield黏度計測定微生物多糖發(fā)酵液流體特性參數(shù)［J］.食品與生物技術學報，2008，27（5）：73-77.

［17］賈微，鄭志永，劉汝冰，等.一種新型微生物多糖流變學初探［J］.食品科學，2009，30（1）：135-138.

［18］AMBAT P，AYYANNA C.Optimizing medium constituents and fermentation conditions forcitric acid production from palmyrajaggery using response surfacemethod［J］.Wor ld JM icrob Biot，2001，17（4）: 331-335.

Optimization of fermentation medium for welan gum production by Sphingomonas sp.

LIU Yuantao1，3，DONG Xueqian2*，WANGWei2，ZHANG Yonggang2，JIWuke2
（1.School ofBio-engineering，Qilu University of Techno logy，Jinan 250300，China；2.Shandong Food Ferment Industry Research&Design Institute，Jinan 250013，China；3.Shandong FufengGroup Co.，Ltd.，Junan 276600，China）

Welan gum isa kind of soluble exopolysaccharide secreted by Sphingomonas sp.In this paper，using the gum production rate of gum-producing strain Sphingomonas sp.511 asevaluation index，on the basisof single factor experiment，the optimal levelsof significant factorswere determ ined by the steepestascentexperiment，and then the gum fermentationmedium composition were optim ized by response surfacemethodology.Results showed that the optimal fermentationmedium wasglucose 35.5 g/L，soybeanmeal powder 6.3 g/L，K2HPO42.4 g/L，under this condition，the yield ofwelan gum reached 24.87 g/L.

welan gum；Sphingomonas sp；response surfacemethodology

Q 93-335

0254-5071（2016）01-0073-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．016

2015-11-28

劉元濤（1976-），男，高級工程師，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵工程。

董學前（1978-），男，高級工程師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵工程。