鹽酸法舒地爾對(duì)大鼠主動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜及IL-8、TGF-β1的影響

周中興，潘娜娜，譚麗娟（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院黃島院區(qū)心內(nèi)科，山東 青島 266003）

鹽酸法舒地爾對(duì)大鼠主動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜及IL-8、TGF-β1的影響

周中興，潘娜娜，譚麗娟
（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院黃島院區(qū)心內(nèi)科，山東 青島 266003）

目的 探討鹽酸法舒地對(duì)大鼠主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后血管內(nèi)膜增生的影響，并測(cè)定血清中IL-8、TGF-β1濃度及TGF-β1在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的表達(dá)情況。方法 選取SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組8只、手術(shù)組16只、藥物組16只，手術(shù)組和藥物組給予左頸動(dòng)脈切口，并2 F球囊導(dǎo)管插管行主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，手術(shù)組給予NS（0.5 ml/100 g/bid），藥物組給予鹽酸法舒地（0.5 mg/100 g/bid）腹腔注射，分別于損傷后14天、28天取大鼠主動(dòng)脈血管標(biāo)本，HE染色觀察各組增殖血管內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化，并測(cè)量新生內(nèi)膜面積（IA）、中膜面積（MA）、內(nèi)膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）、內(nèi)膜面積/中膜面積比值（IA/MA），觀察大鼠血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生情況。并用ELISA法檢測(cè)血清中IL-8、TGF-β1的濃度，并免疫組化檢測(cè)TGF-β1在損傷后血管新生內(nèi)膜及中膜的表達(dá)情況。結(jié)果 對(duì)照組血管內(nèi)膜為扁平的內(nèi)皮細(xì)胞，中層為梭形平滑肌細(xì)胞的排列，內(nèi)膜光滑，未見平滑肌細(xì)胞增生及增殖情況。手術(shù)組球囊損傷后14天內(nèi)膜增生明顯，其IA、MA、IT、MT、IA/MA顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），至28天內(nèi)膜繼續(xù)增生。藥物組在14天內(nèi)膜增生明顯，內(nèi)膜及中膜面積及厚度的測(cè)量值顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。28天后藥物組內(nèi)膜增厚較14天時(shí)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。至14天時(shí)兩損傷組IL-8、TGF-β1在血漿中檢測(cè)出，而藥物組14天時(shí)血漿中可檢測(cè)到IL-8、TGF-β1相比手術(shù)組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），至28天時(shí)手術(shù)組仍可檢測(cè)到IL-8、TGF-β1較14天時(shí)減少。至28天藥物組上述血清中的濃度較14天時(shí)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與手術(shù)組相比減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。并14天時(shí)藥物組TGF-β1在新生內(nèi)膜及中膜可見表達(dá)，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而28天時(shí)表達(dá)量相比模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 鹽酸法舒地可有效抑制大鼠主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后主動(dòng)脈內(nèi)膜的增生及增殖，從而減少管腔面積的丟失，可能與其抑制早期炎癥因子IL-8及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)有關(guān)。

鹽酸法舒地；球囊損傷；動(dòng)脈內(nèi)膜；IL-8；TGF-β1

隨著經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)的廣泛開展，不僅降低了冠心病，特別是急性心肌梗死患者的近期死亡率，而且改善了長(zhǎng)期預(yù)后。而術(shù)后再狹窄的發(fā)生率嚴(yán)重影響了其遠(yuǎn)期療效，多數(shù)研究認(rèn)為術(shù)后的炎癥反應(yīng)及中膜平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖不僅參與了早期血栓事件的發(fā)生，更是參與了后期血管病理性重構(gòu)和慢性縮窄的過程［1］。雖然冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)可以抑制動(dòng)脈血管的彈性回縮，改善血管壁的重塑，從而使再狹窄率降低，但另一方面它卻有增加血管壁損傷和血栓形成的危險(xiǎn)，尤其是血管內(nèi)皮的損傷進(jìn)一步加重了炎癥反應(yīng)，纖維層的斷裂導(dǎo)致血管壁中層平滑肌細(xì)胞過度增殖并向內(nèi)膜遷移，血管新生內(nèi)膜形成導(dǎo)致再狹窄。因此早期抑制炎癥反應(yīng)及中膜的病理性重構(gòu)、重塑過程成為預(yù)防術(shù)后再狹窄的有效措施。IL-8是早期炎癥反應(yīng)所釋放的重要因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1是一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、免疫的TGF-β超家族，是多種細(xì)胞損傷后早期表型轉(zhuǎn)化及增殖的始動(dòng)因子。Rho激酶為Rho蛋白下游作用底物，主要發(fā)揮信息傳導(dǎo)和分子開關(guān)作用。最早應(yīng)用于蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的腦血管痙攣，改善局部腦動(dòng)脈循環(huán)的功能，而其在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用得到廣泛證實(shí)，特別是在冠狀動(dòng)脈痙攣、心肌梗死、再狹窄、心力衰竭方面［2］。本文通過鹽酸法舒地尓對(duì)于大鼠主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后主動(dòng)脈內(nèi)膜增殖及對(duì)IL-8、TGF-β1表達(dá)的影響，旨在探討法舒地尓防治血管再狹窄的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（400±50）g購自青島市動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。鹽酸法舒地尓（天津紅日制藥，30 mg/2 mL）；2.0 F自制球囊導(dǎo)管；高清彩色像分析系統(tǒng)（HPIA2000）（美國(guó)Beckman Coulter公司）；表達(dá)的免疫組化染色檢測(cè)試劑盒（北京碧云天生物有限公司）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

40只SD大鼠分為3組：正常對(duì)照組（n=8）；手術(shù)組（主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)+腹腔注射NS 0.5 ml/100 g/Bid，n=16）；法舒地尓組（HF球囊損傷+腹腔注射鹽酸法舒地尓0.5 mg/100 g/Bid，n=16）。

1.2.2大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型的建立

將大鼠用將大鼠以3%的水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，做頸部長(zhǎng)約2 cm正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端用絲線結(jié)扎，近心端用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉，在兩端間剪一小口，從切口向近心端緩慢插入球囊導(dǎo)管（2 F，球囊長(zhǎng)度2 cm），深度約10～12 cm至髂動(dòng)脈分叉處，以0.15～0.2 mL生理鹽水充盈球囊，回拉球囊并旋轉(zhuǎn)導(dǎo)管至左頸總動(dòng)脈分叉處，反復(fù)抽拉6次以確保充分剝脫內(nèi)皮，拔出球囊導(dǎo)管，結(jié)扎血管，逐層縫合切口，術(shù)后3天給予青霉素20萬IU/100 g腹腔注射，并常規(guī)飼養(yǎng)至處死，采用HE免疫組化染色，光鏡觀察球囊損傷大鼠頸動(dòng)脈使動(dòng)脈血管內(nèi)膜剝脫，判斷模型建立成功。

1.2.3增殖血管內(nèi)膜面積測(cè)定

分別于球囊損傷后14天、28天取對(duì)照組4只及損傷組各6只大鼠腹腔注射過量的水合氯醛，左側(cè)腹部切口5～7 cm，鈍性分離并游離主動(dòng)脈，腎動(dòng)脈分叉處逆行分離至主動(dòng)脈根部，插管用生理鹽水灌洗胸腹主動(dòng)脈。留取主動(dòng)脈標(biāo)本組織2 cm左右，用4%中性多聚甲醛溶液固定24 h的主動(dòng)脈組織標(biāo)本，常規(guī)按石蠟切片制作程序（固定、脫水、透明及包埋處理），然后切片脫蠟后，進(jìn)行HE染色。隨機(jī)選取5個(gè)視野，光鏡下觀察新生內(nèi)膜增生情況，圖像分析系統(tǒng)測(cè)定IA、MA、MA、IT、IA/MA。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清IL-8、TGF-β1濃度

分別于術(shù)后14天、28天，制取主動(dòng)脈組織前，大鼠摘除眼球取血（采集前動(dòng)物禁飲食8 h），送本院檢驗(yàn)科，ELISA法測(cè)定血漿中IL-8、TGF-β1的濃度，具體操作步驟按照ELISA檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1主動(dòng)脈標(biāo)本組織病理學(xué)形態(tài)及定量分析

手術(shù)組及藥物組（HF）在術(shù)中及術(shù)后有2只大鼠死亡，考慮與術(shù)中動(dòng)脈夾層、麻醉藥過量及術(shù)后長(zhǎng)期腹腔注射，大鼠長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致進(jìn)食減少引起。各組主動(dòng)脈標(biāo)本組織病理學(xué)見圖1、圖2、圖3。14天后手術(shù)組及HF組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增生明顯，其IA、MA、MA、IT、IA/MA相比于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。手術(shù)組與HF組之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。至28天時(shí)手術(shù)組內(nèi)膜繼續(xù)增生，藥物組IA、MA、MA、IT、IA/MA指標(biāo)的改善相比14天時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

14天后血清中IL-8、TGF-β1在手術(shù)組及HF組可檢測(cè)出。IL-8在HF組血漿中少于手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。至28天血清中IL-8在HF組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TGF-β1在手術(shù)組仍持續(xù)檢測(cè)出，見表2。

圖1　內(nèi)膜HF染色×100倍

圖2　內(nèi)膜HF染色×100倍

圖3　內(nèi)膜HF染色×400倍

表1　各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增生情況定量分析（±s，mm/mm）

表1　各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增生情況定量分析（±s，mm/mm）

注：*與對(duì)照組相比，P＜0.05；#與手術(shù)組相比，P＜0.05；θ與對(duì)照組相比，P＞0.05

對(duì)照組　　手術(shù)組　HF組14 d　28 d　14 d　28 d　14 d　28 d （IA）　0.96±0.12　0.99±0.10　2.41±1.21*　4.32±1.15**　2.23±0.77*#　1.25±0.46αβ（MA）　2.53±0.54　2.61±0.34　4.12±1.02*　6.18±1.42**　3.71±1.12*#　3.55±1.04αβ（MT）　1.43±0.14　1.41±0.23　1.98±1.33*　2.26±0.57**　1.76±0.57*#　1.59±0.23αβ（IT）　0.45±0.07　0.53±0.10　1.23±1.42*　1.56±0.38**　1.16±0.26*#　0.64±0.12αβ（IA/MA）　36.97±4.06　34.38±3.76　58.49±5.18*　69.90±3.13**　60.10±2.08**　35.21±3.53αβ注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與手術(shù)組相比，#P＞0.05；與手術(shù)組相比，αP＜0.01；與14天相比，βP＜0.05 表2 IL-8、TGF-β1在三組動(dòng)物血漿中濃度的定量檢測(cè)（x±s）對(duì)照組　　手術(shù)組　HF組14 d　28 d　14 d　28 d　14 d　28 d IL-8（μg/L）　63.24±8.25　58.91±11.17　135.87±22.25*　149.28±28.61*　127.33±19.32*　70.59±9.24#θ TGF-β1（ng/L）　12.03±2.63　13.84±2.95　18.48±4.67*　21.62±5.33*　17.66±5.66*　13.14±3.11#θ

3　討 論

彌漫性的血管內(nèi)皮功能障礙參與了冠心病的發(fā)生、發(fā)展的全過程［3］，特別對(duì)于急性冠脈綜合癥（acute coronary syndrome ACS）。PTCA及支架植入術(shù)雖可迅速改善患者的冠狀動(dòng)脈血供，緩解癥狀，但術(shù)后誘發(fā)的血管壁損傷和炎癥反應(yīng)［4］，將加速病變的進(jìn)展。目前認(rèn)為冠狀動(dòng)脈支架置入對(duì)動(dòng)脈壁損傷導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血小板聚集，促進(jìn)炎癥的發(fā)生，加重了病變部位的內(nèi)皮功能損害。炎性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞及血小板又可釋放大量的細(xì)胞因子促使血管平滑肌增殖和遷移，影響患者遠(yuǎn)期預(yù)后［5］。本實(shí)驗(yàn)中球囊損傷術(shù)后14天主動(dòng)脈內(nèi)膜鏡下面積、中膜面積、內(nèi)膜厚度、中膜厚度、內(nèi)膜面積/中膜面積相比對(duì)照組增加顯著，從而導(dǎo)致管腔面積的早期丟失。至28天時(shí)鏡下觀察到手術(shù)組內(nèi)膜面積持續(xù)丟失，病理性重塑機(jī)制導(dǎo)致管腔進(jìn)一步狹窄，與既往研究一致。

Rho激酶是最早發(fā)現(xiàn)、也是目前研究較為清楚的一個(gè)小G蛋白R(shí)hoA的下游效應(yīng)器。以兩種同源性極高的異構(gòu)體存在：ROCKI（ROCKα炎癥反應(yīng)過程）和ROCKII（ROCKβ血管平滑肌細(xì)胞）。ROCK的激活可在分子及細(xì)胞水平參與血管損傷后的炎癥反應(yīng)及內(nèi)膜的增生、增殖過程。ROCK的激活可使一氧化氮合酶的表達(dá)下調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞來源的NO在調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板聚集、平滑肌細(xì)胞增殖和防止白細(xì)胞向血管壁的粘附等過程中發(fā)揮重要作用。法舒地爾（fasudil，F(xiàn)as）是第一個(gè)也是惟一應(yīng)用于臨床的Rho激酶抑制劑，主要用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血所致的腦血管痙攣及相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)缺血癥狀。在許多已開展的臨床前期研究中，發(fā)現(xiàn)法舒地爾對(duì)包括冠狀動(dòng)脈痙攣、高血壓、肺動(dòng)脈高壓、冠脈再通手術(shù)后的再狹窄和AS在內(nèi)的多種心血管疾病均有良好的治療作用和較高的安全性。研究證實(shí)，IL-8在心血管介入手術(shù)后無菌性炎癥反應(yīng)中參與了眾多細(xì)胞因子的激活及趨化，是冠脈介入術(shù)后心臟事件強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子［6］。本研究表明大鼠主動(dòng)脈球囊損傷后血清中早期炎癥反應(yīng)的發(fā)生，并測(cè)得早期應(yīng)用法舒地尓可有效抑制早期炎癥反應(yīng)的程度，減輕血管內(nèi)膜內(nèi)皮的損傷，并進(jìn)一步抑制后續(xù)炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，可能是其預(yù)防術(shù)后急性血栓事件及再狹窄的機(jī)制之一。

綜上所述，鹽酸法舒地尓（hydroxy fasudil HF）可有效抑制主動(dòng)脈損傷術(shù)后管腔面積的丟失，預(yù)防術(shù)后再狹窄的發(fā)生［7］，而抑制早期炎癥因子IL-8及TGF-β1的產(chǎn)生與表達(dá)可能是其機(jī)制之一。究其分子機(jī)制及長(zhǎng)期用藥效果還有待進(jìn)一步研究，但可為冠脈介入治療術(shù)后再狹窄的防治提供新的依據(jù)，使鹽酸法舒地尓的臨床應(yīng)用范圍更加廣泛。

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本文編輯：孫春宇

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ISSN.2095-6681.2016.08.078.04