野菊花不同炮制品提取物抑菌效果比較研究

譚文影　李鐘　張維維　李蕾　韓彬

野菊花不同炮制品提取物抑菌效果比較研究

譚文影李鐘張維維李蕾韓彬

目的：比較野菊花鮮品與蒸制品的提取物對(duì)4種細(xì)菌抑菌作用的差異。方法：采用紙片法、稀釋法以及空間抑菌法等進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。采用電導(dǎo)率法測定各樣品對(duì)細(xì)菌電導(dǎo)率改變的差異。結(jié)果：各提取物對(duì)受試的4種菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，鮮品醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最優(yōu)，抑菌直徑在11mm以上，最小抑菌濃度為0.125g/ml；鮮品揮發(fā)油對(duì)鏈球菌以及痢疾桿菌抑菌效果最優(yōu)，抑菌直徑11mm以上，最小抑菌濃度均為0.25%；空間抑菌法最優(yōu)的是野菊花鮮品醇提物，殺菌率為91.41%。各提取物對(duì)上述細(xì)菌的培養(yǎng)基電導(dǎo)率均有影響，效果最優(yōu)的是鮮品醇提物作用于痢疾桿菌5h，電導(dǎo)率增加18.2%（P＜0.05）。結(jié)論：不同炮制加工方法對(duì)野菊花的抑菌活性有影響，鮮品的炮制方法優(yōu)于蒸制品。

野菊花；不同炮制方法；抑菌活性

藥用野菊花為菊科植物野菊（Dendranthema indicum）的干燥頭狀花序，具清熱解毒，疏散風(fēng)熱之功效［1］，常用于感冒、目赤、痢疾、癰腫疔瘡的治療，其抗菌成分主要為黃酮類物質(zhì)、揮發(fā)油以及有機(jī)酸?；愔兴幍纳珴珊蜌馕妒苋展庹丈浜笠鬃兩冑|(zhì)，特別需要選擇合適的加工方法［2-5］。我國野菊花分布廣泛，加工炮制方法多樣化，為防止花瓣散瓣和便于貯存等原因，常采用蒸法，而各地不同加工方法造成野菊花的質(zhì)量參差不齊。本實(shí)驗(yàn)以廣州番禺區(qū)的野菊花鮮品與蒸制品為目標(biāo)，通過對(duì)抑制細(xì)菌的活性差異來比較不同的炮制方法，為野菊花的資源利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為花類中藥的炮制加工提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與材料FA2204B型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HHS-4S電子恒溫不銹鋼水浴鍋（余姚市上通溫控儀表廠）；TDL80-2B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-1F超凈工作平臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器（廣州飛迪生物科技有限公司）；DDS-304電導(dǎo)率儀（上海雷磁儀器廠），康柏力熏蒸儀（中山康柏力）。鮮野菊花（采摘于廣東廣州番禺區(qū)，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥資源系李鐘副教授鑒定為菊科的野菊花Dendranthema indicum）、蒸制野菊花（市售）。

1.2供試菌種本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)菌4株，由廣東藥學(xué)院微生物教研室提供。大腸桿菌（Escherichia Coli）、痢疾桿菌（Shigella Castellani）、鏈球菌（Streptococcus）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）。

1.3培養(yǎng)基本實(shí)驗(yàn)采用固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基。供細(xì)菌實(shí)驗(yàn)用固體培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，配方為牛肉膏粉3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15g、蒸餾水1000ml。液體培養(yǎng)基為LB肉湯培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g、氯化鈉5g、葡萄糖1g、酵母膏粉5g、蒸餾水1000ml。

1.4方法

1.4.1供試樣品制備。精密稱定鮮野菊花、蒸制野菊花各45g于圓底燒瓶中，各加入10倍量的75%乙醇，浸泡30min，于70℃下水浴回流2h，濾過，殘?jiān)偌尤?0倍量的75%乙醇回流1h，合并濾液，減壓濃縮至無醇味待用。用相同體積的75%乙醇濃縮至無乙醇味的溶液作為抑菌試驗(yàn)空白對(duì)照。精密稱定鮮品、蒸制品各200g于圓底燒瓶中，各加入10倍量的水，浸泡30min。水蒸氣蒸餾法提取并收集揮發(fā)油。取上述揮發(fā)油各100ul溶于1ml的無水乙醇中配成10%的揮發(fā)油溶液待用。用相同體積的無水乙醇作為抑菌試驗(yàn)的空白對(duì)照。

1.4.2菌懸液的制備。將凍干菌種培育三代后調(diào)菌濃度至1.0×106-5.0×106cfu/ml待用。

1.4.3抑菌活性測定。將直徑6mm的圓濾紙片放入各樣品溶液中浸泡20min后取出，在無菌條件下晾干。將培養(yǎng)基倒入各平板中，每個(gè)平板約15ml，水平放置冷卻后待用。將已制備好的各菌懸液用移液槍吸取0.1ml，分別注入相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，用已滅菌的涂布棒將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面。用無菌鑷子夾取上述晾干的含藥濾紙片對(duì)號(hào)貼在含菌培養(yǎng)基表面，呈正三角分布，每菌每液做3個(gè)平行樣，并做相應(yīng)的空白對(duì)照。把做好的平皿放入培養(yǎng)箱中，細(xì)菌37℃下培養(yǎng)24h取出，測定抑菌圈直徑，以產(chǎn)生抑菌圈的最小濃度為最低抑菌濃度［6］。

1.4.4最低抑菌濃度（MIC）的測定。用二倍稀釋法將上述各樣品分別稀釋至10管，濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781、0.39、0.195、0.0975mg/L。（原生藥濃度）共10管濃度溶液。揮發(fā)油樣品配制方法同上。然后向各濃度提取物肉湯中加入試驗(yàn)菌懸液并混勻，于37℃培養(yǎng)24h，以無菌生長的最低稀釋度為提取物的最低抑菌濃度。

1.4.5空氣抑菌試驗(yàn)法。采取平板沉降法進(jìn)行空氣抑菌試驗(yàn)。將上述醇提物（未濃縮）稀釋至含醇量20%待用。選取10m3的房間，將上述醇提物放入蒸發(fā)儀中在40℃下熏蒸1h，分別于使用前和使用后在采樣區(qū)放置平板，采樣點(diǎn)選擇實(shí)驗(yàn)空間四角和中央，平板在空氣中暴露15min后密封，置于（36±1）℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，記錄每個(gè)平板的菌落數(shù)。同理選取10m3的房間，內(nèi)置100g粉碎的鮮野菊花或蒸制野菊花6h，讓揮發(fā)油散開，采樣方法同上。

1.4.6野菊花鮮品、蒸制品提取物對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)基電導(dǎo)率的影響。取上述最低抑菌濃度的各樣品液2ml加入等量肉湯中搖勻（每樣品液制備12管，每組6管，設(shè)平行對(duì)照組），無菌條件下加入上述各菌液30μl于37℃下培養(yǎng)，并于0h、1h、2h、3h、4h、5h下離心（5000r/min，6min）取上清液測其電導(dǎo)率，設(shè)空白對(duì)照組。

2　結(jié)果

2.1野菊花鮮品、蒸制品提取物抑菌活性測定結(jié)果

由表1可知，野菊花各提取物對(duì)供試菌種都有不同程度的抑制作用，其中鮮品揮發(fā)油、蒸制品揮發(fā)油對(duì)鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑制作用，其抑菌圈直徑達(dá)11mm以上，對(duì)大腸桿菌以及痢疾桿菌的抑制效果次之，其抑菌圈直徑為9mm左右，醇提物的抑制效果相對(duì)較差。鮮品醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑制作用，其抑菌圈直徑達(dá)9mm以上。

表1　野菊花各提取物抑菌圈直徑

2.2野菊花鮮品、蒸制品提取物最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各揮發(fā)油提取物對(duì)大腸桿菌、鏈球菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌的生長均有良好的抑制作用，0.5g/ml生藥濃度下的鮮品醇提物與蒸制品醇提物對(duì)大腸桿菌均無抑制作用，對(duì)其他細(xì)菌有一定的抑制作用。見表2。

表2　野菊花不同炮制品提取液最低抑菌濃度

2.3空氣抑菌試驗(yàn)法結(jié)果野菊花醇提物熏蒸消毒和揮發(fā)油散發(fā)消毒，對(duì)注射室內(nèi)空氣中自然菌均有不同程度的抑制作用。其中，鮮品醇提物抑制自然菌的效果最優(yōu)，殺菌率為91.41%。鮮品揮發(fā)油與蒸制品揮發(fā)油殺菌率差異不大。見表3。

表3　各提取物空間抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.4鮮品、蒸制品提取物對(duì)細(xì)菌電導(dǎo)率的改變鮮品提取物、蒸制品提取物作用于大腸桿菌、鏈球菌、痢疾桿菌以及金黃色葡萄球菌后培養(yǎng)液電導(dǎo)率的變化測定如圖1。胞外電導(dǎo)率的變化緣于菌體細(xì)胞膜通透性的改變引起了K+、Na+、Ca+等離子的外漏。各提取物作用于菌體初期時(shí)，上清液的電導(dǎo)率隨著時(shí)間的增大而增大。鮮品醇提物作用菌體5h后，大腸桿菌電導(dǎo)率為0.4450，鏈球菌電導(dǎo)率為0.3547，痢疾桿菌電導(dǎo)率為0.2440，金黃色葡萄球菌電導(dǎo)率為0.5410；蒸制品醇提物作用5h后，大腸桿菌電導(dǎo)率為0.4500，鏈球菌電導(dǎo)率為0.3510，痢疾桿菌電導(dǎo)率為0.2500，金黃色葡萄球菌電導(dǎo)率為0.5470；鮮品揮發(fā)油作用菌體5h后，大腸桿菌電導(dǎo)率為0.4570，鏈球菌電導(dǎo)率為0.3660，痢疾桿菌電導(dǎo)率為0.2530，金黃色葡萄球菌電導(dǎo)率為0.5540；蒸制品揮發(fā)油作用菌體5h后，大腸桿菌電導(dǎo)率為0.4640，鏈球菌電導(dǎo)率為0.3490，痢疾桿菌電導(dǎo)率為0.2599，金黃色葡萄球菌電導(dǎo)率為0.5510。上述數(shù)值與0h時(shí)相比，提示各提取物對(duì)上述細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性均有影響。加藥組電導(dǎo)率與對(duì)照組相比增加最為明顯的是鮮品醇提物作用于痢疾桿菌，電導(dǎo)率增加了18.2%（P＜0.05），其次為鮮品揮發(fā)油作用于鏈球菌，電導(dǎo)率增加為5.88%（P＜0.05）。

圖1　野菊花不同炮制品提取液對(duì)菌體細(xì)胞膜影響的分析

3　討論

中國藥典記載野菊花的炮制方法為曬干或蒸后曬干，大部分藥農(nóng)都會(huì)采用上述方法來加工野菊花。但蒸制過程中火候的大小與蒸制時(shí)間的長短均會(huì)影響野菊花的內(nèi)在質(zhì)量，市場上又缺乏嚴(yán)格的、可控的技術(shù)規(guī)范，也無科學(xué)、可行的工藝操作SOP，藥農(nóng)僅憑經(jīng)驗(yàn)而無客觀標(biāo)準(zhǔn)［7-9］，因此，市場上的野菊花質(zhì)量良莠不齊。在炮制的過程中，抑菌的有效成分例如黃酮、綠原酸、揮發(fā)油以及苷類會(huì)發(fā)生一定的變化，這種變化在其抑菌活性水平上有一定的體現(xiàn)［10，11］。本實(shí)驗(yàn)從抑菌活性、最低抑菌濃度、空間抑菌活性等四個(gè)方面對(duì)比了野菊花鮮品和蒸制品之間的抑菌差異，大體上顯示鮮品醇提物、揮發(fā)油的抑菌活性優(yōu)于蒸制品，提示鮮品藥用效果優(yōu)于蒸制品，但是鮮品不利于貯存和運(yùn)輸，期望有更科學(xué)可控的野菊花加工炮制方法。

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Antibacterial activity of different processed products of Dendranthema indicum

Tan Wenying，Li Zhong，Zhang Weiwei，Li Lei，Han Bin.College of Traditional Chinese Medicine of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China Corresponding author：Han Bin，E-mail：hb1299cn.com

Objective：To evaluate the different antibacterial activity between fresh and the streamed Dendranthema indicum extracts against four bacterias.Methods：The antibacterial activity of the extracts againsted bacterias was identified by disk diffusion，slips method and antibacterial test on the space in vitro.Used the conductivity meter to measure the values in different time periods.Results：The extracts showed a certain antibacterial activity.Fresh Dendranthema indicum ethanol extract showed a best antibacterial activity on Staphyloccocus aureus Rosenbach and its mic was 0.125g/ml，the antibacterial circle was above 11mm；Fresh Dendranthema indicum oil showed a better effect on Streptococcus and Shigella Castellani，the mic of them were 0.25%，the antibacterial circle was above 11mm；All extracts could damge bacterial membrane，but the fresh Dendranthema indicum ethanol extract was the better against Shigella Castellani，for its conductivity was increased by 18.2%（P＜0.05）.Conclusion：Differet products have a effect on its antibacterial activity，the processing technology of the fresh product is better than the streamed.

Dendranthema indicum；different processing technology；antibacterial mechanism

A

1004-2725（2016）01-0001-04

510006廣東 廣州，廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院

韓彬，E-mail：hblz99@21cn.com