抗單增李斯特菌枯草芽孢桿菌C3增菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

劉寬博，熊利霞*，劉　慧，張紅星（.北京農學院 食品科學與工程學院，微生態(tài)制劑關鍵技術開發(fā)北京市工程實驗室，食品質量與安全北京實驗室，北京 02206；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

抗單增李斯特菌枯草芽孢桿菌C3增菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

劉寬博1，2，熊利霞1*，劉慧1，張紅星1
（1.北京農學院 食品科學與工程學院，微生態(tài)制劑關鍵技術開發(fā)北京市工程實驗室，食品質量與安全北京實驗室，北京 102206；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

枯草芽孢桿菌對單增李斯特菌有強烈抑制作用，該文對其增菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，為今后將其應用于食品和飼料奠定基礎。在對培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進行單因素試驗的基礎上，設計5因素4水平正交試驗對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化。結果表明，培養(yǎng)基成分優(yōu)化為葡萄糖1.0%，酵母浸粉1.0%，NaCl 0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，培養(yǎng)條件優(yōu)化為pH5.4，裝液量50 mL/250 mL，接種量3%，溫度37℃，150 r/min培養(yǎng)14 h，在此條件下，活菌數可達到7.1×1010CFU/mL，比優(yōu)化前提高了7.89倍。

枯草芽孢桿菌C3；李斯特菌；增菌培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件；優(yōu)化

單核細胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）簡稱單增李斯特菌，被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）列為第四大重要的食源性致病菌［1］，廣泛分布于自然界，可污染多種食品（如生家禽、家畜肉、海產品和發(fā)酵香腸等［2］），可導致敗血癥、腦膜炎以及胃腸炎等［3］，該菌引起的死亡率達到20%～30%［4］，在歐美和日本等國家，單增李斯特菌造成的臨床疾病以及食物中毒超過以往占第一位的沙門氏菌。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種“公認安全（generally recognized as safe，GRAS）”的食品級有益微生物［5］，已經廣泛應用于防治植物病害、養(yǎng)殖業(yè)、環(huán)境修復、醫(yī)學方面等領域［6］，但在食品防腐保鮮方面研究報道較少。目前，關于細菌素的研究主要集中在乳酸菌上［7］，國內關于枯草芽孢桿菌對單核細胞增生性李斯特菌的抑菌研究報導較少，許紅巖等［8］從土壤分離的枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液可有效抑制單核細胞增生性李斯特菌。

傳統(tǒng)肉制品大多都通過人工合成的化學防腐劑來進行保鮮，具有一定的安全隱患，使用不當會有一定副效應，長期過量攝入會對消費者的身體健康造成一定損害，而且造成環(huán)境污染。因此，研發(fā)高效、安全、環(huán)境友好的天然肉制品防腐劑是農產品安全的迫切需要。細菌素是由某些細菌產生的一類抑菌物質，是由細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類多肽類物質［9］。在人體內可降解，具有高效、無抗藥性、無毒、無殘留等優(yōu)點，已成為天然食品生物防腐劑研究與開發(fā)的熱點［10-11］。

枯草芽孢桿菌C3產抗單增李斯特菌細菌素，理化性質穩(wěn)定，發(fā)酵液中的細菌素效價為640 AU/mL，在食品保藏方面具有一定的應用潛力。本研究旨在通過優(yōu)化該菌的增菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，使活菌數最大化，為今后該菌的進一步研究和開發(fā)應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

枯草芽孢桿菌C3：由食品質量與安全北京實驗室課題組篩選并保存，經微量生化反應與16s DNA方法鑒定為Bacillus subtilis。

1.1.2培養(yǎng)基

基礎活菌數液體培養(yǎng)基［12］：蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1.0%，pH自然，蒸餾水1 000 mL。

活菌平板計數培養(yǎng)基（plate count agar，PCA）［13］：胰蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.25%，葡萄糖0.1%，瓊脂1.5%，蒸餾水1 000 mL。

液體活菌數培養(yǎng)基［14］：葡萄糖1.0%，蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，pH自然，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3主要試劑

蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、七水合硫酸鎂、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀（均為純分析）：北京化工廠；乳糖、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、平板計數瓊脂：北京陸橋技術有限責任公司。

1.2儀器與設備

BS224S型精密電子天平：德國Sartorius集團；HS-3B型雷磁便攜式酸度計：上海雷磁儀器廠；MLS-3750型全自動高壓蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；WS-01恒溫恒濕培養(yǎng)箱：湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司；THZ-C空氣浴搖床：太倉市試驗設備廠。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)方法

菌種活化：將于-80℃冰箱保藏的枯草芽孢桿菌C3菌種取出，室溫解凍后用移液槍移取1 mL接種到裝有50 mL（接種量2%）枯草芽孢桿菌種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12 h后獲得一代枯草芽孢桿菌種子，再從一代枯草芽孢桿菌種子液中以同樣的條件活化后獲得二代枯草芽孢桿菌種子液，并鏡檢純度。

1.3.2枯草芽孢桿菌C3生長曲線的測定

在基礎活菌數液體培養(yǎng)基中，除培養(yǎng)時間外，其他培養(yǎng)條件同1.3.1，分別培養(yǎng)0、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h，每時間點設3瓶重復，以確定枯草芽孢桿菌C3的最佳培養(yǎng)時間。

1.3.3枯草芽孢桿菌C3培養(yǎng)條件優(yōu)化

初始pH的篩選：基礎活菌數液體培養(yǎng)基的成分不變，將pH分別調至自然（5.4）、6.5、7.0、7.5，培養(yǎng)條件同1.3.1，每個處理重復3次，用PCA培養(yǎng)基進行活菌計數，以活菌數為考察指標篩選最佳pH。

不同裝液量的篩選：在250 mL三角瓶中，基礎活菌數液體培養(yǎng)基的裝液量分別為40 mL、50 mL、60 mL、70 mL，除裝液量外，其他培養(yǎng)條件同1.3.1，每個處理重復3次，用PCA培養(yǎng)基進行活菌計數，以活菌數為考察指標篩選最佳裝液量。

不同接種量的篩選：在基礎活菌數液體培養(yǎng)基中，除接種量外，其他培養(yǎng)條件同1.3.1，接種量分別為1%、2%、3%、4%，每個處理重復3次，用PCA培養(yǎng)基進行活菌計數，以活菌數為考察指標篩選最佳接種量。

1.3.4枯草芽孢桿菌C3增菌培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

碳源對活菌數的影響：基礎活菌數液體培養(yǎng)基中，除葡萄糖外，其他成分和培養(yǎng)條件不變，分別添加1.0%麥芽糖、蔗糖、乳糖代替基礎活菌數液體培養(yǎng)基中的葡萄糖，每個處理重復3次，進行活菌計數，以活菌數為考察指標篩選最佳碳源。

氮源對活菌數的影響：基礎活菌數液體培養(yǎng)基中，除酵母浸粉外，其他成分和培養(yǎng)條件不變，分別添加0.5%蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨代替基礎活菌數液體培養(yǎng)基的酵母浸粉，每個處理重復3次，進行活菌計數，以活菌數為考察指標篩選最佳氮源。

無機鹽對活菌數的影響：基礎活菌數液體培養(yǎng)基中，除NaCl外，另添加KH2PO4作為調節(jié)因子［15］，其他成分和培養(yǎng)條件不變，分別添加0.5%CaCl2、KCl、MgSO4·7H2O代替基礎種子液培養(yǎng)基的NaCl，每個處理重復3次，進行活菌計數，以活菌數為考察指標篩選最佳無機鹽。

1.3.5枯草芽孢桿菌C3增菌培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，根據參考文獻［16-19］將葡萄糖、酵母浸粉及NaCl、MgSO4·7H2O和KH2PO4調至不同含量進行5因素4水平正交試驗，以活菌數為考察指標，研究碳源、氮源及無機鹽的含量對枯草芽孢桿菌C3活菌數的影響，正交試驗設計的因素和水平見表1。

表1　培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for proliferation medium composition optimization %

1.3.6測定方法

活菌數的測定：參照GB 4789.2—2010《菌落總數測定》方法進行。

2　結果與分析

2.1枯草芽孢桿菌C3生長曲線

圖1　枯草芽孢桿菌C3的生長曲線Fig.1 Growth curve ofB.subtilis C3

枯草芽孢桿菌C3的生長曲線（圖1），枯草芽孢桿菌C3經過2 h的延緩期后進入對數生長期，在14 h時活菌數到達最大，為2.3×109CFU/mL，然后呈下降趨勢，在20 h時枯草芽孢桿菌C3的活菌數降至7.3×108CFU/mL，故確定枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)時間為14 h。

2.2枯草芽孢桿菌C3培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化

2.2.1初始pH對活菌數的影響

圖2　初始pH對活菌數的影響Fig.2 Effects of different initial pH on viable cell ofB.subtilisC3

不同初始pH對活菌數的影響結果（圖2），初始pH為自然（5.4）、6.5、7.0、7.5時的活菌數分別為3.25×109CFU/mL、8.0×108CFU/mL、1.4×109CFU/mL、2.2×109CFU/mL，當初始pH值為自然時活菌數最高，故確定活菌數培養(yǎng)基的較優(yōu)初始pH為自然。

本研究中，當pH自然時為5.4左右，活菌數最高，這與FURZIKOVA T M等［16］的研究報告相駁，其指出pH7～9是枯草芽孢桿菌的最適酸堿環(huán)境，這說明枯草芽孢桿菌的菌株差異很大，本次試驗的枯草芽孢桿菌C3的生長pH比較特殊，這在今后的研究中應加以重視。

2.2.2裝液量對活菌數的影響

不同裝液量對活菌數的影響結果（圖3），在250 mL三角瓶中裝液量分別為40mL、50mL、60mL、70mL時，枯草芽孢桿菌C3活菌數分別為3.1×108CFU/mL、6.6×109CFU/mL、5.7×108CFU/mL、6.6×108CFU/mL，即裝液量為50mL/250mL時活菌數最高，達6.6×109CFU/mL，故確定活菌數培養(yǎng)基的裝液量為50 mL/250 mL。其原因可能是枯草芽孢桿菌為好氧菌，在接種量相同的條件下，單位體積內菌數多，氧氣消耗量也大，故裝液量過多，不利于該菌的生長代謝，最適裝液量為50 mL/250 mL。

圖3　裝液量對活菌數的影響Fig.3 Effects of different fluid volume on viable cell of B.subtilisC3

2.2.3接種量對活菌數的影響

圖4　接種量對活菌數的影響Fig.4 Effects of different inoculum on viable cell ofB.subtilisC3

不同接種量對活菌數的影響結果（圖4），接種量分別為1%、2%、3%、4%時，枯草芽孢桿菌C3活菌數分別為4.6×108CFU/mL、5.2×108CFU/mL、4.8×109CFU/mL、3.4×108CFU/mL，即接種量為3%時活菌數最高，達4.8×109CFU/mL，故確定活菌數培養(yǎng)基的接種量為3%。接種量過小，遲緩期長，生長相對緩慢，接種量太大，在固定的培養(yǎng)時間內，有可能已經進入衰亡期，故接種量應為3%。

2.3枯草芽孢桿菌C3增菌培養(yǎng)基單因素優(yōu)化試驗

2.3.1碳源對活菌數的影響

不同碳源對活菌數的影響（圖5）可知，當碳源分別為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖時，枯草芽孢桿菌C3活菌數分別為8.6×109CFU/mL、6.5×109CFU/mL、5.1×108CFU/mL、2.5×108CFU/mL，即碳源為1.0%葡萄糖時活菌數最高，故確定活菌數培養(yǎng)基的較優(yōu)碳源為葡萄糖。

圖5　碳源對活菌數的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on viable cell of B.subtilisC3

2.3.2氮源對活菌數的影響

圖6　氮源對活菌數的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on viable cell of B.subtilisC3

不同氮源對活菌數的影響（圖6）可知，當氮源分別為蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉時，枯草芽孢桿菌C3活菌數分別為3.7×108CFU/mL、3.1×108CFU/mL、4.7×108CFU/mL、2.7×109CFU/mL，即氮源為0.5%酵母浸粉時活菌數最高，故確定活菌數培養(yǎng)基的較優(yōu)氮源為酵母浸粉。酵母浸粉不但可以提供氮源，而且其營養(yǎng)豐富，還可為菌體生長提供維生素，利于菌體生長。

2.3.3無機鹽對活菌數的影響

圖7　無機鹽對活菌數的影響Fig.7 Effects of different inorganic salt on viable cell of B.subtilisC3

不同無機鹽對活菌數的影響（圖7）可知，無機鹽分別為0.5%NaCl、CaCl2、KCl、MgSO4·7H2O時，枯草芽孢桿菌C3活菌數分別為1.1×109CFU/mL、0.2×108CFU/mL、4.9×108CFU/mL、1.4×109CFU/mL，即無機鹽為0.5% MgSO4·7H2O時活菌數最高，無機鹽為NaCl時活菌數也較高，綜合考慮，確定活菌數培養(yǎng)基的較優(yōu)無機鹽為MgSO4·7H2O、NaCl，另添加KH2PO4作為調節(jié)因子。

2.4枯草芽孢桿菌C3增菌培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

營養(yǎng)成分對枯草芽孢桿菌C3活菌數影響優(yōu)化正交試驗結果見表2。

表2　培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for proliferation medium composition optimziation

從表2直觀分析通過可以看出，5個因素對活菌數的影響由大到小依次是RA＞RC＞RB＞RE＞RD，即葡萄糖＞NaCl＞酵母浸粉＞MgSO4·7H2O＞KH2PO4，得到的最佳組合是A2B2C1D4E4，即葡萄糖1.0%，酵母浸粉1.0%，NaCl 0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%。由于最佳組合不在試驗的16組數據中，故需要對最佳組合進行驗證試驗。

在正交試驗最優(yōu)組合條件下，其活菌數達7.1×1010CFU/mL，高于正交試驗的處理組6的活菌數6.7×1010CFU/mL，比優(yōu)化前活菌數提高了7.89倍。與閆沛迎等［17-19］的試驗結果相比也有較大提高。

3　結論

在單因素試驗基礎上，采用正交試驗考察了葡萄糖、酵母浸粉、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O對枯草芽孢桿菌C3活菌數的影響。結果表明，培養(yǎng)基最佳組合為葡萄糖1.0%，酵母浸粉1.0%，NaCl 0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%。培養(yǎng)條件為pH 5.4，裝液量50 mL/250 mL，接種量3%，溫度37℃，150 r/min培養(yǎng)14 h。在此條件下，活菌數達7.1×1010CFU/mL，比優(yōu)化前活菌數提高了7.89倍。

［1］石磊，王文燕，閆鶴.豬肉中單核細胞增生李斯特菌的分離與耐藥性研究［J］.現代食品科技，2013，29（12）：2826-2829，2908.

［2］SWAMINATHAN B，GERNER-SMIDT P.The epidemiology of human listeriosis［J］.Microbes Infect，2007，9（10）∶1236-1243.

［3］MARC L，PASCALE C.Genetically-modified-animal models for human infections∶theListeria paradigm［J］.Trends Mol Med，2002，8（11）∶537-542.

［4］ARSLAN S，OZDEMIR F.Prevalence and antimicrobial resistance of Listeriaspp.in homemade white cheese［J］.Food Control，2008，19（4）∶360-363.

［5］南慶賢，戴瑞彤.中國肉制品微生物安全問題［J］.肉類研究，2004（4）：33-35.

［6］黃曦，許蘭蘭，黃榮韶，等.枯草芽孢桿菌在抑制植物病原菌中的研究進展［J］.生物技術通報，2010（1）：24-28.

［7］DRIDER D，FIMLAND G，HECHARD Y，et al.The continuding story of classⅡa bacteriocins［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2006，70（2）∶564-582.

［8］許紅巖，段效輝，李小清.單核細胞增生李斯特氏菌拮抗菌的分離鑒定及其抑菌活性［J］.食品科學，2013，34（15）：181-185.

［9］KOUMOUTSI A，CHEN X H，HENNE A，et al.Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides inBacillus amyloliquefaciensstrains FZB42［J］. J Bacteriol，2004，186（4）∶1084-1096.

［10］CLEVELAND J，MONTVILLE T J，NES I F，et al.Bacteriocins∶safe，natural antimicrobials for food preservation［J］.Int J Food Microbiol，2001，71（1）∶1-20.

［11］DEEGAN L H，COTTER P D，HILL C，et al.Bacteriocins∶Biological tools for biopreservation and shelf-life extension［J］.Int Dairy J，2006，16（9）∶1058-1071.

［12］甄靜，郭直岳，謝寶恩，等.枯草芽孢桿菌XK-1產芽孢條件的優(yōu)化［J］.中國農學通報，2012，28（27）：146-151.

［13］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 47892—2010食品微生物學檢驗菌落總數測定［S］.北京：中國標準出版社，2010.

［14］高學文，姚仕義.枯草芽抱桿菌B2菌株產生的抑菌活性物質分析［J］.中國生物防治，2003，19（4）：175-179.

［15］周勇.枯草芽孢桿菌ACCC-10619產芽孢工藝條件及其發(fā)酵豬糞研究［D］.長沙：湖南農業(yè)大學碩士論文，2013.

［16］FURZIKOVA T M，SERGEICHUK M G，SOROKULOVA I B，et al. The effect of the cultivation conditions on the properties of bacilli comprising the bas is of probiotics［J］.Microbiolohichnyi Zhurnal，1999，61（5）∶19-27.

［17］閆沛迎，陳秀蓉，薛莉，等.枯草芽孢桿菌B2種子液發(fā)酵條件的研究［J］.甘肅農業(yè)大學學報，2008，43（2）：110-113.

［18］周映華，吳勝蓮，賀月林，等.飼用枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.湖南農業(yè)科學，2010（11）：21-23.

［19］黎繼烈，胡鐵，崔培梧，等.油茶粕產枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.中國糧油學報，2014，29（1）：53-60.

Optimization of proliferation medium composition and fermentation conditions of against Listeria monocytogenes by Bacillus subtilis C3

LIU Kuanbo1，2，XIONG Lixia1*，LIU Hui1，ZHANG Hongxing1
（1.Beijing Engineering Laboratory of Probiotics Key Technology Development，Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，College of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Bacillus subtilishasstrong inhibitory effect onListeria monocytogenes，the proliferation medium and culture condition of bacteriocin against L.monocytogenesbyB.subtilisC3 were optimized，which will be probably applied in food and feed in the future.On the basis of single factors on the proliferation medium and fermentation conditions，orthogonal experiments with 5 factors and 4 levels was conducted to optimize the number of viable cells ofB.subtilisC3.The results showed that the optimal medium composition was glucose 1.0%，yeast extract powder 1.0%，NaCl 0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2%，and the optimal fermentation conditions were initial pH 5.4，fermentation medium with fluid volume of 50 ml/250 ml，inoculum 3%，fermentation temperature 37℃，shaker speed 160 r/min，fermentation time 14 h.Under the optimized conditions，the number of viable cells ofB.subtilisC3 can reach 7.1×1010CFU/ml，which increased 7.89 times.

Bacillus subtilisC3；Listeria monocytogenes；proliferation medium；fermentation conditions；optimization

TS201.1

0254-5071（2016）02-0048-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.011

2015-12-07

北京市教委面上項目（KM201410020010）；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養(yǎng)計劃（CIT&TCD20140315）

劉寬博（1993-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

熊利霞（1975-），女，講師，博士，研究方向為食品微生物及其代謝產物的利用。