黑曲霉中單寧酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)特性分析

李?；?，張　蕾，陳龍賓，朱　琪，喬家運(yùn)，王文杰

（天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心，天津300381）

黑曲霉中單寧酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)特性分析

李?；?，張蕾，陳龍賓，朱琪，喬家運(yùn)，王文杰

（天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；天津市畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)工程中心，天津300381）

本試驗(yàn)旨在從一株黑曲霉中克隆單寧酶基因，并研究其酶學(xué)性質(zhì)。利用前期分離的一株黑曲霉菌株SL-5，克隆出單寧酶基因，基因全長(zhǎng)1533 bp，編碼510個(gè)氨基酸；使用大腸桿菌BL21作為宿主，并使用pET32a（+）作為表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了單寧酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)。純化的單寧酶能夠降解單寧，酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH為6.0。

單寧；單寧酶；大腸桿菌；克??；表達(dá)

［Abstract］This study was conducted to clone tannase gene from Aspergillus niger and investigate its tannin-degrading characterization.We cloned the tannase gene from Aspergillus niger（SL-5），and the open reading frame of the gene contained 1533 bp coding for a 510 amino-acid matured protein，and expressed the tannase protein（rTannase）in Escherichia coli by using pET32a（+）vector.We found that the purified tannase was able to degrade hydrolysable tannin，exhibiting optimal enzyme activity at 40℃and pH 6.0.

［Key words］tannins；tannase；Escherichia coli；cloning；expression

單寧廣泛分布于植物的各部位，如樹(shù)葉、樹(shù)皮、樹(shù)干和種子。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和特性，通常分為水解單寧和縮合單寧 （Khanbabaee和 van Ree，2001）。飼料中高濃度的單寧會(huì)降低反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能和飼料轉(zhuǎn)化效率，通常使用聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮這兩種化學(xué)物質(zhì)去除單寧的危害（Ephraim等，2005），但通常處理成本較高。單寧酶 （E.C.3.1.1.20）能切割水解單寧之間的酯鍵（Battestin和Macedo 2007），某些微生物能分泌單寧 酶（B?er等 ，2009；O'Donovan和 Brooker，2001）。但是，由于單寧酶的產(chǎn)量較低，而且生產(chǎn)條件苛刻，限制了其在飼料中的應(yīng)用。因此，采用基因工程技術(shù)提高單寧酶的產(chǎn)量有重要意義。

本研究使用實(shí)驗(yàn)室前期分離到的一株能降解單寧的黑曲霉菌株SL-5（喬家運(yùn)等，2011），克隆其中含有的單寧酶基因，并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的表達(dá)。

1　材料與方法

1.1菌株、載體和工程菌黑曲霉SL-5菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離，用于基因組DNA的提取。pET-32a（+）載體購(gòu)自Novagen公司，用于構(gòu)建單寧酶大腸桿菌表達(dá)載體。E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)，用于單寧酶的表達(dá)。

1.2主要試劑基因組DNA提取試劑盒、小量DNA片段快速膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、dNTPs（10 mmol/L）和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，均購(gòu)自天根生化科技有限公司；高保真Taq DNA聚合酶和DNA快速連接試劑盒均購(gòu)自Takara公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I和HindⅢ購(gòu)自NEB公司；Gold-View核酸染料購(gòu)自賽百盛；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自博大泰恒生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司；BCA蛋白定量分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank已經(jīng)發(fā)表的單寧酶基因序列 （登錄號(hào)：XM-001402449.1），用Premier5.0設(shè)計(jì)引物。上游引物 （Tan-F）：5'-CGGAATTCTGCAATGTCACTGTTACC-3'；下游引物（Tan-R）：5'-CCCAAGCTTGAAAACGGGCATCT TG-3'。上下游引物分別引入EcoR I和HindⅢ酶切位點(diǎn)（下劃線）及相應(yīng)的保護(hù)性堿基。PCR產(chǎn)物包含完整的單寧酶基因，同時(shí)單寧酶基因與pET-32a（+）載體上的his-tag標(biāo)簽處于同一個(gè)ORF中，獲得的重組質(zhì)粒命名為pET32a-Tan。引物由北京奧科生物有限公司合成。

1.4單寧酶基因的克隆與表達(dá)

1.4.1單寧酶基因的克隆按照基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取黑曲霉菌DNA。以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs（10 mmol/L each）1μL，上游引物和下游引物各2μL（10pmol/L），模板5 μL，高保真Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，補(bǔ)加去離子水至50 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.4.2單寧酶基因原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定將PCR產(chǎn)物特異性片段切下，用小量DNA片段快速膠回收試劑盒回收目的片段。根據(jù)操作說(shuō)明分別用EcoR I和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對(duì)回收純化的PCR產(chǎn)物和pET-32a（+）載體進(jìn)行雙酶切，并對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收和純化。取4 μL雙酶切目的片段、1 μL雙酶切pET-32a（+）載體和5 μL連接液（Takara公司產(chǎn)品）在16℃下連接反應(yīng)4 h。將連接產(chǎn)物（pET-32a-Tan）化學(xué)轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在含Amp+ （100 μg/mL）的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，進(jìn)行抗性篩選。挑取抗性篩選為陽(yáng)性的單菌落培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒pET-32a-TanE，利用雙酶切質(zhì)粒的方法鑒定陽(yáng)性克隆。將雙酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆送往諾賽基因公司測(cè)序。利用DNAMAN軟件分析Tan基因擴(kuò)增和原核表達(dá)載體構(gòu)建的正確性。

1.4.3重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDSPAGE分析將測(cè)序正確的工程菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中 （含100 μg/mL氨芐青霉素），37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。按1%接種于100 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6，菌液經(jīng)冰浴降溫后，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16℃低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h，收集菌體，同時(shí)設(shè)只含表達(dá)載體pET-32a（+）的E.coli BL21對(duì)照。誘導(dǎo)完成后，各取1 mL菌液，分別加入SDS上樣緩沖液，懸浮混勻，100℃水浴5 min，12000 r/min離心2 min，取上清經(jīng)12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮蘭染色，脫色，分析蛋白表達(dá)情況。

1.4.4單寧酶活性分析酶活測(cè)定：取4支潔凈的10 mL具塞試管，分別設(shè)定為對(duì)照平行管和測(cè)定平行管，在每支試管中先后各加入0.01 mol/L檸檬酸緩沖液和1 mL酶液，40℃下平衡5 min，先將4 mL 99%乙醇加入對(duì)照管中，使酶失活。5 min后，在4支試管中加入底物沒(méi)食子酸丙酯溶液，40℃保溫，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，在測(cè)定管中加入4 mL 99%乙醇終止反應(yīng)。從上述4支試管中各取1 mL反應(yīng)液，分別定容至10 mL，并測(cè)定其在270 nm處吸收值（A）。以重蒸水代替底物溶液重復(fù)上述操作作為空白。將反應(yīng)溫度為40℃條件下，1 mL酶液每分鐘使PG液在270 nm處減少0.001個(gè)吸收值定義為1個(gè)酶活力單位。

酶蛋白濃度測(cè)定：純化后的單寧酶濃度測(cè)定參照BCA蛋白定量分析試劑盒的方法進(jìn)行。

1.4.5單寧酶特性分析最適反應(yīng)溫度：分別在20、30、40、50、60、70℃時(shí)測(cè)定單寧酶活性，結(jié)果以相對(duì)酶活性進(jìn)行表示。

酶最適反應(yīng)pH：分別采用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的檸檬酸緩沖液測(cè)定酶活性，結(jié)果以相對(duì)酶活性進(jìn)行表示。

2　結(jié)果與分析

2.1單寧酶基因的克隆以黑曲霉菌的全基因組為模板，以Tan-F和Tan-R為引物，按照1.4.1中的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件擴(kuò)增出大小為1500 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。

圖1　黑曲霉菌單寧酶基因的PCR擴(kuò)增

2.2重組質(zhì)粒pET32a-Tan的構(gòu)建與鑒定將PCR擴(kuò)增的特異性片段回收純化后，用EcoR I和HindⅢ酶切并純化，連接到相同酶切回收后的原核表達(dá)載體pET-32a（+）上，獲得pET-32a-Tan原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coli BL21。對(duì)抗性篩選為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒用EcoR I和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)載體條帶5900 bp和目的條帶1500 bp（圖2），與預(yù)期大小一致。雙酶切鑒定為陽(yáng)性克隆的測(cè)序結(jié)果，通過(guò)DNAMAN軟件分析，發(fā)現(xiàn)Tan基因無(wú)核苷酸突變，Tan基因與載體上的tag-his標(biāo)簽處于同一個(gè)ORF中，說(shuō)明重組質(zhì)粒pET32a-Tan構(gòu)建正確。

圖2　重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

2.3原核表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)將鑒定正確的pET32a-Tan轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)該工程菌12 h后，通過(guò)12%SDS-PAGE分析，可見(jiàn)約76 kDa的蛋白條帶，這與預(yù)期的Tan-his融合蛋白大小相符（利用EXPASY在線預(yù)測(cè)）。重組蛋白可溶性分析表明，單寧酶重組蛋白是以可溶性形式表達(dá)。利用Ni-NTA柱在天然條件下純化單寧酶重組蛋白，純化的蛋白液經(jīng)12%SDSPAGE分析后，有約76 kDa的Tan-his融合蛋白條帶，并且純度較高（圖3）。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，單寧酶基因在大腸桿菌中得到表達(dá)，并且已經(jīng)成功獲得較高純度的單寧酶重組蛋白。

圖3　SDS-PAGE分析單寧酶重組蛋白的表達(dá)和純化

2.4重組單寧酶酶學(xué)特性分析由圖4和圖5可以看出，重組單寧酶的最適反應(yīng)溫度是40℃，最適反應(yīng)pH值在5.0～6.0。

圖4　單寧酶最適反應(yīng)溫度分析

圖5　單寧酶最適pH反應(yīng)分析

3　討論

單寧廣泛存在于各種植物當(dāng)中，與纖維素、蛋白質(zhì)、酶、脂肪、核酸和氨基酸等物質(zhì)形成復(fù)合物，可對(duì)微生物產(chǎn)生抗性 （O'Donovan和 Brooker，2001）。當(dāng)飼料干物質(zhì)中單寧含量超過(guò)6%時(shí)，會(huì)降低動(dòng)物的飼料采食量、生長(zhǎng)速度、體增重和養(yǎng)分利用效率，采食單寧量更高時(shí)會(huì)造成動(dòng)物死亡，這是由于在動(dòng)物的解毒過(guò)程中，沒(méi)有消除單寧或者其降解產(chǎn)物的毒性（Bhat等，1996）。通過(guò)分泌脯氨酸含量豐富的唾液蛋白，小鼠能耐受高濃度的單寧（Mehansho等，1987），但對(duì)于牛和羊等反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō)，脯氨酸含量豐富的唾液蛋白并不起關(guān)鍵作用（Bhat等，1996），這說(shuō)明不同動(dòng)物耐受單寧能力的機(jī)制并不相同。

從不同來(lái)源的樣品中分離到能降解單寧的細(xì)菌和真菌（Bo·er等，2009；O'Donovan和Brooker，2001），其中部分微生物能產(chǎn)生胞外單寧酶（Belur等，2010；Kasieczka-Burnecka等，2007）。有研究報(bào)道黑曲霉產(chǎn)單寧酶的能力很強(qiáng)，因此，黑曲霉已被應(yīng)用于多種工業(yè)生產(chǎn)中（Gupta等，1997）。

采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)目標(biāo)蛋白有很多優(yōu)點(diǎn)，如培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、目標(biāo)蛋白產(chǎn)量和純度高、價(jià)格便宜等。目前已經(jīng)從不同有機(jī)體中克隆了單寧酶的基因，如黑曲霉 CBS（GenBank No.XM-001402449）、米曲霉（GenBank No.D63338）和褶皺裸胞殼NH4（GenBank No.JX104141），不同來(lái)源的單寧酶的分子量為186～300 kDa（Hatamoto等，1996）。研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉所產(chǎn)的單寧酶是由兩個(gè)分子量分別為30 kDa和33 kDa的亞基通過(guò)二硫鍵交聯(lián)而成（Hatamoto等，1996）。本研究從黑曲霉克隆到的單寧酶基因（GenBank No.JN848716），通過(guò)序列比對(duì)，與已經(jīng)公布的不同來(lái)源的單寧酶核酸序列相似性分別為93%（黑曲霉CBS，GenBank No.XM-001402449）、92%（褶皺裸胞殼，GenBank No.JX104141）和76%（米曲霉，GenBankNo.D63338）。酵母表達(dá)系統(tǒng)需翻譯后修飾，并且表達(dá)量高，通常用于生產(chǎn)真核蛋白。研究報(bào)道，采用酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)重組單寧酶 （B?er等，2011；Zhang等，2004）。本研究中，嘗試使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)單寧酶，并實(shí)現(xiàn)成功表達(dá)。當(dāng)使用大腸桿菌BL21菌株作用宿主，并使用pET32a（+）作為載體進(jìn)行外源蛋白表達(dá)時(shí)，一部分蛋白分泌進(jìn)入細(xì)胞周質(zhì)中，另一部分形成包涵體。測(cè)定酶活性時(shí)僅限于純化的細(xì)胞周質(zhì)中的酶蛋白，因此本研究測(cè)定的重組單寧酶活性較低。在下一步研究當(dāng)中，需要關(guān)注是否有其他因素影響單寧酶的活性，如何采用其他表達(dá)系統(tǒng)提高酶的產(chǎn)量，以及酶活性和酶蛋白結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

4　小結(jié)

本研究從產(chǎn)單寧酶的黑曲霉菌株中克隆出了單寧酶基因，并實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達(dá)，純化的重組單寧酶最適反應(yīng)溫度是40℃，最適反應(yīng)pH是6.0。

［1］喬家運(yùn)，李平，陳龍賓，等.單寧降解菌的篩選及降解研究［J］.飼料工業(yè)，2011，32（5）：28～29

［2］Battestin V，Macedo G A.Effects of temperature，pH and additives on the activity of tannase produced by Paecilomyces variotii［J］.Electron J Biotechnol，2007，10：191～199.

［3］Belur P D，Gopal M，Nirmala K R，et al.Production of novel cell-associated tannase from newly isolated Serratia ficaria DTC［J］.J Microbiol Biotechnol，2010，20：732～736.

［4］Bhat T K，Makkar H P S，Singh B.Isolation of a tannin-protein complexdegrading fungus from faeces of hill cattle［J］.Lett Appl Microbiol，1996，22：257～258.

［5］B?er E，Bode R，Mock H P，et al.Atan1p-an extracellular tannase from the dimorphic yeast Arxula adeninivorans：molecular cloning of the ATAN1 geneandcharacterizationoftherecombinantenzyme［J］.Yeast，2009，26：323～337.

［6］B?er E，Breuer F.S，Weniger M，et al.Large-scale production of tannase using the yeast Arxula adeninivorans［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，92： 105～114.

［7］Ephraim E，Odenyo A，Ashenafi M.Isolation and characterization of tannin-degrading bacteria from faecal samples of some wild ruminants in Ethiopia ［J］.Anim Feed Sci Techno，2005，118：243～253.

［8］Gupta R，Bradoo S，Saxena R K.Rapid purification of extracellular tannase using polyethylene glycol-tannic acid complex［J］.Lett Appl Microbiol，1997，24：253～255.

［9］Hatamoto O，Watarai T，Kikuchi M，et al.Cloning and sequencing of the gene encoding tannase and a structural study of the tannase subunit from Aspergillus oryzae［J］.Gene，1996，175：215～221.

［10］Kasieczka-Burnecka M，Kuc K，Kalinowska H，et al.Purification and characterization of two cold-adapted extracellular tannin acyl hydrolases from an Antarctic strain Verticillium sp.P9［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，77：77～89.

［11］Khanbabaee K，van Ree T.Tannins：classification and definition［J］.Nat Prod Rep，2001，18：641～649.

［12］Mehansho H，Butler L G，Carlson D M.Dietary tannins and salivary proline-rich proteins：interactions，induction，and defense mechanisms［J］.Annu Rev Nutr，1987，7：423～440.

［13］O'Donovan L，Brooker J D.Effect of hydrolysable and condensed tannins on growth，morphology and metabolism of Streptococcus gallolyticus（S.caprinus）and Streptococcus bovis［J］.Microbiology，2001，147：1025～1033.

［14］Zhang X，Peng L，Zheng S，et al.Secretion，purification，and characterization of a recombinant Aspergillus oryzae tannase in Pichia pastoris［J］.Protein Expr Purif，2004，36：165～169.■

S816.3

A

1004-3314（2016）11-0025-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161107