液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆制品中的烏洛托品

李新麗，張厚森，賈 濤，高 宏，朱成晶

(江蘇省理化測試中心，江蘇 南京 210042)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆制品中的烏洛托品

李新麗，張厚森，賈 濤，高 宏，朱成晶

(江蘇省理化測試中心，江蘇 南京 210042)

建立了用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆制品中烏洛托品含量的方法。樣品用乙腈提取、正己烷凈化，弱堿性流動相、梯度洗脫、正離子電噴霧多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測。本方法適用于腐竹、大豆粉、豆?jié){粉、大豆蛋白粉等豆制品中烏洛托品的測定。方法定量限為4 μg/kg，回收率86.2 %～102.0 %，精密度RSD<5 %。實驗表明本方法前處理簡單，定性定量方法準確，能對豆制品中烏洛托品進行確證。

烏洛托品;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法;測定

烏洛托品(別名六亞甲基四胺)是衛(wèi)生部公布的非食用物質(zhì)之一，在弱酸條件下分解產(chǎn)生甲醛，具有殺菌、防腐的作用。衛(wèi)生部報道可能有些不法廠家違法使用烏洛托品以替代吊白塊,意在保持產(chǎn)品的色澤和延長保質(zhì)期。烏洛托品本身屬低毒類，可作為藥物服用，但其在酸性條件下，分解出的甲醛易與體內(nèi)多種化學結(jié)構(gòu)的受體發(fā)生反應(yīng)，如與氨基化合物可以發(fā)生縮合，與巰基化合物加成，使蛋白質(zhì)變性。甲醛在體內(nèi)還可還原為醇，故可表現(xiàn)出甲醇的毒理作用。對人體的腎、肝、中樞神經(jīng)、免疫功能、消化系統(tǒng)等均有損害。因為烏洛托品在pH小于6.5就會分解放出甲醛，在食品中的殘留量會隨著存放時間的延長而減少，在市場調(diào)查收集的陽性樣品中烏洛托品的殘留量都在10 mg/kg以下。衛(wèi)生部發(fā)布的第四批《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單》中明確規(guī)定烏洛托品屬于違法添加的非食用物質(zhì)。目前現(xiàn)有食品中烏洛托品測試的國標方法有SN/T 2226-2008《進出口動物源性食品中

烏洛托品殘留量的檢測方法》[1]，適用于雞肉、雞肝臟、雞腎臟和豬肉中烏洛托品殘留量的檢測和確證，因為樣品基質(zhì)差別太大，該檢測方法不適用豆制品。報道的食品中烏洛托品的檢測主要有氣相色譜法[2-3]、分光光度法[4-5]、離子色譜法[6]、液質(zhì)法[7-17]等，本文介紹的方法前處理更為簡單、快速。和同類液質(zhì)法相比，因為采用梯度洗脫分離了豆制品中的干擾物質(zhì)，從而簡化了目標物提取過程中去雜質(zhì)的步驟，降低了檢測成本、提高了檢測速度。

本文通過對不同提取方法、提取溶劑、色譜條件的研究，建立了用乙腈震蕩提取、正己烷凈化，弱堿性流動相、梯度洗脫的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆制品中烏洛托品殘留量的分析方法，該方法操作過程簡單，準確度、靈敏度和精密度好。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

烏洛托品(純度99.0 %) 德國Dr. Ehrenstorfer公司；氨水，正己烷，甲酸銨均為分析純，國藥集團；乙腈為色譜純， 美國TEDIA 公司； 0.22 um微孔濾膜，天津津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓液相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS)，型號Agilent1260-6430 美國安捷倫公司；高速離心機；電動振蕩器；渦旋混勻器。

1.3 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜柱為科奧美萃生物科技公司生產(chǎn)的Kinetex HILIC 100A 柱(50 mm*2.1 mm,2.6 um)；流動相為10 mmol/L甲酸銨溶液(pH=7.5±0.3)，乙腈；色譜柱溫度25℃；進樣量5μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜掃描采集方法為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；質(zhì)譜離子源為電噴霧(ESI)電離源，正離子模式，脫溶劑氣為氮氣，溫度300 ℃，流量9 L/min；噴霧器壓力103.4KPa；碰撞氣為高純氮氣；毛細管電壓4000 V；其它質(zhì)譜條件見表2。

表2 烏洛托品多反應(yīng)監(jiān)測條件

1.4 試驗方法

1.4.1 試樣預(yù)處理

取有代表性的樣品約200 g，用粉碎機粉碎，混勻，均分成兩份作為試樣，分別裝入潔凈容器，密封并做好標識，于-18 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.4.2 提取

準確稱取試樣2 g(精確至0.001 g)，于50 mL具塞離心管中，用移液管準確加入10 mL乙腈，渦旋混勻，于震蕩器(震蕩頻率300次/分)上震蕩提取20min，以4000 r/min離心2 min，吸取上清液2 mL于10 mL離心管中，加入2 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋混勻1 min ，在4000 r/min下離心1 min，棄去上層正己烷，重復用乙腈飽和的正己烷溶液萃取一次，下層液過0.22 μm濾膜，待測。

1.5 標準溶液配制

準確稱取烏洛托品標準品，用乙腈配制成濃度為100 μg/mL的標準儲備液。儲備液在0 ℃～4 ℃冰箱避光保存，可使用6個月。使用前用乙腈配制濃度為0.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL的標準工作液。

1.6 測定

1.6.1 定性測定

按照上述條件測定樣品和標準溶液，如果樣品與標準溶液中待測物的質(zhì)量色譜峰保留時間一致；且在扣除背景后的樣品質(zhì)量色譜圖中，所選擇的離子對均出現(xiàn)，同時與標準品的相對豐度允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物。

表3 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

1.6.2 定量測定

以標準使用液分別進樣，以峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量，樣液中烏洛托品的響應(yīng)值應(yīng)在標準使用液線性范圍內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法選擇

在選擇提取溶劑時考察了水、甲醇、乙醇、乙腈等溶劑，水的提取液渾濁，很難分離出澄清液，容易發(fā)生堵塞；乙醇能和正己烷互溶，影響脂溶性雜質(zhì)的分離，增加基質(zhì)效應(yīng)；甲醇和乙腈的提取效率相近，考慮甲醇的沸點低和毒性較大，故選擇乙腈。

考察了超聲提取和震蕩提取法，發(fā)現(xiàn)超聲提取會使目標物發(fā)生分解，回收率降低、且數(shù)據(jù)不穩(wěn)定；考察了震蕩提取的震蕩頻率、提取時間和提取次數(shù)等因素，用陽性樣品實驗發(fā)現(xiàn)，當震蕩頻率300 次/min時，提取20 分鐘一次就能達到最大提取值，加標回收率90 %以上、精密度也能滿足要求。

在凈化方法的選擇上，考察了固相萃取小柱凈化和正己烷凈化，參照SN/T2226-2008,采用離子交換樹脂小柱，但因為豆制品中可溶于乙腈的基質(zhì)復雜，采用小柱并不能消除基質(zhì)干擾，且因為每個小柱的填充差異，影響了方法的精密度和準確性，選擇正己烷凈化不但步驟簡單，成本低，而且消除基質(zhì)效應(yīng)比小柱好。

2.2 儀器條件選擇

烏洛托品在酸性條件下會分解放出甲醛，采用堿性甲酸銨緩沖鹽溶液和乙腈作為流動相不僅可以為質(zhì)譜的電離源提供足夠的帶電離子而且可以將整個分離過程維持在一個相對穩(wěn)定的堿性環(huán)境中，可以避免烏洛托品在酸性條件下的分解。

實驗表明，采用電噴霧正模式電離、堿性色譜條件下比酸性條件下的色譜峰響應(yīng)值高。

豆制品特別是腐竹經(jīng)過了復雜加工后，基質(zhì)復雜，對烏洛托品檢測干擾很大，即使在前處理中用正己烷進行凈化，但基質(zhì)效應(yīng)仍然較大，而且相同種類不同品牌豆制品的基質(zhì)效應(yīng)也差別較大，為此考察了不同比例流動相的等度洗脫、梯度洗脫、不同流速的選擇等。實驗表明當進樣量5 μL、流速0.2 mL/min、梯度洗脫時可以消除所有基質(zhì)干擾，用乙腈配置標準曲線，基質(zhì)提取液加標回收率達到95 %～100 %。

圖1 樣品中烏洛托品的總離子流圖

圖2 烏洛托品標準品的總離子流圖

圖3 烏洛托品質(zhì)譜圖

2.3 方法的線性關(guān)系和檢出限

對系列標準溶液進行測定，在5 μg/kg ～100 μg/kg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2大于0.999。

在空白樣品基質(zhì)溶液中加入估計檢出限濃度(大于3倍信噪比)的標準品進行檢出限測試，結(jié)合回收率確定腐竹、大豆粉、豆?jié){粉、大豆蛋白粉等豆制品中烏洛托品的檢出限小于1 μg/kg。

2.4 方法回收率和精密度

在陰性樣品中加入烏洛托品標準物質(zhì)，添加的標準品使測試溶液濃度分別為5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L，進行回收率和精密度實驗。腐竹因為基質(zhì)復雜，不同品牌基質(zhì)差異較大，實驗過程選擇3個不同產(chǎn)地和品牌的腐竹樣品進行試驗。試驗表明方法精密度RSD=0.69%～2.89%，方法回收率為88.8%～102.4%。實驗結(jié)果見表4。

表4 精密度和準確度測試數(shù)據(jù)(平行測定次數(shù)n=6)

3 結(jié)論

對市售腐竹陽性樣品研究發(fā)現(xiàn)，在常溫下烏洛托品在緩慢分解，在-18℃下儲存可停止分解，從獲得的陽性樣品的檢測數(shù)據(jù)看，烏洛托品的殘留量都在1 mg/kg以上，本法能滿足豆制品中違法添加烏洛托品的有效檢出，可以在豆制品的食品安全監(jiān)管以及監(jiān)督中發(fā)揮作用。

[1] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，SN/T 2226-2008進出口動物源性食品中烏洛托品殘留量的檢測方法液.

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(本文文獻格式：李新麗，張厚森，賈 濤，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆制品中的烏洛托品[J].山東化工，2016，45(14)：63-66.)

Determination of Urotropine content in Bean Products by HPLC-MS/MS

LiXinli，ZhangHousen，JiaTao，GaoHong，ZhuChengjing

(Physics and Chemistry Testing Center of Jiangsu Province，Nanjing 210042, China)

Determination content of Urotropine in Bean Products is descripted in this paper. The samples were extracted by acetonitrile, purified by hexane, gradient elution separated by weak basic mobile phase, and determined by electrospray ionization and positive ion monitoring mode. This method can used to determine the content of Urotropine in beancurd skin, soybean flour, soymilk powder, and soyabean protein powder. The limitation is 4μg/kg, the total recovery rate is in the range of 86.2 %～102.0 %, and RSD<5 %. Its advantages include simple pretreatment and high accuracy.

Urotropine, HPLC-MS/MS ,Determination

2016-05-11

食品安全地方標準JSSPDB2012-004

李新麗(1968—)，女，高工，從事分析測試與研究工作。

O657.63；TS207.3

A

1008-021X(2016)14-0063-04