趕黃草不同濃度乙醇提取物中沒食子酸含量的測定

唐勇，向小紅，李國春,許紅

（西南醫(yī)科大學:1附屬中醫(yī)醫(yī)院靜脈用藥調(diào)配中心；2藥學院藥理學系；3附屬醫(yī)院眼科，四川瀘州646000）

趕黃草不同濃度乙醇提取物中沒食子酸含量的測定

唐勇1，2，向小紅，李國春1,許紅1

（西南醫(yī)科大學:1附屬中醫(yī)醫(yī)院靜脈用藥調(diào)配中心；2藥學院藥理學系；3附屬醫(yī)院眼科，四川瀘州646000）

目的：測定趕黃草不同體積分數(shù)乙醇提取物收率及其中沒食子酸含量，為篩選更優(yōu)的趕黃草提取方法提供參考。方法：①用不同體積分數(shù)乙醇采用熱回流提取法提取趕黃草，得到趕黃草提取物；②采用Agilent C18色譜柱，甲醇-0.15%磷酸溶液（10∶90）為流動相，檢測波長270 nm，柱溫35℃，流速1.0 mL·min-1測定趕黃草提取物中沒食子酸含量。結(jié)果：35%乙醇、55%乙醇、75%乙醇、95%乙醇提取得到的趕黃草浸膏收率分別為16.3%、16.6%、16.8%、9.6%，所得提取物中沒食子酸含量分別為10.81 μg·mg-1、11.87 μg·mg-1、13.61 μg·mg-1、15.50 μg·mg-1。結(jié)論:75%乙醇提取趕黃草收率及提取物中沒食子酸含量總量最高，95%乙醇趕黃草提取物中沒食子酸濃度最高。

趕黃草；乙醇；沒食子酸；含量

趕黃草（Penthorum Chinese Pursh）又名水澤蘭，為虎耳草科扯根菜屬植物趕黃草的干燥地上部分，主要分布與我國華東、華北、中南、陜西、四川和貴州等地，具有清熱解毒、活血平肝、健脾祛黃等功效，是苗族治療肝病的常用藥物[1]。現(xiàn)代研究顯示趕黃草還具有清除DPPH自由基、抗病毒、抗突變等藥理活性[2-5]，趕黃草的化學成分主要為黃酮類、揮發(fā)油類、苷類等，已報道單體成分有喬松素7-O-β-D-葡萄糖苷、2，4，6-三羥基苯甲酸、沒食子酸、槲皮素、2，6-二羥基苯乙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等20余種[6-7]。單一組分藥理實驗表明，沒食子酸具有抗乙肝病毒和保肝作用的成分[7-10]。因此測定趕黃草提取物中沒食子酸的含量是評價提取方法以及評價提取物藥理活性質(zhì)量控制的重要指標，本文建立了RP-HPLC測定趕黃草不同體積分數(shù)乙醇提取物中沒食子酸的含量，對比其含量差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

趕黃草（四川省瀘州市百草堂中藥飲片有限公司，批號：130606-1），無水乙醇（吉林省新天龍實業(yè)股份有限公司，批號：20130308），沒食子酸（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：130711），甲醇（美國Sigma公司），甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 對照品溶液的配制

精密稱取沒食子酸標準品0.0054 g于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得沒食子酸對照品溶液，標準品濃度為0.540 mg·ml-1。

1.3 實驗分組

用蒸餾水將無水乙醇按體積分數(shù)稀釋為35%、55%、75%、95%四個濃度溶液備用，將實驗分為35%乙醇提取物組，55%乙醇提取物組，75%乙醇提取物組，95%乙醇提取物組4個實驗組及沒食子酸標準品組共5個組。

1.4 供試液的制備

各實驗組稱取趕黃草100 g于圓底燒瓶中，加入3倍體積的對應濃度乙醇浸泡30 min后，加熱回流提取2 h,所得提取物經(jīng)過濾、回收乙醇、真空干燥等操作成干燥粉末待用。稱取約相當于原生藥1 g的提取物于50 mL容量瓶中，甲醇定容，微孔濾膜（0.45 μm）過濾即得供試品溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱為：Agilent C18（4.6 mm×150 mm×5 μm）色譜柱，流動相為甲醇：0.15%磷酸溶液＝10∶90，檢測波長270 nm，柱溫35℃，流速1.0 ml·min-1，進樣量10 μL。

1.6 標準曲線的繪制

精密移取沒食子酸標準溶液1 mL,2.5 mL,5.0 mL,7.5 mL,10.0 mL于4只10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，即為標準曲線供試液。

按實驗色譜條件，各對照品供試液分別進樣，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標（A），沒食子酸含量為橫坐標（C）,繪制標準曲線。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

照方法1.5所示色譜條件進行試驗，外標峰面積法計算沒食子酸含量，理論塔板數(shù)＞5 000，沒食子酸RT=7.537 min，與相鄰峰分離度＞1.5，色譜圖見圖1。

圖1 沒食子酸對照品與樣品色譜圖

2.2 線性關系

按1.6實驗方法得回歸方程為：A=0.0004C-0.0059,r=0.9997，表明沒食子酸濃度在0.135 mg· mL-1～0.540mg·ml-1范圍內(nèi)，沒食子酸峰面積值（A）與濃度（C）之間呈現(xiàn)良好的線性關系，但由于其不過原點，因此采用外標兩點法測定供試品中沒食子酸含量。

2.3 精密度實驗

精密吸取對照品供試液（0.540 mg·ml-1），連續(xù)進樣5次，每次10 μL，測定峰面積積分值計算RSD。RSD=0.3417%，說明儀器具有良好的精密度，見表1。

表1 精密度測試實驗結(jié)果

2.4 重現(xiàn)性實驗

精密稱取35%乙醇提取物0.2037g共5份，按1.5方法測定沒食子酸含量，RSD=0.9288%說明該方法據(jù)有較好的重現(xiàn)性，見表2。

表2 重現(xiàn)性實驗結(jié)果

2.5 加樣回收實驗

精密稱取95%乙醇提取物0.002596 g共10份，分為兩組：一組（5份）加甲醇超聲溶解后甲醇定容致10 mL，按1.5方法測定沒食子酸含量，另一組（5份）加入對照品溶液適量，加甲醇超聲溶解后甲醇定容致25 mL，按1.5方法測定沒食子酸含量，計算回收率，計算公式為：回收率（%）=（測定量-樣品中含量）/加入對照品量×100%，結(jié)果得：平均回收率為100.43%，RSD=0.1262%，見表3。

表3 回收率測定結(jié)果

2.6 趕黃草不同濃度乙醇提取物收率及其沒食子酸含量

按1.4方法制備供試液，按1.5色譜條件，進樣量10 μL，實驗重復3次，根據(jù)峰面積由回歸方程計算各組供試品沒食子酸含量。由表2可知，35%乙醇提取趕黃草浸膏收率為16.3%，提取物中沒食子酸含量10.81 μg·mg-1，55%乙醇提取趕黃草浸膏收率為16.6%，提取物中沒食子酸含量11.87 μg·mg-1，75%乙醇提取趕黃草浸膏收率為16.8%，提取物中沒食子酸含量13.61 μg·mg-1，95%乙醇提取趕黃草浸膏收率為9.6%，提取物中沒食子酸含量15.50 μg·mg-1，見表4。

表4 趕黃草不同濃度乙醇提取物收率及沒食子酸含量的測定

3 討論

沒食子酸作為趕黃草中明確具有抗乙肝病毒和保肝作用的活性成分[11-12]，在趕黃草制劑中作為質(zhì)量控制指標，對趕黃草進行現(xiàn)代化開發(fā)利用不可避免的需要對趕黃草進行加工提取[13-16]，而需要找到良好的提取方法及提取溶劑，提取物中沒食子酸的含量是需要考察的一個重要指標[14]，本文采用RP-HPLC測定趕黃草不同體積分數(shù)乙醇提取物中沒食子酸含量，由方法學考察情況看本實驗所用方法可靠、穩(wěn)定。

不同體積分數(shù)乙醇提取趕黃草后所得浸膏收率情況看75%乙醇提取物浸膏收率最高，95%乙醇提取物中沒食子酸含量最高，從沒食子酸在提取物中的含量換算所得提取物中沒食子酸總量看，75%乙醇提取物中沒食子酸含量總量最高。

從提取物中沒食子酸含量總量看75%乙醇提取方法較好，從提取物中沒食子酸含量看95%乙醇提取較優(yōu)。有效成分含量是評價中藥提取分離方法較為重要的參考指標，本文通過比較不同提取方法所得趕黃草提取物中沒食子酸的含量，為進一步開發(fā)利用趕黃草，尋找最優(yōu)提取方法提供參考。

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（2016-03-07收稿）

Determination of the content of gallic acid in ethanol extract from different concentrations of ethanol extracts from Phethorum Chinese Pursh

Tang Yong1,2,Xiang Xiaohong3,Li Guochun1,Xu Hong11PIVAS of the Affiliated TCM Hospital of Southwest Medical University,2Departmant of Prarmacolgy of Southwest Medlical University;3Ophthalmology of the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou, Sichuan Provivce,646000,China

Objective：The content of gallic acid and the recovery rate of Phethorum Chinese Pursh from different concentrations of ethanol extracts were determined in order to provide a better way to recover the Phethorum Chinese Pursh from extraction.Methods：①We use different volume fractions of ethanol were used in hot reflux extraction to extract the Phethorum Chinese Pursh extraction.②Gallic acid was analyzed by Agilent C18 column at 270nm.The mobile phase consisted of acetonitrile 0.1%phosphoric acid（10:90）,running at the velocity at 1.0 mL·min-1,and the column temperature was 35℃.Results：At the concentrations of ethanol of 35%, 55%,75%,95%，the recovery rates of Phethorum Chinese Pursh were 16.3%,16.6%,16.8%,9.6%,and the contents of gallic acid were 10.81 μg·mg-1,11.87 μg·mg-1,13.61 μg·mg-1,15.50 μg·mg-1,respectively. Conclusion：The recovery rate was the highest using 75%ethanol,whereas 95%ethanol gave the highest concentration of gallic acid.

Phethorum Chinese Pursh;Ethanol;Gallic acid;Content

R733.4

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.021

唐勇（1988-），男，碩士生，藥師。E-mail:tangy1989@yeah.net