基于ITS序列分析的部分榕屬植物系統(tǒng)樹構建

李升星，陳家林，張?zhí)R 笑，劉小珍，張漢堯

(1.西南林業(yè)大學云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224)

基于ITS序列分析的部分榕屬植物系統(tǒng)樹構建

李升星1，陳家林2，張?zhí)?，賀 笑2，劉小珍1，張漢堯1

(1.西南林業(yè)大學云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224)

以榕屬中黃金榕、橡皮樹、小葉榕3個樹種為研究對象，以其葉片為試材提取基因組DNA，進行ITS-PCR擴增。對擴增產物測序結果進行分析，在NCBI上選取同源率較高的27個樹種的ITS序列與其進行同源比較，并建立系統(tǒng)樹分析它們之間的親緣進化關系。結果表明：30種榕屬植物基于ITS序列分析與傳統(tǒng)分類學略有差異，通過結合ITS鑒定與形態(tài)分類相結合可以為以后榕屬的分類提供借鑒。

榕屬；ITS序列分析；系統(tǒng)樹構建

榕屬(FicusLinn.)隸屬?？疲＞G、稀落葉，喬木或灌木，有時匍匐或攀援狀，在生態(tài)圈中，是包含喬木、灌木和藤本的形態(tài)變化較大的一屬。本屬約1000種，主要分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。我國約98種3亞種43變種2變型，廣泛分布于西南部至東部。榕屬植物為低維護性景觀植物，韌皮纖維可作麻類代用品，其中有些種類的榕果可藥用或食用，在諸多醫(yī)學著作中均有記載，經濟價值較高。榕屬植物在文化方面或是實用性上有相當關聯，根據相關資料顯示榕屬植物并沒有很明確的化石留存，然而現存的主要樹種的輻射適應已經發(fā)生在最近的20～40萬a。根據榕屬植物的生活習性、繁殖系統(tǒng)、花序果的著生位置將其分為4個亞屬，制定了早期的榕屬分類系統(tǒng)。由于該屬植物具有形態(tài)特征變異幅度大，種間界限難以界定的特點導致該屬植物分類比較困難，如無花果為隱頭花序，難以觀察其花器官，目前國內關于該屬植物系統(tǒng)進化方面的報道尚少[1-4]。

內轉錄間隔區(qū)ITS(Internal Transcribed Spacer)由保守的18S、5.8S 和28S 基因編碼區(qū)以及非編碼的各種間隔區(qū)組成。ITS 片段在絕大多數真核生物中表現出了極為廣泛的序列多態(tài)性，因此在ITS 序列上即使是親緣關系非常接近的2 個種也能表現出較為明顯的差異，顯示出最近的進化特征。由于ITS區(qū)具有較豐富的信息位點和變異位點，目前已有文獻證實ITS是研究許多被子植物類群系統(tǒng)與進化的重要分子標記，例如ITS序列分析對竹種進行系統(tǒng)分類的研究及對各種中藥材植物的鑒定等[5-6]。由于ITS能較好地反映出科內、屬間、種間的親緣關系，所以被廣泛應用于植物的系統(tǒng)演化及親緣關系的研究[7-17]。

本研究以云南省昆明市內3種不同榕屬樹種為試材，通過提取DNA，選取ITS-PCR產物直接測序方法獲得其序列，從NCBI上下載同源率較高的序列，并利用MEGA 5.05軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對榕屬植物進行分析，從分子水平上對榕屬植物進行系統(tǒng)分類，以期對該屬植物的系統(tǒng)分化和系統(tǒng)分類提供依據，為種質資源的利用和對其遺傳改良工作提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 榕屬植物材料

以昆明市金色俊園小區(qū)的3種榕屬植物黃金榕(F.microcarpacv.GoldenLeaves)、橡皮樹(F.elastica)、小葉榕(F.concinna)新鮮葉片為試驗材料。

1.2 葉片DNA提取

將采集的葉片在硅膠中干燥7 d后，用振蕩機振蕩成粉末狀，用BioTeKe 新型快速植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，并對提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 ITS序列擴增及測序

根據GenBank中榕屬的ITS基因序列選取ITS2和4組合特異性引物擴增樣品ITS基因，上游引物ITS2的序列為：5’—AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG—3’，下游引物ITS4的序列為：5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3’。以10個樹種的DNA為模板，采用25 μL反應體系即1 μL DNA模板、1 μL ITS2、1 μL ITS4、12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix和9.5 μL dd H2O，進行PCR擴增；反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸5 min；產物于4 ℃保存。取5 μL PCR產物和1 μL上樣緩沖液混勻后于1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用凝膠成像儀拍照[7]。剩余的PCR產物(約)20 μL委托昆明碩陽科技有限公司，采用雙向測序方法進行測序。

1.4 ITS序列分析及形態(tài)標記聚類分析

將測序得到的榕屬3個樹種的ITS序列用ContigExpress軟件進行拼接后，提交NCBI公用數據庫Genbank，利用NCBI軟件的BLAST進行網上對比。對所測得的3個樹種和從GenBank得到的樹種用系統(tǒng)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件MEGA 5進行系統(tǒng)發(fā)育分析。對建樹的30種榕樹植物的葉形、葉質、果形、果實著生方式通過查閱文獻[18]進行記錄并作為聚類指標。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

以榕屬10種植物的葉片為材料，使用試劑盒提取的DNA，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示所提取的DNA質量較高，條帶單一且無拖帶現象。

2.2 ITS-PCR擴增結果

以榕屬3種植物的基因組DNA為模版，使用引物ITS1與ITS4進行PCR擴增，產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果(圖1)顯示使用該引物擴增效果較好，可以得到穩(wěn)定的條帶。根據電泳結果可知，擴增出來的DNA片段的長度約為700 bp。

2.3 ITS序列分析

將擴增獲得的榕屬3種植物的ITS序列與GenBank的ITS序列進行比對找到與樣本同源種的ITS序列27個，其所對應的GenBank序列登記號、長度和G+C含量見表1。供試榕屬3種植物擴增獲得的ITS序列全長位于757～782 bp之間，通過在GenBank對比找到的27種序列，ITS序列全長均在684～804 bp之間。

每個樹種DNA中G+C含量的數值是恒定的，不會因外界環(huán)境條件的改變而發(fā)生變化，且在同屬不同種間，G+C含量的數值也不會有很大差異。由表1可知，供試榕屬3種植物的ITS序列中，黃金榕、橡樹G+C含量均為62%，小葉榕G+C含量為63%，平均G+C含量為62.3%；在全部53種榕屬植物中，整體G+C含量在61%～66%范圍內，整體平均G+C含量為62.9%，因此整體含量差異不明顯，適于作遺傳分析。

表1 榕屬植物的GenBank序列登記號、ITS序列長度、G+C含量

2.4 系統(tǒng)發(fā)育與形態(tài)標記聚類分析

將供試的榕屬10種植物與在GenBank中同源搜索獲得的43個近緣種的ITS序列，用MEGA 5.05進行完全比對，再采用鄰接距離矩陣法(Neighbor-joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹并進行形態(tài)標記聚類分析(圖2)。選用Kimura2-parameter 參數模型，計算所得的遺傳距離(由于圖表過大，在此只統(tǒng)計遺傳距離數據)。

由榕屬30種植物的系統(tǒng)樹及形態(tài)標記熱圖可以看出：榕屬的30個種以100%的支持率被分為2大支。其中供試的3種榕屬植物全部聚在一支上，而聚類分析色塊圖也與所建的系統(tǒng)發(fā)育樹大部分相吻合。該結果與傳統(tǒng)分類基本相符，但并不完全一致。如：小葉榕與巖木瓜、綠黃葛樹、筆管榕、菩提樹、龍州榕同為榕亞屬下榕組，但從圖中可以看出：小葉榕與其他幾種不聚在一支上，系統(tǒng)發(fā)育樹和聚類圖表明小葉榕與這幾種榕屬植物關系較遠。而聚在一大支上的巖木瓜、綠黃葛樹、筆管榕、菩提樹、龍州榕理應聚在一小支上，但是巖木瓜單獨與無花果亞屬的竹葉榕、壺托榕、異葉榕及平塘榕聚為一小支上，從系統(tǒng)發(fā)育樹上看巖木瓜應歸為無花果亞屬。

榕屬中30個種的遺傳距離在0.01～0.08之間，絕大多數的遺傳距離<0.6，表明30個榕屬植物的親緣關系較近。其中小葉榕與黃金榕、勁直榕的遺傳距離分別是0.005、0.003，表明小葉榕與這2種榕樹的親緣關系非常近。

3 結論與討論

傳統(tǒng)分類學上主要以花果為特征進行分類，榕屬植物現有的分類系統(tǒng)亦然，但由于榕屬植物為隱頭花序，雌雄同株或異株，繁殖器官材料難觀察，在分類中困難重重，其中存在爭議問題頗多。榕屬植物復雜多樣的變異通過傳統(tǒng)的形態(tài)分類學很難揭示榕屬性狀的演化特點，單就葉的形狀而言，就有橢圓形、長圓形、卵形、心形等，如果過分的依賴某一個或幾個形態(tài)標記進行分類，可能會出現誤差，準確性和可靠性不高。本文通過ITS序列分析的方法可以為榕屬的分類提供很好的借鑒。從構建的系統(tǒng)樹與形態(tài)標記熱圖聯合來看，雖然與傳統(tǒng)分類大體一致但也出現了一些不相符之處，如小葉榕屬于榕屬榕組，但是它與榕屬環(huán)紋榕組的黃金榕、勁直榕親緣關系非常近。原因可能是傳統(tǒng)分類學上過分突出某一個形態(tài)特征。

植物學家們一直在努力尋找從多學科手段上可用于系統(tǒng)分類的證據。近年來，ITS序列分析已廣泛應用于植物科、亞科、族、屬和種間系統(tǒng)學研究[19—22]，但在不同的分類等級上，ITS序列所具有的價值是不一樣的。對大多數被子植物來說，ITS序列具有十分明顯的同步進化，其眾多拷貝已變得高度相似或一致化，因此在一定程度上克服了非同源的障礙，另外在許多類群內ITS序列的替代速率是基本穩(wěn)定的[23]。這樣通過ITS構建的系統(tǒng)分支樹就能夠反映植物的系統(tǒng)發(fā)育關系。陳紀云[24]針對榕屬植物63種，228個樣本，基于5個葉綠體基因片段和1個核基因片段(ITS)，計算了遺傳距離并構建了系統(tǒng)發(fā)育樹來檢驗所選取基因片段對樹種鑒定的能力，王雙[25]利用MP、ML和BI 3種方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據田婕[26]2006年從ITS序列矩陣的 MP和Bayesian分析結果來看，ITS在榕屬系統(tǒng)發(fā)育學中的適用性基本得到了肯定。Weiblen[27]2000年就使用ITS作為研究?？崎艑僦参锏姆肿訕擞洃玫介艑僦参锏南到y(tǒng)學研究中，對Corner的系統(tǒng)提出了質疑，并證明對于榕屬這樣一個廣泛分布于世界各地的大類群，是比較合適使用ITS 作為研究其整個類群的系統(tǒng)發(fā)育關系的分子標記。

本研究表明，供試的3個榕屬樹種(黃金榕、橡皮樹、小葉榕)及同屬27個樹種ITS序列分析與傳統(tǒng)分類學略有差異，通過這種差異可以更好地對榕屬系統(tǒng)分類提供一種可行的分類方法借鑒。筆者認為在對榕屬植物進行系統(tǒng)發(fā)育研究時，可以結合傳統(tǒng)分類和ITS提供的信息對榕屬植物系統(tǒng)進化做更為精確劃分，能使我們對榕屬系統(tǒng)進化的認識又向前跨了一步，為榕屬植物的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究提供參考。

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Construction of Phylogenetic Tree Based on ITS Sequence Analysis of someFicusSpecies

LI Sheng-xing1，CHEN Jia-lin2，ZHANG Tai-kui2，HE Xiao2，LIU Xiao-zhen1，ZHANG Han-yao1

(1.KeyLaboratoryforForestGeneticandTreeImprovement&PropagationinUniversitiesofYunnanProvince，SouthwestForestryUniversity，Kunming650224，Yunnan，China；2.KeyLaboratoryofBiodiversityConservationinSouthwestChina，StateForestAdministration，SouthwestForestryUniversity，Kunming650224，Yunnan，China)

Using the leaves ofFicusmicrocarpa，F.elastic，F.concinna，F for ITS-PCR amplification，and then sequencing analysis was carried on.The ITS sequences (27 ITS sequences which had high scores with homology comparison were downloaded from NCBI) was used to build a phylogenetic tree to analyze their genetic evolutionary relationships.Resμlts showed that：It is different between based on ITS sequence analysis and traditional taxonomy，By combining the ITS identification and morphological classification can provide a reference for future classification ofFicus.

Ficus；ITS sequence analysis；Phylogenetic tree

2015-06-02；

2015-09-01

國家林業(yè)局948項目(2012-4-62)；國家自然科學基金項目(31360404)

李升星(1989—)，女，江西宜春人，西南林業(yè)大學云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室在讀碩士研究生，從事林業(yè)生物技術研究。E-mail：shengxing_555@126.com。

張漢堯(1975—)，男，福建永定人，西南林業(yè)大學云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室教授，博士，碩士生導師，從事植物和微生物分子遺傳研究。E-mail：hanyaoz@163.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.01.002

Q949

A

1002-7351(2016)01-0009-05