殼聚糖和核黃素誘導裸仁美洲南瓜對白粉病抗性的研究

竇劍兵,　張樹武,　王衛(wèi)雄,　梁巧蘭,　徐秉良

(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院, 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室, 甘肅省草業(yè)工程實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 蘭州　730070)

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殼聚糖和核黃素誘導裸仁美洲南瓜對白粉病抗性的研究

竇劍兵,張樹武,王衛(wèi)雄,梁巧蘭,徐秉良*

(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院, 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室, 甘肅省草業(yè)工程實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 蘭州730070)

采用噴霧接種法測定了不同濃度殼聚糖(chitosan)和核黃素(riboflavin)誘導裸仁美洲南瓜對白粉病菌(Podosphaeraxanthii)抗性的研究。結果表明,經400 μg/mL殼聚糖和753 μg/mL核黃素處理后,其病情指數顯著低于對照,僅為7.10和8.14,且誘導抗病效果較為顯著,分別為80.70%和77.86%,誘導抗病持久期可延續(xù)15 d。誘導后相關生理生化指標測定結果表明,隨著處理時間的增加,葉片中POD、PAL和PPO活性總體呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,且處理顯著高于對照。殼聚糖處理后POD、PAL和PPO活性分別于第3、5和7天達到峰值;核黃素處理后POD和PAL活性于第5天達到峰值,而PPO活性則于第7天達到峰值。

殼聚糖;核黃素;白粉病菌;誘導抗病性

南瓜白粉病在南瓜的整個生育期內均可發(fā)生,尤其在南瓜的生長后期,可以導致植株提早枯死,產量降低,品質下降,造成嚴重的經濟損失。長期以來,人們對南瓜白粉病的控制主要采用抗病品種和化學藥劑,但抗病育種工作存在一定局限性,殺菌劑的使用存在殘留、殘毒、污染環(huán)境等問題[1-2],因此,尋找一種高效、低殘留、無污染的新的防治植物病害的途徑迫在眉睫。

植物誘導抗病具有非?；院蜔o公害等特點,是近年來植物病害防治中代替化學防治的新技術和新方法,受到人們的廣泛重視[3-5]。目前,殼聚糖和核黃素是人們普遍使用的兩種植物誘抗劑,均可以誘導植物細胞發(fā)生一系列的抗性反應,最終增強植物的抗病性[6-9]。鐘小剛等[10]報道殼聚糖誘導蘋果葉片對斑點落葉病菌(AlternariamaliRoberts)產生一定的抗病性,杜文超等[11]報道外施核黃素誘導小麥對白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)產生抗性,裴冬麗等[12]報道核黃素誘導番茄幼苗對白粉菌產生抗性,但是目前有關殼聚糖和核黃素誘導裸仁美洲南瓜對白粉病抗性方面尚未見報道。本試驗以殼聚糖和核黃素為誘抗劑,通過盆栽接種和保護性酶的測定研究了殼聚糖和核黃素對裸仁美洲南瓜抗白粉病誘導的作用,以期為南瓜白粉病的防治提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料及菌種

供試材料由武威金蘋果有限責任公司提供,品種為裸仁美洲南瓜高代自交姊妹系 ‘04LAg-26-28’。

裸仁美洲南瓜白粉病菌(Podosphaeraxanthii)采自武威金蘋果公司田間發(fā)病植株,并接種于甘肅農業(yè)大學植物病理實驗室室內裸仁美洲南瓜盆栽苗擴繁培養(yǎng)備用。

1.1.2供試藥劑

殼聚糖(chitosan):化學名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖,淡黃色粉末,脫乙酰度≥91%，西安裕華生物科技有限公司。

核黃素(riboflavin):化學名稱為7,8-二甲基-10-(1′-D-核糖基)-異咯嗪。上海笛柏化學品技術有限公司。

1.2方法

1.2.1白粉菌分生孢子懸浮液配制

在超凈工作臺上用毛筆輕輕將南瓜苗上培養(yǎng)的白粉菌分生孢子刷于盛有0.5‰ SDS水溶液的燒杯中,混勻后鏡檢,使孢子濃度為10×10倍鏡下50～60個分生孢子/視野。

1.2.2殼聚糖和核黃素對裸仁美洲南瓜白粉菌的抑菌活性測定

將南瓜種子放入盛有滅菌水的燒杯中浸泡12 h，使種子充分吸水后放在裝有浸水海綿的盤子里,將種子鋪平用紗布蓋住,置于28℃培養(yǎng)箱中催芽,待種子露白時將其種于底部帶孔育苗缽中于室溫下培養(yǎng),以滅菌的園土∶沙=2∶1的混合土為育苗基質,當幼苗長出第2片真葉時,選擇長勢一致、健壯的幼苗供接種用。待南瓜植株第2片真葉充分展開時,用濃度為100、200、300、400、500 μg/mL的殼聚糖和濃度為188、376、565、753、941 μg/mL的核黃素分別噴霧處理裸仁美洲南瓜,以植株葉片全部濕潤為標準,用清水噴霧為對照,并采用噴霧法接種白粉病菌,分別于接種12、24和36 h后采用隨機取樣法對各盆栽苗上、中、下各部葉片進行取樣并打取葉圓片,按照Kuzuya等[13]的方法用乙醇-乳酚油在80℃條件下水浴脫色至透明,用考馬斯亮藍染色后在顯微鏡(10×40)下觀察裸仁美洲南瓜葉片上分生孢子的萌發(fā)情況,統(tǒng)計分生孢子萌發(fā)數并通過下式計算分生孢子萌發(fā)率。試驗重復3次,每個重復至少取20個葉圓片,每個葉圓片觀察50個分生孢子。

1.2.3不同濃度殼聚糖和核黃素誘導裸仁美洲南瓜抗病性測定

待瓜苗第2片真葉充分展開時,用濃度為100、200、300、400、500 μg/mL的殼聚糖和濃度為188、376、565、753、941 μg/mL的核黃素分別噴霧,以植株葉片全部濕潤為標準,用清水噴霧作對照。處理后7 d進行接種,室溫保濕24 h后移至溫室內培養(yǎng),接種后7 d調查發(fā)病情況,每處理3個重復,南瓜白粉病病情分級標準參照王建設等的方法[14-15]。

誘導效果(%)=

1.2.4殼聚糖和核黃素誘導裸仁美洲南瓜抗白粉病持久期測定

選用殼聚糖與核黃素5種濃度處理誘抗效果最佳的濃度對南瓜2葉期幼苗進行處理,分別于處理后1、5、7、9、11、15 d進行接種,方法同上。接種后7 d調查發(fā)病情況,以噴清水作對照,每處理3個重復。

1.2.5殼聚糖和核黃素誘導后對POD、PPO和PAL酶活性的影響

采用濃度為400 μg/mL的殼聚糖和濃度為753 μg/mL核黃素噴霧處理第2片真葉充分展開的裸仁美洲南瓜,以植株葉片全部濕潤為標準,用清水噴霧為對照,于誘導處理后1、3、5、7、9 d采用隨機取樣法對各盆栽苗上、中、下各部葉片進行取樣,并參照莊霞等[16]的方法用TU-1810紫外分光光度計進行POD、PPO和PAL酶活性測定。

2　結果與分析

2.1殼聚糖和核黃素誘導裸仁美洲南瓜葉片抑菌活性測定

經5種不同濃度的殼聚糖和核黃素分別處理南瓜葉片并接種白粉菌后,結果表明:不同濃度的殼聚糖和核黃素對南瓜白粉菌分生孢子的萌發(fā)均沒有明顯影響,且經不同濃度的殼聚糖和核黃素處理后白粉菌分生孢子的萌發(fā)率與對照相比無顯著性差異(表1)。

2.2不同濃度殼聚糖和核黃素誘導裸仁美洲南瓜抗病性測定

用不同濃度的殼聚糖和核黃素分別處理2葉期裸仁美洲南瓜葉片進行誘導抗病性測定,結果表明:經不同濃度的殼聚糖和核黃素處理后植株病情指數明顯低于對照植株,其中400 μg/mL的殼聚糖和753 μg/mL的核黃素處理后病情指數最低,分別為7.10和8.14;不同濃度殼聚糖和核黃素對裸仁美洲南瓜葉片的誘抗效果隨濃度升高而增強,其中殼聚糖濃度為400 μg/mL和核黃素濃度為753 μg/mL的誘抗效果最好,分別為80.70%和77.86%(表2)。

表1　不同濃度殼聚糖和核黃素對白粉菌分生孢子的影響1)Table 1　Effects of different concentrations of chitosan and riboflavin on spore germination of Podosphaera xanthii

1) 表中數據均為3次重復的平均值。表中大、小寫字母分別表示在0.01水平和0.05水平各處理間的差異性,下同。

The data in the table are means of three repetitions. The capital and lower-case letters represent the differences among treatments at the 0.01 and 0.05 levels,respectively. The same below.

表2　殼聚糖和核黃素對裸仁美洲南瓜葉片的誘抗效果Table 2　Effects of induced-resistance by chitosan and riboflavin to Cucurbita pepo leaves

2.3殼聚糖和核黃素誘導美洲南瓜抗白粉病持久期測定

通過噴霧接種法對殼聚糖(400 μg/mL)和核黃素(753 μg/mL)誘導南瓜幼苗后抗白粉的持久性測定,結果表明:兩種誘導劑在不同時間間隔均能誘導南瓜幼苗產生抗病性(圖1)。殼聚糖和核黃素的誘導效果隨著時間的推移均先增加后減小,其中殼聚糖處理7 d后,誘導效果達到最高，為79.25%,核黃素處理9 d后,誘導效果達到最高，為77.63%。此外,隨著時間的推移殼聚糖和核黃素兩種誘導劑的誘導效果雖在減小但并沒有很快地減弱,而在處理15 d后接種兩者誘導效果均在65%以上,其誘導抗病性的持久期可延續(xù)15 d。

圖1　殼聚糖和核黃素對裸仁美洲南瓜植株誘導抗性持久期比較Fig.1　Comparison of lasting days of induced resistance between chitosan and riboflavin

2.4殼聚糖和核黃素誘導后對POD酶活性的影響

研究結果表明:經兩種藥劑誘導處理后,葉片POD酶活性明顯高于清水對照(圖2)。在第3天時殼聚糖處理POD酶活性達到峰值,為107.96 U/(min·g),相比對照升高了56.4 U/(min·g),而核黃素處理在第5天時POD酶活性達到峰值,為101.86 U/(min·g),相比對照升高了47.18 U/(min·g),達到峰值后兩者均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢。通過兩種藥劑的誘導效果比較,殼聚糖誘導后POD酶活性始終高于核黃素誘導,因此,殼聚糖對葉片POD酶活性的影響較核黃素顯著。

圖2　殼聚糖和核黃素對裸仁美洲南瓜葉片POD酶活性的影響Fig.2　Effects of chitosan and riboflavin treatment on POD activity in the leaves of Cucurbita pepo

2.5殼聚糖和核黃素誘導后對PAL酶活性的影響

經殼聚糖和核黃素誘導處理葉片后, PAL酶活性明顯高于對照,其變化趨勢為先升高后降低,與對照相似。殼聚糖和核黃素誘導處理后第5天時, PAL酶活性均達到峰值,分別為45.78、50.34 U/(min·g),與對照相比分別升高了27.52、32.08 U/(min·g),達到峰值后三者均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(圖3)。

圖3　殼聚糖和核黃素對裸仁美洲南瓜葉片PAL酶活性的影響Fig.3　Effects of chitosan and riboflavin treatment on PAL activity in the leaves of Cucurbita pepo

2.6殼聚糖和核黃素誘導后對PPO酶活性的影響

經兩種藥劑誘導處理后,葉片PPO酶活性隨時間的增長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。殼聚糖誘導后PPO酶活性明顯高于核黃素誘導及對照,而且始終高于核黃素誘導處理,兩者誘導7 d后PPO酶活性達到峰值,分別為78.28、48.55 U/(min·g)。相比對照分別升高了37.00和7.27 U/(min·g)。因此,殼聚糖和核黃素對裸仁美洲南瓜抗白粉病菌具有較強的誘導作用,但殼聚糖誘導對葉片PPO酶活性影響較大(圖4)。

圖4　殼聚糖和核黃素對裸仁美洲南瓜葉片PPO酶活性的影響Fig.4　Effects of chitosan and riboflavin treatment on PPO activity in the leaves of Cucurbita pepo

3　結論與討論

近年來,有關植物誘導抗性的研究報道較多,生物和非生物因子(如微生物、化學物質以及物理因素等)都能夠誘導植物產生抗病性[17],本文選用殼聚糖和核黃素為誘導劑對裸仁美洲南瓜進行誘導后測試其對白粉病菌的抗性,結果表明,不同濃度的殼聚糖和核黃素均能誘導裸仁美洲南瓜對白粉病產生抗性,其中濃度為400 μg/mL的殼聚糖和濃度為753 μg/mL的核黃素誘導裸仁美洲南瓜對白粉病具有顯著的抗病性,且誘導抗病持久期可持續(xù)15 d。

前期研究表明,殼聚糖和核黃素可以誘導植物細胞發(fā)生一系列的防御酶系反應,并激發(fā)植物對病原菌產生抗性[6, 18]。本研究中，經殼聚糖和核黃素處理后南瓜葉片POD和PAL酶活性明顯升高,且隨時間的增長,POD和PAL酶活性先升高后降低,這與鐘小剛等[10]報道的殼聚糖誘導蘋果葉片以及裴冬麗等[12]報道的核黃素誘導番茄幼苗POD和PAL酶活性的變化趨勢相一致。核黃素對PPO酶活性變化與對照相比影響較小,而殼聚糖誘導后葉片中PPO活性相比對照變化較大,這與陳年來等[19]報道的BTH誘導甜瓜及岳東霞等[20]報道的水楊酸誘導黃瓜葉片PPO酶活性均高于對照,且PPO酶活性先升高后降低的結果相一致。

植物誘導劑對環(huán)境無污染,有利于維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡,同時也可促進我國農業(yè)朝著可持續(xù)農業(yè)的方向發(fā)展,有著許多化學藥劑無可比擬的優(yōu)點,植物誘導抗性已成為植物病理學科的研究熱點,未來極具發(fā)展?jié)摿Α１驹囼炛会槍ぞ厶呛秃它S素對裸仁美洲南瓜葉片生理生化方面進行了研究,而關于這兩種誘導劑在實際生產中的應用以及誘導處理后分子生物學機理的研究尚未涉及,有待進一步的研究。

[1]顏惠霞, 徐秉良, 梁巧蘭, 等. 南瓜品種對白粉病的抗病性與葉綠素含量和氣孔密度的相關性[J]. 植物保護, 2009, 35(1): 79-81.

[2]梁巧蘭, 魏列新, 徐秉良. 裸仁美洲南瓜白粉病菌對幾種殺菌劑敏感性及抗藥性誘導[J]. 農藥, 2012, 11(51): 840-843.

[3]田谷, 徐秉良, 梁巧蘭, 等. 幾種化學物質誘導彩色馬蹄蓮對軟腐病抗性的研究[J]. 植物保護, 2010, 36(6): 53-57.

[4]Walters D, Walsh D, Newton A, et al. Induced resistance for plant disease control: maximizing the efficacy of resistance elicitors [J]. Phytopathology, 2005, 95(12): 1369-1373.

[5]李玉紅, 陳鵬, 程智慧, 等. 草酸和BTH對黃瓜幼苗霜霉病抗性和胞間隙病程相關蛋白的誘導[J]. 植物病理學報, 2006, 36(3):238-243.

[6]張怡, 劉嚴, 康靜敏, 等. 殼聚糖誘導植物抗病機理的研究進展[J]. 廣東農業(yè)科學, 2011, 38(14): 82-85.

[7]Dong H, Beer S V. Riboflavin induces disease resistance in plants by acting a novel signal transduction pathway [J]. Phytopathology, 2000, 90(8): 801-811.

[8]楊飛飛, 董漢松. 核黃素誘導番茄抗病性與Pti蛋白激酶基因表達[J].魯東大學學報(自然科學版), 2009, 25(1): 59-64.

[9]Wang S, Tzeng D D. Methionine-riboflavin mixtures with surfactants and metal ions reduce powdery mildew infection in straw berry plants [J]. Journal of the American Society for Horticultural Science, 1998, 123(66): 987-991.

[10]鐘小剛,薛應鈺,梁巧蘭,等.水楊酸和殼聚糖誘導蘋果葉片對斑點落葉病抗性的研究[J].植物保護,2013,39(4):20-24.

[11]杜文超, 劉昌來, 董漢松. 外施核黃素誘導小麥對白粉病菌的抗性[J]. 華北農學報, 2011, 26(5): 230-233.

[12]裴冬麗, 丁錦平, 張慶深, 等. 核黃素誘導番茄幼苗抗白粉菌機理研究[J]. 河南師范大學學報(自然科學版), 2012, 40(5): 121-124.

[13]Kuzuya M, Hosoya K, Yashiro K, et al. Powdery mildew (Sphaerothecafuliginea) resistance in melon in selectable at the haploid level [J]. Journal of Experimental Botany, 2003, 54: 1069-1074.

[14]王建設, 唐曉薇, 孟淑春, 等. 甜瓜白粉病抗源鑒定與抗性遺傳分析[J]. 華北農學報, 2002,17(3): 124-128.

[15]王建設, 陳杭. 甜瓜抗白粉病鑒定[J]. 華北農學報, 2000, 15(1): 125-128.

[16]莊霞, 馬強, 劉曉燕. 青霉素處理蘋果樹腐爛病SOD、POD、PAL、PPO的變化[J]. 內蒙古農業(yè)科技, 2008(4): 54-56.

[17]Tian Shiping， Chan Zhulong. Potential of induced resistance in postharvest diseases control of fruits and vegetables [J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2004, 34(5): 385-394.

[18]孫溶溶, 彭真, 程琳, 等. BTH誘導花椰菜對菌核病的抗性研究[J]. 植物病理學報, 2012, 42(3): 281-289.

[19]陳年來, 朱振家, 代春艷, 等. BTH誘導不同抗性水平甜瓜抗白粉病的效應[J]. 果樹學報, 2010, 27(5): 764-769.

[20]岳東霞, 張要武, 張金林, 等. 水楊酸對黃瓜植株抗病酶系和白粉病抗性的誘導作用[J]. 河北農業(yè)大學學報, 2003, 26(4): 14-17.

[21]侯琿, 朱建蘭, 周紅平, 等. BTH和水楊酸(SA)對甜瓜抗白粉病的誘導作用[J]. 果樹學報, 2006, 23(5): 736-739.

[22]Jordan C M, Wakeman R J, Devey J E. Toxicity of free riboflavin and methionine riboflavin solutions toPhytophthorainfestansand the reduction of potato late blight disease [J]. Canadian Journal of Microbiology, 1992, 38(11): 1108-1111.

[23]Taheri P, Hofte M. Riboflavin induces resistance in rice againstRhizoctoniasheath diseases by activating signal transduction pathways leading to upregulation of rice cationic; peroxidase and formation of lignin as a structural barrier [J]. Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences, 2006, 71(1):255-258.

(責任編輯：田喆)

Resistance ofCucurbitapepoagainstPodosphaeraxanthiiinduced by chitosan and riboflavin

Dou Jianbing,Zhang Shuwu,Wang Weixiong,Liang Qiaolan,Xu Bingliang

(Pratacultural College of Gansu Agricultural University, Key Laboratory of Grassland Ecosystem Ministry of Education, Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province, Sino-US Center for Grazingland Ecosystem Sustainability, Lanzhou730070, China)

The inhibitory and resistant effects ofCucurbitapepoagainst powdery mildew (Podosphaeraxanthii) were determined by different concentrations of chitosan and riboflavin through spraying method in this experiment. The results showed that the disease index was significantly lower than the control, and the disease indexes were only 7.10 and 8.14, respectively, after chitosan (400 μg/mL) and riboflavin (753 μg/mL) induction. However, the induced-resistance effects were stronger, which were 80.70% and 77.86%, respectively. The disease-resistance lasting period was 15 d. The induced physiological and biochemical index determination results showed that the POD, PAL and PPO activities were significantly higher than the control, and with the increase of time, the POD, PAL and PPO activities increased at first and then decreased. The maximum activities of POD, PAL and PPO were observed at the 3rd, 5th and 7th day after chitosan induction. The maximum activities of POD and PAL were observed at the 5th day, but maximum activities of PPO was observed at the 7th day after riboflavin induction.

chitosan;riboflavin;Podosphaeraxanthii;induced resistance

2014-12-21

2015-02-07

國家自然科學基金(31460518)

E-mail：xubl@gsau.edu.cn

S 436.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.012