牛大力種子組培快繁技術(shù)研究

時 群， 陳麗文， 陳乃明， 何貴整， 楊利平， 梁 剛， 蔡 林

(廣西欽州市林業(yè)科學研究所，廣西欽州 535000)

?

牛大力種子組培快繁技術(shù)研究

時 群， 陳麗文， 陳乃明， 何貴整， 楊利平， 梁 剛， 蔡 林

(廣西欽州市林業(yè)科學研究所，廣西欽州 535000)

[目的]研究牛大力組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)。[方法]以牛大力種子為外植體，采用以芽繁芽途徑，比較3種不同種源牛大力種子無菌發(fā)芽率、繼代增殖、生根培養(yǎng)的表現(xiàn)差異。[結(jié)果]以MS+6-BA 0.4 mg/L+ NAA 0.2 mg/L為誘導培養(yǎng)基, 種子無菌發(fā)芽率分別為98.23%、92.13%和95.01%；以改良MS+6-BA 0.6 mg/L + IBA 0.3 mg/L+KT 0.2 mg/L為繼代增殖培養(yǎng)基，添加半胱氨酸8 mg/L, FeSO4·7H2O加至MS用量的1.2倍， 增殖系數(shù)分別達5.57、3.20、5.30；以1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L、1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 3.0 mg/L、1/2MS+ NAA 1.5 mg/L+ IBA 1.0 mg/L為生根培養(yǎng)基，生根率分別達78.00%、67.33%、70.33%；生根苗移栽在V黃心土∶V細河沙∶V泥炭土=8∶1∶1基質(zhì)中培育60 d后，成活率分別達94.00%、85.43%和89.97%。采用控根容器培育大苗，可實現(xiàn)育苗與種植同步。[結(jié)論]該研究為牛大力種苗快速繁殖及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

牛大力；組織培養(yǎng)；種子；種源

牛大力(MillettiaspeciosaChamp.)為蝶形花科雞血藤屬藥食兩用植物，又名美麗崖豆藤、甜牛大力、扒山虎、大力薯、山蓮藕，主治肺熱、肺虛咳嗽、肺結(jié)核、風濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、慢性支氣管炎、慢性肝炎等[1-2]，是生產(chǎn)多種中成藥的主要原料。其主產(chǎn)于我國廣東、廣西、海南和越南，不同牛大力種源葉片、花、果及薯的形態(tài)、長勢表現(xiàn)各異[3-4]，根系穿透力強，輻射范圍大[5]。近年來，隨著市場需求與日劇增，對牛大力苗木繁殖技術(shù)研究也逐漸深入和全面，主要有播種育苗、扦插育苗和組培育苗[6-11]，組培育苗作為牛大力苗木規(guī)?；敝车挠行Х椒ㄖ?，目前多采用幼嫩莖段為外值體，消毒較困難[12]，以種子為材料通過愈傷組織途徑進行組培快繁已有研究[13],尚未見以種子為材料通過以芽繁芽途徑進行牛大力組培快繁研究的報道。不同種源植株組織培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基不同[14-16]，筆者以3種不同種源的牛大力種子為材料，采用無菌萌發(fā)芽苗帶腋芽莖段為材料，建立以芽繁芽組培快繁體系，并采用控根容器培育大苗[17],可實現(xiàn)育苗與種植同步。

1　材料與方法

1.1材料試驗所用牛大力種源分別來自廣西欽州(Ⅰ)、廣西上林(Ⅱ)、海南五指山(Ⅲ)，引進種植在欽州市林業(yè)科學研究所林地3年，采收成熟新鮮莢果種子。

1.3方法

1.3.1種子無菌萌發(fā)。11月至次年1月果實成熟時采收，分2種處理。處理①：當天剝開果殼，取出種子作為外植體，溫開水冷至30 ℃浸泡4 h，在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡5 s，再用0.1%HgCl2溶液消毒10 min，無菌水沖洗5次。在無菌條件下，點播在發(fā)芽培養(yǎng)基①上，每瓶點播1粒種子，接種40瓶，先暗培養(yǎng)7 d，選取獲得的無菌種子，置于弱光下培養(yǎng)， 觀察種子萌動時間，50 d后統(tǒng)計發(fā)芽率及每株腋芽數(shù)，重復3次；處理②：剝開果殼，取出種子，室內(nèi)放置30 d，取種子消毒后點播在發(fā)芽培養(yǎng)基①上進行無菌萌發(fā)，同處理①。

1.3.2芽繼代增殖培養(yǎng)。待種子萌發(fā)的無菌苗長至5～6 cm時，剪取上部約4 cm長帶腋芽莖段，剪成2段，每段帶2個腋芽，橫放接種至培養(yǎng)基②～⑦上進行增殖培養(yǎng)，接種30瓶，重復3次，培養(yǎng)30 d觀察芽生長情況并統(tǒng)計增殖系數(shù)。種子剪去部分根，保留約1 cm長的根，連同上部帶1個腋芽的莖一起轉(zhuǎn)至新配制的培養(yǎng)基中，繼續(xù)誘導培養(yǎng)萌發(fā)新芽。

1.3.4煉苗移栽及幼苗管護。將生根組培苗在自然光下煉苗10～15 d，待小苗充分木質(zhì)化，開蓋2 d，噴水保濕，取出洗去培養(yǎng)基，移栽在3種不同基質(zhì)中：黃心土(J1)、黃心土：細河沙(J2，體積比9∶1)、黃心土∶細河沙∶泥炭土(J3，體積比8∶1∶1)，用16cm×14cm的營養(yǎng)袋裝好備用。移栽場所選在覆蓋塑料薄膜及黑網(wǎng)的大棚內(nèi)，棚內(nèi)相對濕度保持在70%～90%，溫度控制在30 ℃以下，交替噴施殺菌劑、葉面肥和復合肥，30 d后統(tǒng)計成活率。

1.3.5控根容器栽種。組培苗木移栽180 d后，待苗高20～50 cm，地徑0.2 cm以上，葉片有5片以上即可出圃栽種至直徑40 cm、高60 cm控根容器中，基質(zhì)用黃心土∶細河沙∶泥炭土(體積比8∶1∶1)，用地布覆蓋地面，栽種100株；另將組培苗栽種在大田中作為對照，株行距0.8 m×1.0 m。栽種時間達30 d時，每種栽培方式隨機抽取10株，觀察根生長情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理采用DPS軟件對以上各處理的3次重復數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，用Duncan法進行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1種子放置時間對發(fā)芽率的影響 采集新鮮牛大力莢果，用當天剝開果殼的種子和放置30 d的種子作為外植體，消毒處理后接種在培養(yǎng)基①中進行無菌芽萌發(fā)，50 d統(tǒng)計種子發(fā)芽率，結(jié)果見表1。 從表1可以看出，采用當天剝開果殼取出的種子作為外植體，種子萌動時間10～12 d，比放置30 d的種子萌動時間早10 d左右；種子發(fā)芽率也較高，與同種源室內(nèi)放置30 d的種子相比，種子發(fā)芽率差異顯著；不同種源之間，種子發(fā)芽率無顯著差異；當種子萌出的芽苗長至5～6 cm，每株芽苗段萌發(fā)的腋芽有7～8個可用于擴繁增殖。帶1個腋芽的種子轉(zhuǎn)至新配制的培養(yǎng)基中，繼續(xù)誘導萌發(fā)2～5株叢生新芽，可重復2次，能為莖段增殖提供20～30個帶腋芽莖段。

表1　種子放置時間對發(fā)芽率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。Ⅰ為廣西欽州牛大力，Ⅱ為廣西上林牛大力，Ⅲ為海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and 0.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

2.2不同培養(yǎng)基對繼代增殖的影響由表2可知，種子無菌苗帶腋芽莖段經(jīng)30 d增殖培養(yǎng)，不同種源牛大力種子無菌苗帶腋芽莖段在不同培養(yǎng)基中生長情況不同，同種源牛大力在不同培養(yǎng)基中增殖系數(shù)差異極顯著，均在⑦號培養(yǎng)基中表現(xiàn)最佳，繼代增殖30 d，廣西欽州牛大力增殖系數(shù)達5.57，廣西上林牛大力增殖系數(shù)達3.20，海南五指山牛大力增殖系數(shù)達5.57，對培養(yǎng)基⑦中3種源牛大力種子無菌苗莖段增殖系數(shù)進行方差分析，結(jié)果表明，不同種源間差異極顯著。

2.4不同基質(zhì)對移栽成活率的影響由表4可知，不同基質(zhì)對牛大力移栽成活率有較大影響，廣西欽州、廣西上林、海南五指山牛大力在J3基質(zhì)中移栽成活率分別達94.00%、85.43%、89.97%，最高的是廣西欽州牛大力；在J1基質(zhì)中，移栽成活率較低，分別為77.03%、70.87%、72.10%；在J2基質(zhì)中，移栽成活率比J1高，分別為84.57%、75.60%、80.43%，

表2　不同培養(yǎng)基對繼代增殖的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。Ⅰ為廣西欽州牛大力，Ⅱ為廣西上林牛大力，Ⅲ為海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and 0.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

表3　 不同培養(yǎng)基對誘導生根的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。Ⅰ為廣西欽州牛大力，Ⅱ廣西上林牛大力，Ⅲ海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and 0.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

但苗木生長中少數(shù)葉逐漸變黃，生長緩慢。方差分析結(jié)果表明，不同種源牛大力移栽成活率和不同基質(zhì)間移栽成活率達極顯著水平。牛大力苗木在黏性強、通透性差的J1基質(zhì)中，生長緩慢，移栽成活率低；在疏松的J2和 J3基質(zhì)中，移栽成活率較高，增施有機肥泥炭土的J3基質(zhì)中成活率最高，且苗木莖軸伸長，葉色翠綠。

表4 不同基質(zhì)對移栽成活率的影響

Table 4 Effects of different transplanting medium on survival rate

%

注：同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。Ⅰ為廣西欽州牛大力、Ⅱ廣西上林牛大力、Ⅲ海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and o.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

2.5牛大力在控根容器中的生長情況由表5可知，與大田栽種相比，利用控根容器栽種的牛大力根數(shù)多，根總重量大，平均根長略短于大田栽種的牛大力。

3　 結(jié)論與討論

3.1種子放置時間對發(fā)芽率的影響以牛大力種子作為外植體進行無菌萌發(fā)，解決了牛大力種子自然萌發(fā)時間長的問題，一粒種子通過重復誘導，能為繼代繁殖提供20～30個無菌材料，保證以芽繁芽方式進行組培擴繁材料來源充足。3種源牛大力種子在無菌條件下，經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)，溫度在25～28 ℃下均有較高的發(fā)芽率，與室外進行牛大力種子萌發(fā)特性研究一致[7]，當天剝開果殼的種子比放置30 d的種子萌動時間早、發(fā)芽率高。

3.2繼代增殖存在的問題3種源牛大力種子無菌苗莖段在不同培養(yǎng)基中增殖系數(shù)和生長情況不同，均在改良MS+6-BA 0.6 mg/L+ IBA 0.3 mg/L+KT 0.2 mg/L+半胱氨酸8 mg/L +1.2倍FeSO4·7H2O用量(MS)培養(yǎng)基中表現(xiàn)最佳，在其他培養(yǎng)基中表現(xiàn)出一定缺陷:①芽玻璃化。③號培養(yǎng)基與②號培養(yǎng)基相比，對MS培養(yǎng)基進行了改良，降低了銨態(tài)氮濃度，提高了硝態(tài)氮含量，芽苗玻璃化減少；②褐化。④號培養(yǎng)基加入半胱氨酸，芽苗褐化消失；③莖基部產(chǎn)生異常愈傷組織。⑤號培養(yǎng)基將④號培養(yǎng)基中的生長素NAA改為IBA,莖基部產(chǎn)生異常愈傷組織減少，有利于芽苗生長；④無葉片分化。⑥號培養(yǎng)基在⑤號培養(yǎng)基的基礎上加入KT,芽苗分化出的葉片增多；⑤葉黃白色。⑦號培養(yǎng)基在⑥號培養(yǎng)基的基礎上加大FeSO4·7H2O用量后，芽苗葉片由黃白色轉(zhuǎn)為翠綠色。通過不斷優(yōu)化MS培養(yǎng)基，有效解決了牛大力繼代培養(yǎng)過程中存在的問題，促進芽苗分化復葉，葉片變綠，莖軸伸長、粗壯，保持芽苗3～5倍的增殖系數(shù)。

表5　牛大力在控根容器中及大田栽種生長情況

3.3生根培養(yǎng)基的篩選以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的生長素配比，3種源牛大力無菌芽苗在低濃度生長素配比 NAA 0.6 mg/L+ IBA 0.4 mg/L中，莖基部褐化，不生根。通過提高激素配比，無菌芽苗生根率提高，不同種源牛大力芽苗生根所需的NAA 和 IBA 濃度不同，添加的NAA濃度太大，莖基部形成膨大的愈傷組織，生根質(zhì)量差。牛大力生根較困難，要提高生根質(zhì)量，需進一步調(diào)試生根培養(yǎng)基。

3.4基質(zhì)對移栽成活率的影響生根質(zhì)量對移栽成活率有較大影響，莖基部膨大成愈傷組織，從愈傷組織中生出的根易斷，移栽成活率低，直接從莖皮部生出的根不易斷，移栽成活率高。不同基質(zhì)對牛大力移栽成活率有較大影響，在疏松的黃心土、細河沙、泥炭土混合基質(zhì)中移栽成活率高，在黏性強、易板結(jié)、通透性差的黃心土中栽成活率低。

3.5牛大力在控根容器中根生長情況 利用控根容器栽種的一年生牛大力根短而粗，根數(shù)多，根總重量大。由于牛大力的根系穿透力強，輻射范圍大，采收時挖掘的人力成本大，利用控根容器培育大苗及栽種，扭開螺釘即可觀測及采收，達到既省工又高產(chǎn)的效果，對2年及多年生牛大力的根生長情況有待進一步觀察。

[1] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標準(1990年版)[S].南寧:廣西科學技術(shù)出版社,1992.

[2] 全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編：上冊[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社,1986:200.

[3] 段左俊,曾祥全,陳飛飛,等.牛大力的品種選育試驗研究[J].熱帶林業(yè),2014,42(4):15-18.

[4] 段左俊,曾祥全,陳飛飛,等.牛大力的生物學特性及其栽培管理[J].熱帶林業(yè),2011,39(4):22-25.

[5] 段左俊,趙俊忠,曾祥全,等.牛大力的套種模式研究[J].熱帶林業(yè),2013,41(2):14-18.

[6] 黃秋銀,胡東南,陳述富,等.牛大力種子發(fā)芽研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,37(34):16845-16846.

[7] 姚紹嫦,白隆華.牛大力種子萌發(fā)特性研究[J].種子，2012,31(8):36-38.

[8] 段左俊,曾祥全,陳飛飛,等.牛大力扦插繁育試驗[J].熱帶林業(yè),2013,41(4):9-13.

[9] 潘穎南,張向軍,蒙平,等.藥用植物牛大力組織培養(yǎng)初探[J].廣西農(nóng)業(yè)科學,2010,41(6):523-525.

[10] 黃碧蘭,徐立,李志英,等.牛大力莖段組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(32):13993-13994.

[11] 韋鵬霄,李冬萍,岑秀芬,等.外源激素對牛大力無菌芽增殖的影響[J].岳陽職業(yè)技術(shù)學院學報,2013,28(4):80-85.

[12] 時群,韋大器,陳麗文,等.牛大力莖段組織培養(yǎng)污染率控制方法的初步研究[J].廣西中醫(yī)學院學報,2007,10(3):63-64.

[13] 王祝年,李志英,徐立,等.牛大力的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學通訊,2005,41(6):800.

[14] 王靜華,候建生,劉桂林.等.兩種不同種源地白榆的組織培養(yǎng)與葉片再生研究[J].中國農(nóng)學通報,2009,25(5):110-115.

[15] 劉濤,張雪梅,趙銀河.大花蕙蘭種子組織培養(yǎng)條件的探索[J].種子,2014,33(3):86-88.

[16] 李榮珍.鐵皮石斛種子試管苗的快速繁殖研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2012,39(14):22-24.

[17] 玄成龍,李冬梅,刑建軍,等.控根容器栽培對田櫻桃生長發(fā)育的影響[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011(15):112-114.

Study on Tissue culture and Rapid Prapagation ofMillettiaspeciosaSeeds

SHI Qun, CHEN Li-wen, CHEN Nai-ming et al

(Qinzhou Forestry Research Institute, Qinzhou, Guangxi 535000)

[Objective] The aim was to research the tissue culture and rapid propagation ofMillettiaspeciosa. [Method] UsingM.speciosaseeds as explant, the seeds germination rate, the proliferation coefficient, the rooting rate ofM.speciosafrom three provenances were compared. [Result] The results showed that the seeds germination rate was 98.23%, 92.13% and 95.01% respectively under sterile condition in medium of MS+6-BA 0.4 mg/L+ NAA 0.2 mg/L, the proliferation coefficient was 5.57, 3.20 and 5.30 respectively in medium of modified MS+6-BA 0.6 mg/L + IBA 0.3 mg/L+KT 0.2 mg/L, added with cysteine 8 mg/L and 1.2 times of FeSO4·7H2O to MS, the rooting rate was 78.00%, 67.33% and 70.33% respectively in medium of 1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L,1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 3.0 mg/L and 1/2MS+ NAA 1.5 mg/L+ IBA 1.0 mg/L, and the transplanting survival rate was 94.00%, 85.43% and 89.97% respectively on yellow subsoil, fine sand and peat soil at the rate of 8∶1∶1. The root controlling container seedlings cultivation, breeding and planting can achieve synchroniaztion. [Conclusion] The research can provide the scientific basis for seedling rapid propagation and industrial production ofM.speciosa.

MillettiaspeciosaChamp.; Tissue culture; Seed; Provenances

欽州市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(20143002)。

時群(1970- )，女，廣西全州人，高級工程師，從事植物生物技術(shù)研究與推廣應用工作。

2016-05-20

S 188

A

0517-6611(2016)21-138-04