細(xì)胞穿透型HO-1蛋白對協(xié)調(diào)性異種心臟移植急性排斥反應(yīng)的作用

鄭祥韜 戴駒驥 徐東宇 裘益輝 楊法鏡 虞冠鋒

細(xì)胞穿透型HO-1蛋白對協(xié)調(diào)性異種心臟移植急性排斥反應(yīng)的作用

鄭祥韜 戴駒驥 徐東宇 裘益輝 楊法鏡 虞冠鋒

目的 探討一種新型的細(xì)胞穿膜肽（PTD）整合的血紅素氧合酶-1（HO-1）蛋白對協(xié)調(diào)性異種心臟移植急性排斥的作用及初步機制。方法 將C57BL/6小鼠心臟移植至Wistar大鼠頸部，建立協(xié)調(diào)性異種心臟移植模型，將其隨機分成單純移植組（control）、PTD整合熒光蛋白對照組（移植術(shù)后腹腔注射PTD-GFP 10mg/d）和PTD-HO-1蛋白治療組（移植術(shù)后腹腔注射PTD-HO-1 1mg/d），觀察移植心臟存活時間。取移植后48h小鼠心臟，HE染色觀察心臟組織結(jié)構(gòu)，免疫組化染色觀察CD4和CD8陽性T細(xì)胞浸潤情況，蛋白印記雜交法測定心臟移植物HO-1蛋白的表達(dá)。取移植后48 h大鼠血清，ELISA試劑盒檢測血清免疫復(fù)合物IgM水平及細(xì)胞炎癥因子IL-2和IFN-γ水平。結(jié)果 PTD-HO-1組移植心臟存活時間（6.17±1.17）d明顯高于單純移植組（2.67±0.52）d和PTD-GFP組（2.83±0.41）d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。移植術(shù)后48 h，PTD-HO-1組移植心臟組織結(jié)果破壞程度較其他兩組輕，CD4和CD8陽性T細(xì)胞浸潤情況較其他兩組明顯減輕，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。PTD-HO-1組受體血清IgM、IL-2和IFN-γ水平明顯低于其他兩組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而心臟移植物組織內(nèi)HO-1表達(dá)水平明顯高于其他兩組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 PTD整合的HO-1蛋白能延長協(xié)調(diào)性異種移植心臟的存活，為HO-1在異種移植的臨床應(yīng)用提供了可能。

細(xì)胞穿膜肽 血紅素氧合酶-1 協(xié)調(diào)性異種心臟移植 急性排斥

作為治療終末期心臟衰竭患者的唯一有效手段，心臟移植在全世界得到了普遍的發(fā)展［1］。但供體器官來源的缺乏促使越來越多的學(xué)者開始嘗試異種移植的研究，來進(jìn)一步擴大器官供池。在協(xié)調(diào)性異種移植中，移植術(shù)后數(shù)天內(nèi)發(fā)生的急性血管排斥反應(yīng)（acute vascular rejection，AVR）是導(dǎo)致移植失敗的主要原因之一［2］。因此，如何延緩或減輕AVR的發(fā)生成為協(xié)調(diào)性異種移植的關(guān)鍵。在先前的研究中合成了一種新型的細(xì)胞穿透型血紅素氧合酶-1蛋白（protein transduction domain heme oxygenase-1，PTD-HO-1），大量的前期數(shù)據(jù)證明該新型蛋白具備強大的穿透能力和細(xì)胞保護(hù)功能［3］。在本實驗中，作者將該HO-1蛋白用于對抗協(xié)調(diào)性異種心臟移植的排斥反應(yīng)，并探討其保護(hù)作用的可能機制，為下一步臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑 （1）實驗動物：雄性C57BL/6小鼠18只，體重20～25 g，作為供者；Wistar大鼠，體重250～300 g，作為受者，均由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。（2）試劑：PTD-HO-1蛋白和對照用熒光蛋白（PTD-GFP）由先前研究中生產(chǎn)，保存溫度-80℃。HO-1抗體、CD4和CD8抗體購自美國Sigma公司。ELISA試劑盒購自美國Alpco公司。

1.2 實驗分組與心臟移植 （1）分組：將Wistar大鼠隨機分成A、B、C 3組，每組各6只。A組為空白對照組（control組），受者僅做單純移植處理；B組為無關(guān)蛋白對照組（PTD-GFP組），受者于移植當(dāng)天起腹腔內(nèi)注射PTD-GFP蛋白10mg/d；C組為治療組（PTDHO-1組），受者于移植當(dāng)天起腹腔內(nèi)注射PTD-HO-1蛋白10 mg/d。（2）心臟移植：遵循溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利和倫理的原則，采用二袖套法，將小鼠升主動脈和肺動脈分別與大鼠的右頸總動脈和右頸外靜脈吻合［4］。移植后每天觸摸移植心臟跳動情況，以心跳停止作為排斥反應(yīng)的終點。術(shù)后48h收割部分心臟移植物，保存于液氮中。

1.3 病理及血清學(xué)指標(biāo)檢測 （1）組織病理學(xué)：取移植術(shù)后48h心臟移植物冰凍切片直接在熒光顯微鏡下觀察，同時行HE染色觀察組織病理改變。采用免疫組化ABC法檢測細(xì)胞和組織中的CD4+和CD8+T細(xì)胞的浸潤，各切片隨機觀察10個高倍視野（×400），記錄陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。（2）血清學(xué)指標(biāo)：移植術(shù)后48h大鼠尾靜脈取血，制備血清，采用ELISA試劑盒對IgM、IL-2、IFN-γ含量進(jìn)行檢測，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。（3）HO-1蛋白測定：采用蛋白印記雜交法（WB）測定術(shù)后48 h心臟移植物HO-1蛋白的表達(dá)。以Sigma公司細(xì)胞組織快速裂解液裂解心臟移植物，Bradford法檢測蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，依次孵育HO-1一抗及相應(yīng)二抗，以WB發(fā)光試劑檢測HO-1表達(dá)量，以蛋白區(qū)帶積分吸光度值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。各組移植心臟生存時間用Kaplan-Meier方法分析，血清細(xì)胞因子、IgM抗體水平、CD4+和CD8+T細(xì)胞計數(shù)采用方差分析，計量資料組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組移植心臟的存活時間 Control組（2.67±0.52）d和PTD-GFP組（2.83±0.41）d 之間移植心臟的存活時間無明顯差異（P＞0.05），而PTDHO-1蛋白組（6.17±1.17）d移植心臟的存活時間明顯長于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 移植心臟病理學(xué)改變 PTD-HO-1蛋白組移植心臟內(nèi)心肌結(jié)構(gòu)基本正常，心肌細(xì)胞輕度腫脹。而其他兩組心肌細(xì)胞嚴(yán)重腫脹變性，部分組織出現(xiàn)溶解壞死，廣泛間質(zhì)出血，血管結(jié)構(gòu)崩解（圖1A，HE染色）。同樣，術(shù)后48h，PTD-HO-1組移植心臟炎癥浸潤情況較其他兩組明顯減輕，CD4和CD8陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3/組，P＜0.01，圖1 A～C）。通過熒光顯微鏡對PTD-GFP組心臟移植物冰凍切片進(jìn)行觀察，未發(fā)現(xiàn)明顯綠色熒光，結(jié)果顯示PTD整合的熒光蛋白并未穿透進(jìn)入心臟組織。

圖1 移植心臟術(shù)后48h病理學(xué)改變（A：HE染色，CD4和CD8免疫組化，×200。B和C：CD4和CD8陽性細(xì)胞計數(shù)，各切片隨機觀察10個高倍視野（×400）。與contro1組比較，★P＜0.01；與PTD-GFP組比較，#P＜0.01）

2.3 移植術(shù)后受體血清學(xué)指標(biāo) 心臟移植術(shù)后48h， PTD-HO-1治療組血清IL-2和IFN-γ以及抗體IgM水平明顯低于其他兩組（n=3/組，P＜0.05），而其他兩組之間無明顯差異（圖2）。

圖2 心臟移植術(shù)后48h受體血清炎癥因子及抗體表達(dá)水平（A：ELISA檢測血清IL-2水平。B：ELISA檢測血清IFN-γ水平。C：ELISA檢測抗體IgM水平。與contro1組比較，★P＜0.05；與PTD-GFP組比較，#P＜0.05）

2.4 移植心臟內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)情況 通過WB檢測術(shù)后48h心臟移植物內(nèi)HO-1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示PTD-HO-1組的HO-1表達(dá)明顯高于其他兩組（n=3/

圖3 移植心臟術(shù)后48h HO-1蛋白表達(dá)水平。（A：HO-1表達(dá)量以蛋白區(qū)帶積分吸光度值。B：蛋白印跡圖。與contro1組比較，★P＜0.01；與PTD-GFP組比較，#P＜0.01）

3 討論

在心臟移植中，供體的嚴(yán)重不足極大的限制了其發(fā)展。隨著對排斥反應(yīng)機理的深入研究，人們對異種移植（xenotransplantation）的興趣和研究快速升溫［5］。異種移植需要面臨移植后快速出現(xiàn)的兩大免疫學(xué)障礙：超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）和AVR［6］。目前，HAR的發(fā)生機制已基本研究清楚，近年大量研究工作顯示該免疫學(xué)障礙有望得到突破性發(fā)展［7］。于是AVR逐漸成為異種移植面臨的主要障礙，其特點是開始于移植后再灌注的24h內(nèi)，并在數(shù)天破壞移植物，而且傳統(tǒng)免疫抑制劑效果不理想［8］。因此，成功跨越AVR屏障對于異種移植研究具有重要意義。

HO-1是人體內(nèi)一種重要的應(yīng)激酶，研究證明誘導(dǎo)動物體內(nèi)HO-1的過表達(dá)能起到抗排斥的作用［9］，在已有的異種移植中，HO-1能明顯延長移植物的生存時間［10］，但其臨床應(yīng)用卻存在極大的限制。因為尚無一種試劑能特異性誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，而在利用HO-1的代謝產(chǎn)物CO或膽綠素時，由于其毒性將其應(yīng)用限制在一個狹小的治療窗內(nèi)。另外由于HO-1基因治療的不可控性，目前相關(guān)研究仍局限在動物實驗中。本資料中，作者利用該蛋白對抗協(xié)調(diào)性異種心臟移植中的AVR，以期利用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)為HO-1在抗排斥的臨床應(yīng)用上開辟新途徑。

本資料結(jié)果顯示，PTD-HO-1蛋白能有效延長協(xié)調(diào)性異種移植心臟的存活。根據(jù)各組移植心臟的病理表現(xiàn)，PTD-HO-1治療組T細(xì)胞的浸潤明顯減輕，說明PTD-HO-1能明顯抑制排斥中的炎癥反應(yīng)。當(dāng)AVR發(fā)生時，隨著異種T細(xì)胞的激活，繼而產(chǎn)生IL-2和IFN-r等效應(yīng)細(xì)胞因子。通過對各組血中細(xì)胞因子水平的檢測，較之其他兩組，術(shù)后48 h PTD-HO-1能明顯抑制IL-2和IFN-r水平，表明PTD-HO-1可能通過抑制T細(xì)胞進(jìn)而抑制相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。同時，通過對血清IgM的檢測，發(fā)現(xiàn)移植后PTD-HO-1組抗體水平較其他兩組更低，進(jìn)一步證明該新型HO-1蛋白延長移植心臟存活時間的作用機制可能通過抑制早期體內(nèi)IgM抗體的生成。另外，WB檢測顯示PTDHO-1組移植心臟內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)水平明顯增高，由于作者是通過腹腔注射PTD-HO-1，因此其可能生效途徑為PTD-HO-1誘導(dǎo)了供心的HO-1表達(dá)或PTDHO-1蛋白通過某種途徑到達(dá)移植心臟內(nèi)。在本資料中作者利用PTD-GFP熒光蛋白作為對照，通過對心臟切片的觀察，并未在組織中發(fā)現(xiàn)綠色熒光，因此作者更傾向于認(rèn)為PTD-HO-1通過影響受體從而誘導(dǎo)移植心臟HO-1表達(dá)的上升。

然而，該研究仍有一定的局限性，首先該新型蛋白的抗AVR機制并未得到完全的揭示，其次并未觀察不同濃度PTD-HO-1蛋白對排斥的影響，另外該蛋白的毒副作用也未做進(jìn)一步的觀察。因此，有待更多研究進(jìn)一步驗證該蛋白功能。即使本實驗存在眾多的局限，仍驗證了一種可行的HO-1應(yīng)用途徑，該新型蛋白能通過抑制供心T細(xì)胞浸潤，抑制移植受體血清IL-2和IFN-r表達(dá)水平，抑制體內(nèi)抗體IgM產(chǎn)生和促進(jìn)移植心臟HO-1蛋白表達(dá)來延長協(xié)調(diào)性異種移植心臟的存活。作為一種可產(chǎn)量化的蛋白制劑，PTD整合型蛋白為HO-1的臨床應(yīng)用提出了新的思路。

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Objective To investigate the inhibitory effect of a novel protein transduction domain（PTD）fused heme oxygenase-1（HO-1）protein on acute rejection of concordant cardiac xenograft，and its preliminary potential mechanism. Methods Stable concordant cervical cardiac xenotransplantation model of C57BL/6 mice to Wistar rats was successfully established. Randomly divided the transplanted rats into three groups：untreated group（control），PTD-GFP treated group（the rats were treated with 10mg/d PTD-GFP by intraperitoneal injection after transplantition）and PTD-HO-1 treated group（the rats were treated with 10mg/d PTD-HO-1 by intraperitoneal injection after transplantition）.The survival time of xenografts were measured and the xenografts were harvested at 48 hours after transplantation. The cardiac tissue structure were observed by haematoxylin-eosin staining. Infiltration of CD4+ T cells and CD8+ T cells in the cardiac xenografts were detected by immunohistochemistry. Expression of HO-1 in the cardiac xenografts was determined by Western blotting.The serum were collected at 48 hours after transplantition.Serum immune complex of IgM and inflammatory cytokines expression including IL-2 and TNF-α were measured by ELISA. Results Compared with the control group （2.67±0.52）d and PTD-GFP treated group（2.83±0.41）d，the survival time of xengrafts in PTD-HO-1 treated group（6.17±1.17）d improved significantly（P＜0.01）. At 48 hours after transplantition，the group treated with PTD-HO-1 exhibited lower degree of damagment in xenogragts tissue structure. And the infiltration of CD4+ T cell and CD8+ T cell in xengrafts were reduced with the treatmet of PTD-HO-1（P＜0.01）. Meanwhile，the group under PTD-HO-1 treatment result in a decrease in serum IgM，IL-2 and TNF-α campared with the other two groups（P＜0.05）. Furthermore，the protein level of HO-1 expression in xengrafts was increased with the treatment of PTD-HO-1 campared with the other two groups（P＜0.01）. Conclusions PTD fused HO-1 protein can significantly prolong concordant cardiac xenograft survival time.Protein transduction technique makes the application of HO-1 in clinical xenotransplantation for possible.

Protein transduction domain Heme oxygenase-1 Concordant cardiac xenograft Acute rejection

浙江省溫州市科技計劃項目（Y20140147）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科（鄭祥韜戴駒驥 裘一輝 楊法鏡 虞冠鋒）

20246 德國漢堡大學(xué)UKE院校（徐東宇）