鹽酸小檗堿與氫氧化鈣對(duì)白色念珠菌生物膜的體外抑制作用

李福明 汪洋★

鹽酸小檗堿與氫氧化鈣對(duì)白色念珠菌生物膜的體外抑制作用

李福明 汪洋★

目的 評(píng)價(jià)中藥有效成分鹽酸小檗堿與口腔常用根管消毒藥物氫氧化鈣對(duì)白色念珠菌生物膜作用的效果。方法 在96孔培養(yǎng)板形成白色念珠菌生物膜，用甲基四氮鹽（XTT）減低法檢測(cè)鹽酸小檗堿、氫氧化鈣兩種藥物對(duì)白色念珠菌生物膜活性的影響，用結(jié)晶紫含量測(cè)定法檢測(cè)兩種藥物對(duì)白色念珠菌生物膜生物量的影響。結(jié)果 鹽酸小檗堿在濃度為125 mg/L時(shí)使白色念珠菌生物膜活性及生物量分別減少（91.6±3.3）%和（94.2±2.5）%，生物膜已基本無(wú)活性，抑制效果優(yōu)于氫氧化鈣。結(jié)論 鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌生物膜具有抑制作用，為口腔根管消毒藥物臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

鹽酸小檗堿 氫氧化鈣 白色念珠菌 生物膜

近20年來(lái)，隨著癌癥放、化療和器官移植患者的增加，免疫抑制藥和廣譜抗生素的大量使用，以及插管等醫(yī)學(xué)材料使用的增多，白色念珠菌病的發(fā)病率增加近40倍，其中相當(dāng)一部分與白色念珠菌形成生物膜密切相關(guān)。白色念珠菌也是人口腔中的常見共生真菌，其易粘附于植入材料表面，如義齒、種植體及導(dǎo)管，并在其上形成生物膜［1］。尋找以生物膜為靶向的藥物是近年的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外研究大都集中在抗生素及抗真菌的化學(xué)藥物［2］。本研究自2014年5月至2015 年5月探討中藥黃連的主要有效成分鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌生物膜抑制效果，為口腔臨床治療真菌感染性疾病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 （1）實(shí)驗(yàn)材料：鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司）、二甲基亞砜（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、96 孔板、6 孔板（美國(guó)BD公司）。（2）試劑：蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司），酵母提取物（Oxoid公司）酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）液體培養(yǎng)基：酵母提取物10.0 g、葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、蒸餾水1000ml，分裝后121℃，15min高壓滅菌。RPMI 1640培養(yǎng)液（美國(guó)GIBCO公司），甲基四氮鹽（XTT）粉（上海生工生物工程有限公司），甲萘醌溶液（上海寶泰克生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）臨床菌株提取鑒定：杭州市口腔醫(yī)院就診患者，經(jīng)診斷為慢性根尖炎病例，無(wú)菌紙尖于患牙根管內(nèi)取樣，用CHROMagar CandidaTM鑒定、分離白色念珠菌株。（2）標(biāo)準(zhǔn)白色念珠菌菌液及抗菌劑應(yīng)用液的配制：從沙堡培養(yǎng)基上取單菌落白色念珠菌接種在YPD（2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h，收集YPD培養(yǎng)液中對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)的真菌細(xì)胞，PBS（pH 7.2）沖洗3遍，用RPMI1640（美國(guó)GIBCO公司）培養(yǎng)液調(diào)整菌懸液濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/ml，OD520nm= 0.38，標(biāo)準(zhǔn)菌懸液制備后即刻使用。將鹽酸小檗堿以RPMI1640為溶劑配制成濃度為1000mg/L的原液，按二倍稀釋法得到15.63～500mg/L共6個(gè)濃度梯度的抗菌劑應(yīng)用液，一組設(shè)計(jì)添加菌液加入實(shí)驗(yàn)組，另一組設(shè)計(jì)不加菌液作為陰性對(duì)照組。以不加抗菌劑的RPMI1640作為陽(yáng)性對(duì)照組，設(shè)計(jì)加入菌液。氫氧化鈣組用RPMI1640為溶劑配制成10%的飽和溶液（pH 12），將配制得到的菌液分別加入不同濃度的抗菌劑應(yīng)用液中。陽(yáng)性對(duì)照組同樣依照此比值加入等量菌液，而陰性對(duì)照組不加菌液。用微量加樣器依次取200 μl實(shí)驗(yàn)組的抗菌劑應(yīng)用液，陽(yáng)性對(duì)照組的菌液及陰性對(duì)照組的抗菌劑應(yīng)用液至 96孔微量培養(yǎng)板的微孔中，共設(shè)8個(gè)復(fù)孔，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。（3）白色念珠菌生物膜活性測(cè)定［3］：采用XTT減低法測(cè)定生物膜活性，XTT粉末用60℃預(yù)熱的0.5g/L林格液溶解，0.22μm孔徑濾器過濾除菌，分裝后-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。在XTT測(cè)定生物膜活性前，加入甲萘醌（以丙酮為溶劑制作1mmol/L的甲萘醌），使其濃度為1mmol/L。白色念珠菌生物膜形成條件同上，培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)基，200μl PBS洗滌3次，后每個(gè)微孔中加入100μl PBS，用微量加樣器取50μl XTT-甲萘醌混合液至每孔中，37℃避光培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀測(cè)OD490nm值，每個(gè)藥物濃度均有8個(gè)孔作為重復(fù)，取平均值。（4）生物膜生物量的測(cè)定［4，5］：采用結(jié)晶紫含量測(cè)定法檢測(cè)白色念珠菌生物膜的生物量。棄去XTT-甲萘醌混合液，200μl PBS洗滌1次，自然干燥后加入結(jié)晶紫溶液100μl/孔，染色5min，后棄去結(jié)晶紫溶液，200μl PBS洗滌3次，后加入95%乙醇100μl/孔，以微量加樣器每孔連續(xù)吹吸1min至完全溶解生物膜上的結(jié)晶紫，吸取融有結(jié)晶紫乙醇轉(zhuǎn)移至另一新96孔微量培養(yǎng)板中，測(cè)OD560nm值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。不同濃度抗菌劑的吸光度值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著法（LSD），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按以下公式計(jì)算減少率：減少率= 1-（實(shí)驗(yàn)組A值-陰性對(duì)照組A值）/（陽(yáng)性對(duì)照組A值-陰性對(duì)照組A值）×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌生物膜活性的影響 觀察白色念珠菌生物膜形態(tài)可見48 h時(shí)形成了致密的成熟生物膜。鹽酸小檗堿可抑制白色念珠菌生物膜活性，且呈濃度相關(guān)性，隨鹽酸小檗堿濃度的升高，白色念珠菌生物膜活性降低。藥物濃度500.00mg/ L，減少率（93.8±4.2）%、250.00mg/L，（94.5±5.8）%、125.00mg/L，（91.6±3.3）%、62.50mg/L，（72.3±4.8）%、31.25mg/L，（63.7±2.5）%、15.63mg/L，（47.8±2.3）%。統(tǒng)計(jì)分析表明，鹽酸小檗堿在濃度為 125.00 mg/L時(shí)使白色念珠菌生物膜活性減少（91.6±3.3）%，生物膜已基本無(wú)活性。

2.2 不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌生物膜生物量的影響 在鹽酸小檗堿的作用下，各組的白色念珠菌生物膜生物量均有所減少，且隨著鹽酸小檗堿濃度的升高，生物膜生物量逐漸減少，藥物濃度500.00 （96.3±0.6）%、250.00（95.5±1.4）%、125.00 （94.2±2.5）%、62.50（61.5±3.8）%、31.25（53.7±4.6）%、15.63（48.5±2.3）%。統(tǒng)計(jì)分析表明，鹽酸小檗堿濃度為125.00 mg/L時(shí)使白色念珠菌生物膜生物量減少（94.2±2.5）%。

2.3 兩種藥物對(duì)白色念珠菌生物膜活性及生物膜生物量的影響 兩組作用48h后，鹽酸小檗堿濃度為125.00mg/L時(shí)對(duì)白色念珠菌生物膜具有較好的抑制作用。10%氫氧化鈣飽和溶液作用后，生物膜活性減少率及生物量減少率說明白色念珠菌生物膜對(duì)飽和氫氧化鈣溶液高度耐藥，見表1。

表1 兩種藥物對(duì)白色念珠菌生物膜活性及生物膜生物量的影響±s）

表1 兩種藥物對(duì)白色念珠菌生物膜活性及生物膜生物量的影響±s）

注：與氫氧化鈣組比較，*P＜0.05

組別活性減少率生物量減少率鹽酸小檗堿組（125.00 mg/L）91.6±3.3 *94.2±2.5*氫氧化鈣組（10%飽和溶液）45.7±4.1 43.4±3.1

3 討論

白色念珠菌是形成根管生物膜的主要微生物之一。當(dāng)前，抗真菌藥普遍存在毒副作用強(qiáng)、易產(chǎn)生耐藥性等原因，因此采用中藥治療越來(lái)越受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)所采用的鹽酸小檗堿為中藥黃連中的主要成分。有研究顯示黃連解毒湯對(duì)白色念珠菌有明顯的抑制作用［6，7］。黃連解毒湯復(fù)方由黃連等四味藥組成，每味中藥成分復(fù)雜，因此本實(shí)驗(yàn)主要研究鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)采用XTT 減低法檢測(cè)生物膜活性，各抗菌劑組生物膜活性的減少率總體上呈濃度相關(guān)性，說明在鹽酸小檗堿影響下，生物膜內(nèi)存活細(xì)胞減少，白色念珠菌生長(zhǎng)活力降低。本實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)鹽酸小檗堿濃度升至125 mg/L時(shí)，生物膜活性降低（91.6±3.3）%，說明生物膜已基本無(wú)活性。生物膜的生物量采用結(jié)晶紫含量測(cè)定法檢測(cè)，各濃度鹽酸小檗堿的生物膜生物量都有所下降，且呈濃度相關(guān)性，說明在鹽酸小檗堿影響下，生物膜的生物量減少。白色念珠菌生物膜活性減低，生物膜的生物量減少說明鹽酸小檗堿可抑制體外白色念珠菌生物膜的形成。

實(shí)驗(yàn)選用10%氫氧化鈣溶液作用于48h白色念珠菌生物膜。由于氫氧化鈣是一種較好的根管消毒藥物，可通過緩慢釋放OH-，提高組織的pH值，破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜而殺菌。要維持較高的組織pH水平，需選用pH值高、流動(dòng)性好的氫氧化鈣。10%的氫氧化鈣飽和溶液pH值超出白色念珠菌的質(zhì)子泵調(diào)節(jié)范圍，可殺滅白色念珠菌，流動(dòng)性好，溶液中的OH-比氫氧化鈣糊劑中的OH-更易滲透至牙本質(zhì)小管深處，滲透范圍更廣［8］。鹽酸小檗堿濃度為125.00mg/L時(shí)對(duì)白色念珠菌生物膜具有較好的抑制作用，能殺滅生物膜中的大部分細(xì)菌，作用效果優(yōu)于口腔臨床常用根管消毒藥物10%氫氧化鈣飽和溶液。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說明鹽酸小檗堿對(duì)白色念珠菌形成具有抑制作用，由于生物膜的形成受多種基因控制，小檗堿抑制白色念珠菌形成的機(jī)制，還有待于進(jìn)一步的研究。

1 張薇，王丹敏，董小青，等.白色念珠菌生物膜對(duì)消毒劑抵抗性的研究.武警醫(yī)學(xué)，2011，22（1）：14～16.

2 樊尚榮，劉小平，嚴(yán)冬霞，等.外陰陰道念珠菌病的臨床特征和抗真菌藥物敏感性研究.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，13（90）：3068～3070.

3 Chandra J，Mukherjee PK，Leidich SD，et a1.Antifunga1 resistance ofCandida1 biofi1ms formed on denture acyc1ic in virtro .J Dent Res，2001，80（3）：903～907.

4 Dovigo LN，Pavarina AC，Carme11o JC，et a1.Susceptibi1ity of c1inica1 iso1ates of Candida to photodynamic effects of cur-cumin .Lasers Surg Med，2011，43（9）：927～934.

5 Monterio DR，Si1va S，Gorup LF，et a1.Si1ver nanopartic1es： inf1uence of stabi1izing agent and diameter on antifunga1 activity against Candida a1bicans and Candida g1abrata biofi1ms .Lett in App1ied Microbio1，2012，54（5）：383～391.

6 汪長(zhǎng)中，程惠娟，官妍，等.黃連解毒湯對(duì)體外白念珠菌生物膜形成的影響.熱帶病與寄生蟲學(xué)，2007，5（2）：82～85.

7 汪長(zhǎng)中，程惠娟，徐穎，等.黃連解毒湯及其單味藥對(duì)體外白念珠菌生物膜影響的比較.上海中醫(yī)藥雜志，2008，42（2）：63～65.

8 Va1era MC.Sa1via AC.Maekawa LE，et a1.Antimicrobia1 ana1ysis of ch1orhexidine ge1 and intracana1 medicaments against microorganisms inocu1ated in root cana1s.Minerva Stomato1 ，2010，59（7～8）：415～421.

Objective To investigate the effects of berberine and calcium hydroxide on Candida albicans biofilm formation. Methods XTT reduction assay was performed to determine the effects of berberine and calcium hydroxide on Candida albicans activity. Crystal violet biofilm assay was applied to determine the effects of berberine and calcium hydroxide on the biofilm biomass. Results The reduction rate of Candida albicans biofilm activity and biomass were（91.6±3.3）% and（94.2±2.5）% respectively when the concentration of berberine was 125 mg/L. Berberine possessed better bacteriostatic ability than calcium hydroxide. Conclusion Berberine is proved to inhibit Candida albicans biofilm formation.

Berberine Calcium hydroxide Candida albicans Biofilm

·診治分析·

310006 杭州口腔醫(yī)院（李福明）

310004 浙江英特醫(yī)藥藥材有限公司（汪洋）