JAK1/TYK2- STAT-1/2信號(hào)通路對(duì)手足口病腦炎的診療價(jià)值

陳潔 溫正旺 陳曉晴 金龍騰 陳益平 李昌崇

JAK1/TYK2- STAT-1/2信號(hào)通路對(duì)手足口病腦炎的診療價(jià)值

陳潔 溫正旺 陳曉晴 金龍騰 陳益平 李昌崇

目的 探討干擾素JAK1/TYK2- STAT-1/2信號(hào)通路在EV71手足口病腦炎中的診療價(jià)值。方法 選取2014年1月至2015年1月手足口病患兒144例為觀察組，分成4組，手足口病兒童2d組（A組）、手足口病兒童5d組（B組）、手足口病腦炎2d組（C組）、手足口病腦炎5d（D組）組，另選擇正常體檢兒童為對(duì)照組，每組各36例，用ELISA法檢測(cè)患兒血液中JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白及干擾素的表達(dá)水平。結(jié)果 觀察組干擾素的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），B組明顯高于D組及A組（P＜0.01）；觀察組JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），B組高于D組及A組（P＜0.01）。結(jié)論 手足口病腦炎患兒干擾素及JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白的表達(dá)水平與正常兒童比較明顯升高，但與普通手足口病患兒比較降低，提示JAK1/TYK2-STAT-1/2信號(hào)通路對(duì)手足口病腦炎具有一定的診斷意義。

EV71 手足口病 腦炎 干擾素

手足口病是一種較為嚴(yán)重的傳染性疾病，嚴(yán)重者可并發(fā)手足口病腦炎，好發(fā)于學(xué)齡前兒童，多數(shù)癥狀在未經(jīng)藥物治療的情況下3～6d好轉(zhuǎn)［1］。研究認(rèn)為EV71導(dǎo)致手足口病腦炎＞50%［2］。干擾素可以影響EV71手足口病腦炎的進(jìn)展及預(yù)后，其在體內(nèi)主要包括產(chǎn)生和應(yīng)答機(jī)制，本文探討干擾素JAK1/TYK2-STAT-1/2信號(hào)通路對(duì)EV71手足口病腦炎的影響，為手足口病腦炎診療及研究提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2015年1月本院手足口病患兒144例為觀察組，男72例，女72例，年齡6個(gè)月至3歲。均經(jīng)腦脊液、糞便EV71檢查及臨床表現(xiàn)確診，排除合并其它疾病。依據(jù)病情及時(shí)間分成4組，手足口病患兒2d組（A組）、5d組（B組）；手足口病腦炎患兒2d組（C組）、5d組（D組），每組各36例。另選擇同期健康體檢兒童36例為對(duì)照組，男18例，女18例；年齡6個(gè)月至3歲。各組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法 采用ELISA法檢測(cè)各組中JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2及干擾素的蛋白表達(dá)（試劑盒由博士得公司提供），每日清晨抽取各組的外周靜脈血1.5 ml，共5組，加入 24孔培養(yǎng)板中，每孔加入40μl血，第1 孔加入生理鹽水作為基礎(chǔ)對(duì)照，第2、3、4、5、6 孔作陽(yáng)性對(duì)照，加入植物血凝素（PHA）100μl，后5孔分別用生理鹽水稀釋成 50g/ml，加入總量均為200μl，加入抗原后輕微搖動(dòng)20s，37 ℃水浴中孵育時(shí)16～20h，抽取血漿上清液適量，于-20 ℃冰箱冷凍備用，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。干擾素的釋放水平檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)計(jì)量資料以（±s）表示，正態(tài)分布資料采用one-way ANOVA方差分析，組間比較方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組干擾素的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），B組明顯高于D組及A組（P＜0.01）；觀察組JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），B組高于D組及A組（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表1 各組相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與A組比較，#P＜0.01；與D組比較，△P＜0.01

組別JAK1TYK2STAT1STAT2干擾素A 組1.98±0.07*3.47±0.09*2.47±0.08*2.01±0.07*2.76±0.07* B組3.93±0.13*#△4.75±0.11*#△3.64±0.11*#△3.41±0.13*#△3.78±0.011*#△C組1.85±0.08*3.35±0.13*2.39±0.07*1.96±0.07*2.60±0.07* D組2.25±0.15*3.77±0.17*2.53±0.14*2.11±0.10*2.77±0.012*對(duì)照組1.20±0.092.23±0.061.58±0.091.38±0.061.55±0.04 F值267.16122.94115.61312.14133.05 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

3 討論

手足口病是一種嚴(yán)重的傳染性疾病，多發(fā)生于＜5歲兒童，患兒可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜炎等并發(fā)癥。個(gè)別重癥患兒病情發(fā)展快，導(dǎo)致死亡。目前仍缺乏有效治療藥物，主要對(duì)癥治療。手足口病腦炎的病理生理機(jī)制目前尚未完全明確，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，EV71病毒是致手足口病腦炎最常見(jiàn)的一種病毒，絕大多數(shù)的手足口病腦炎多由EV71病毒感染引起，但目前對(duì)EV71病毒的檢測(cè)及EV71病毒感染的治療存在滯后性及缺乏針對(duì)性，目前研究發(fā)現(xiàn)EV71病毒感染所致手足口病腦炎可導(dǎo)致腦干腦炎以及嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

干擾素作為一種應(yīng)用廣泛的抗病毒藥物，在EV71腦炎的治療中引起關(guān)注。干擾素是一類高活性多功能的糖蛋白，能誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)病毒感染產(chǎn)生抗性，其通過(guò)干擾病毒基因轉(zhuǎn)錄或病毒蛋白組分的翻譯，從而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗腫瘤生物制品［3］。其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，作為廣譜病毒抑制劑，對(duì)RNA和DNA病毒均有抑制作用。崔雨［4］研究認(rèn)為，當(dāng)機(jī)體感染病毒時(shí)會(huì)分泌干擾素產(chǎn)生抗病毒作用，當(dāng)感染EV71病毒時(shí)，則會(huì)抑制干擾素的分泌。 在臨床治療中使用干擾素制劑可以對(duì)EV71手足口病腦炎的癥狀起到控制作用［5］。本資料中EV71手足口病腦炎患兒的干擾素水平明顯高于正常兒童，提示干擾素與EV71手足口病腦炎存在重要聯(lián)系。

干擾素主要通過(guò)其應(yīng)答信號(hào)通路發(fā)揮作用。干擾素的應(yīng)答通路，通常指經(jīng)典的Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子（JAK-STAT）信號(hào)通路，在抗病毒方面具有重要作用。在這條通路中JAK和STAT蛋白的表達(dá)最為重要。大多數(shù)白介素（ILs）、細(xì)胞集落刺激因子（CSFs）和干擾素（IFNs）等細(xì)胞因子均通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮作用，提示JAK/STAT信號(hào)通路參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)活動(dòng)。有研究提示干擾素的應(yīng)答通路中，主要有JAK1、TYK2、STATI和STAT2參與。

酪氨酸激酶2（TYK2）是JAK（Januskinase）信號(hào)傳導(dǎo)家族的成員之一，IL-12和IFN信號(hào)途徑均需要的一種酶，是IFN、IL-6、IL-10、lL-12和IL-13信號(hào)傳導(dǎo)的重要分子；TYK2功能缺失會(huì)導(dǎo)致多種細(xì)胞因子信號(hào)通路發(fā)生缺陷。TYK2在免疫系統(tǒng)的抗病毒及腫瘤監(jiān)測(cè)中具有關(guān)鍵作用，與多種細(xì)胞因子受體鏈相聯(lián)，包括干擾素受體，白細(xì)胞介素受體。目前已成功建立TYK2基因調(diào)控位點(diǎn)大鼠模型，證實(shí)TYK2在大鼠模型中具有抗病毒作用。在TYK2基因敲除（TYk2-）小鼠模型中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生損傷作用，例如T淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)失功能狀態(tài)，引起的NK細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的反應(yīng)缺乏，對(duì)淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒導(dǎo)致的CD8+CTL反應(yīng)減弱，碩大利什曼原蟲(chóng)感染后，IL-12引起的CD8+T細(xì)胞IFN的產(chǎn)生出現(xiàn)強(qiáng)烈抑制，急性細(xì)胞內(nèi)感染的李斯特菌CD8+Tcl的IFN產(chǎn)生明顯減少，提示TYk2在IL-12通過(guò)其受體激活NK細(xì)胞、CIM+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用［6］。本資料中發(fā)現(xiàn)手足口病及并發(fā)腦炎患兒，TYK2隨著發(fā)病時(shí)間出現(xiàn)不同程度的升高，這些均與干擾素的產(chǎn)生及功能表達(dá)相關(guān)，提示TYK2在干擾素的信號(hào)系統(tǒng)中具有重要作用。

干擾素首先與細(xì)胞膜上的受體IFNARl和IFNAR2結(jié)合，隨后激活與之偶聯(lián)的Janus激酶家族的Jakl和TYk2，Jakl和TYk2的磷酸化使得下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1和2（STAT1，STAT2）發(fā)生磷酸化而活化，磷酸化的STATl和STAT2與干擾素反應(yīng)因子9（IRF9）形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物干擾素刺激基因因子3 （ISGF3）［7］。ISGF3轉(zhuǎn)位到核內(nèi)與干擾素刺激調(diào)節(jié)基元（ISRE）結(jié)合引發(fā)下游抗病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而發(fā)揮干擾素的抗病毒作用［8］。

JAT/stat信號(hào)通路在抗病毒中的作用極為常見(jiàn)，其在抗病毒免疫系統(tǒng)中具有重要作用，在多個(gè)干擾素相關(guān)的抗病毒過(guò)程中均檢測(cè)到通路信號(hào)分子蛋白表達(dá)的改變。研究提示在兒童最常見(jiàn)的呼吸道合胞病毒感染中，呼吸道合胞病毒會(huì)抑制干擾素介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)，最常見(jiàn)的是抑制STAT1和STAT2的蛋白表達(dá)，最終導(dǎo)致ISGF3和IRF9表達(dá)的下降［9］。在丙肝患者的免疫細(xì)胞中，STAT蛋白的表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，與肝臟細(xì)胞中HCV的表達(dá)正好相反，然而STAT mRNA的表達(dá)卻呈正常值，未出現(xiàn)波動(dòng)，機(jī)制分析揭示，當(dāng)HCV感染時(shí)，STAT蛋白優(yōu)先出現(xiàn)泛素化，其降解過(guò)程卻會(huì)被蛋白酶體相關(guān)的抑制物MG132阻止，這些提示HCV感染涉及的干擾素信號(hào)通路激活過(guò)程中，JAK/STAT通路作用較為明顯［10］；本資料顯示在EV71手足口病及并發(fā)腦炎的患兒中JAK/STAT通路的表達(dá)水平明顯升高，存在時(shí)間依賴性，值得注意的是在手足口病腦炎患兒中，該通路的表達(dá)水平并未隨發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，提示EV71病毒感染對(duì)該通路具有抑制作用，與以往的研究一致，提示JAK/STAT通路參與EV71手足口病腦炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

據(jù)此作者推測(cè)干擾素JAK1/TYK2-STAT-1/2信號(hào)通路可能在EV71中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮重要作用且具有一定的診療意義。但本課題由于其局限性，未設(shè)置通路抑制劑組進(jìn)行比較，無(wú)法全面了解該信號(hào)通路在手足口病腦炎中的作用，后續(xù)將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Objective To investigate the role of JAK1/TYK2-STAT-1/2 signal pathway in the diagnosis of EV71-induced encephalitis of hand food and mouth disease. Methods The study was conducted at second Affi liated Hospital and Yuying Children Hospital of Wenzhou Medical College from January 2014 to January 2015，based on blood examination，CSF routine test and clinical manifestation. There were 180 members and they divided into fi ve groups，each group includes 36. 2 day control group（2C），2 day hand-food-mouth（2h），5 day hand-food-mouth（5h），2 day hand-food-mouth and encephalitis（2e），5day hand-food-mouth and encephalitis（5e）. Elisa and western blot were used to detect the expressions of certain signal pathway related proteins in blood. Results Elisa assay：the levels of interferon，JAK1，TYK2，STAT-1，STAT-2 protein expression in the groups of patients were signifi cantly increased than that of the corresponding control groups，（P<0.01），especially the 5h group，there was no signifi cant difference found between 2e group and 2h group，it was the same between 2e and 5e group. Conclusions The levels of the levels of interferon，JAK1，TYK2，STAT-1，STAT-2 protein expression in the groups of hand food mouth disease and encephalitis were signifi cant increased，but were expressed less than that groups of general hand food mouth disease，which suggest that JAK1/TYK2-- STAT-1/2 signal pathway has a great role in the diagnosis of hand food mouth disease and encephalitis.

EV71 Hand-food-mouth disease Encephalitis Interferon

浙江省溫州市科技局項(xiàng)目（Y20140500）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院感染科