鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)利多卡因致大鼠脊髓神經(jīng)毒性的影響

吳春嫻

鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)利多卡因致大鼠脊髓神經(jīng)毒性的影響

吳春嫻

目的 探討鞘內(nèi)（蛛網(wǎng)膜下腔）注射右美托咪定（DEX）對(duì)利多卡因致大鼠脊髓神經(jīng)毒性的影響。方法 健康清潔級(jí)雄性大鼠30只，體重250～300g，按隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為5組（n=6）：空白對(duì)照組（C組）、假手術(shù)組（S組）、利多卡因致神經(jīng)毒性組（L組）、生理鹽水組（NS組）、右美托咪定（60μg/kg）組（LD組）。除C組外，其余各組均行鞘內(nèi)置管。在鞘內(nèi)置管后第1天，除S組外，均鞘內(nèi)注射20%利多卡因20μl。注射24h后，NS組鞘內(nèi)注射生理鹽水20μl，LD組鞘內(nèi)注射DEΧ20μl，1次/d，連續(xù)7d。術(shù)后第8天取脊髓組織采用流式細(xì)胞儀測(cè)定神經(jīng)元凋亡率，采用RT-PCR法測(cè)定caspase-3 mRNA的表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)脊髓組織腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量。結(jié)果 與C組比較，L組、NS組、LD組，細(xì)胞凋亡率明顯升高；與L組比較，LD組細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與C組比較，L組、NS組、LD組，caspase-3mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；與L組比較，LD組caspase-3mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與C組比較，L組、NS組、LD組，TNF-α、IL-1、 IL-6含量明顯升高；與L組比較，LD組TNF-α、IL-1、 IL-6含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 鞘內(nèi)注射DEX（60μg/kg）可減輕利多卡因誘發(fā)大鼠脊髓神經(jīng)毒性，其機(jī)制可能與抑制caspase-3 mRNA的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

右美托咪定 利多卡因 脊神經(jīng) 細(xì)胞凋亡 炎癥反應(yīng)

局麻藥物的神經(jīng)毒性反應(yīng)是臨床常見(jiàn)的并發(fā)癥，多數(shù)表現(xiàn)為短暫的神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重的可引起馬尾綜合征甚至癱瘓。右美托咪定（DEX）是高選擇性a受體激動(dòng)藥，在臨床麻醉中用于鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛。研究表明［1］，DEX可減輕組織器官炎癥反應(yīng)，對(duì)組織器官具有一定的保護(hù)作用：Lai等［2］證實(shí)高于臨床劑量的DEX可抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-10，具有減輕炎癥反應(yīng)保護(hù)組織器官的作用。2015年3月至11月作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，探討鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)利多卡因誘發(fā)大鼠脊髓神經(jīng)毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性大鼠30只，體重250～300g，8～10周齡，由寧波大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 健康清潔級(jí)雄性大鼠30只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，空白對(duì)照組（C組）、假手術(shù)組（S組）、利多卡因致神經(jīng)毒性組（L組）、生理鹽水組（NS組）、右美托咪定（60μg/kg）組（LD組），每組各6只。除C組外，其余各組均行鞘內(nèi)置管。在鞘內(nèi)置管后第1天，除S組外，剩均鞘內(nèi)注射20%利多卡因20μl。在利多卡因注射后24h，NS組鞘內(nèi)注射生理鹽水20μl，LD組鞘內(nèi)注射DEΧ20μl，1次/d，連續(xù)7d。術(shù)后第8天取脊髓組織采用流式細(xì)胞儀測(cè)定神經(jīng)元凋亡率，采用RT-PCR法測(cè)定caspase-3 mRNA的表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)脊髓組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量。

1.3 鞘內(nèi)置管 除C組外，其余各組參考文獻(xiàn)［3］均行鞘內(nèi)置管。術(shù)畢第1天鞘內(nèi)注射20%利多卡因20μl，＜30s出現(xiàn)雙后肢癱瘓為利多卡因篩選實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，同時(shí)若鉗夾雙前肢，躲避反應(yīng)存在，而雙后肢無(wú)反應(yīng)，夾尾反射消失，則選入實(shí)驗(yàn)。排除不符合實(shí)驗(yàn)條件的大鼠。

1.4 觀察指標(biāo) （1）細(xì)胞凋亡的測(cè)定：鞘內(nèi)注射利多卡因7d后，每組隨機(jī)取3只大鼠，快速斷頭處死，取L4～5脊髓組織，預(yù)冷PBS液沖洗脊髓組織，無(wú)菌研磨1min，細(xì)胞團(tuán)塊過(guò)濾2次后離心去血清，加入碘化丙啶避光反應(yīng)30min，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀測(cè)定神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率（凋亡細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%）。（2）caspase-3 mRNA表達(dá)的測(cè)定：采用RT-PCR法測(cè)定caspase-3 mRNA的表達(dá)。（3）脊髓組織TNF-α、IL-1、IL-6含量測(cè)定：于術(shù)后第8天取脊髓L4～5椎體，以充滿50ml生理鹽水的注射器從骶段椎管插入3～4 mm，將脊髓沖出，稱重后勻漿，分離上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定脊髓TNF-α、IL-1 和IL-6 的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與C組比較，L組、NS組、LD組，細(xì)胞凋亡率明顯升高；與L組比較，LD組細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與C組比較，L組、NS組、LD組，caspase-3mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；與L組比較，LD組caspase-3mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與C組比較，L組、NS組、LD組，TNF-α、IL-1、 IL-6含量明顯升高；與L組比較，LD 組TNF-α、IL-1、 IL-6含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率、caspase-3mRNA表達(dá)及檢測(cè)指標(biāo)比較（±s）

表1 各組細(xì)胞凋亡率、caspase-3mRNA表達(dá)及檢測(cè)指標(biāo)比較（±s）

注：與C組比較，*P＜0.05；與L組比較，#P＜0.05

組別細(xì)胞凋亡率（%）caspase-3mRNATNF-α（pg/mg）IL-1（pg/mg）IL-6（pg/mg）C組2.13±0.22 0.49±0.0220.12±3.2155.37±8.26102.57±21.38 S組2.04±0.31 0.43±0.0121.35±2.1850.89±7.6599.65±26.31 L組18.34±4.13* 1.01±0.05*159.37±11.56*281.64±29.67*416.84±31.20* NS組17.85±4.38* 0.98±0.06*150.39±12.34*279.58±21.98*402.95±29.34* LD組8.34±1.86*# 0.60±0.01*#69.34±8.54 *#90.67±15.92*#169.31±26.34*#

3 討論

利多卡因?yàn)轷０奉?lèi)局麻藥。臨床上廣泛應(yīng)用于局部麻醉、鎮(zhèn)痛等。利多卡因可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)毒性反應(yīng)，是臨床上常見(jiàn)的并發(fā)癥，多數(shù)表現(xiàn)為短暫的神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重的可引起馬尾綜合征甚至癱瘓，利多卡因所致神經(jīng)毒性具體機(jī)制不詳，其可能機(jī)制有［4］：神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞內(nèi)鈣超載可致線粒體功能障礙，線粒體腫脹，功能失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；如神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)期暴露局麻藥下，或利多卡因濃度過(guò)高，可引起神經(jīng)細(xì)胞脫髓鞘，進(jìn)而引起一系列的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而引發(fā)神經(jīng)毒性等。

右美托咪定（DEX）是高選擇性α受體激動(dòng)藥，在臨床麻醉中用于鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛。最新研究表明［5，6］，右美托咪定可減輕組織器官炎癥反應(yīng)，對(duì)組織器官具有一定的保護(hù)作用，有研究證實(shí)［7］，右美托咪定具有神經(jīng)保護(hù)功能，能夠減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物短暫性整體或局部腦缺血后的神經(jīng)損傷，推測(cè)其可能與降低腦細(xì)胞外的兒茶酚胺水平、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸鹽有關(guān)。Lai等［2］證實(shí)高于臨床劑量的DEX可抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-10，具有減輕炎癥反應(yīng)保護(hù)組織器官的作用。有研究證實(shí)［8～10］，DEX組織器官保護(hù)作用，可能與其調(diào)控P13K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

本資料結(jié)果顯示，與C組比較，L組、NS組、LD組細(xì)胞凋亡率明顯升高，表明利多卡因誘發(fā)大鼠脊髓神經(jīng)毒性的模型制備成功。與L組比較，LD組細(xì)胞凋亡率明顯降低，表明DEX在一定程度上，通過(guò)一定的途徑可以降低細(xì)胞凋亡率，但結(jié)果顯示，DEX并不能完全抑制細(xì)胞凋亡，表明鞘內(nèi)注射DEX可減輕利多卡因所誘發(fā)的大鼠脊髓神經(jīng)毒性。

一般認(rèn)為caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分［11］。研究證實(shí)利多卡因可使線粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放增加，從而激活caspase系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。局麻藥對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞毒性作用主要表現(xiàn)為誘發(fā)細(xì)胞凋亡，caspase信號(hào)通路激活是細(xì)胞凋亡的主要途徑，其中caspase-3表達(dá)與細(xì)胞凋亡有較高的相關(guān)性，可作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記物。本資料結(jié)果顯示，與C組比較，L組、NS組、LD組，caspase-3mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致，與L組比較，LD組caspase-3mRNA表達(dá)下調(diào)，表明DEX可抑制caspase-3mRNA的表達(dá)，其機(jī)制可能與DEX拮抗興奮性氨基酸毒性、增加自由基清除劑活性、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度等有關(guān)。本資料結(jié)果顯示：與C組比較，L組、NS組、LD組的TNF-α、IL-1、 IL-6含量明顯升高；與L組比較，LD組的TNF-α、IL-1、 IL-6含量降低，表明右美托咪定可以減輕神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

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Objective To evaluate the effect of dexmedetomidine（DEX） intrathecal administration on formation of lidocaine-induced neurotoxicity to the spinal cord in rats. Methods Healthy male Sprague-Dawley rats， weighing 250-300g， were randomly divided into 5 groups（n=6）using a random number table: control group （group C）， sham operation group （group S）， lidocaine-induced neurotoxieity group （group L），normal saline group （group NS） and dexmedetomidine （60μg） group （group LD） . A catheter was inserted at L4-5 interspace into the epidural space in S ， L ， NS ， and LD groups . One day after surgery， 20% lidocaine 20μl was injected intrathecally . When lidocaine were injected after 24 hours， normal saline 20μl and DEX 20μl were injectedintrathecally in NS and LD groups， respectively， once a day for 7 consecutive days. The rats were sacrifi ced after the behavioral test was completed at 8 days after lidocaine injection， and the lumbar segments of the spinal cord were removed to detect the neuronal apoptosis （ using flow cytometry ） and caspase-3 mRNA expression （ by RT-PCR ）. Using enzyme-linked immunosorbentassay （ELISA） to detect spinal cord tissue tumor necrosis factor-a （TNF-a） 、interleukin-1 （IL-1） 、interleukin-6 （IL-6） . Results Compared with group C， the apoptosis rate wasincreased and caspase-3 mRNA expression was up-regulated in L、NS and LD groups. Compared with group L， the apoptosis rate was decreased and caspase-3 mRNA expression was down-regulated in LD group. Compared with group C， TNF-a、IL-1and IL-6 content signifi cantly increased in L、NS and LD groups. Compared with group L， TNF-a、IL-1and IL-6 content decreased obviously in LD group. The signifi cant change was found in the parameters mentioned above. Conclusion Intrathecal DEX （60μg） can reduce lidocaine-induced neurotoxicity to the spinal cord in rats. The mechanismthe are related to the inhibition of caspase-3 mRNA expression and the reduction of infl ammatory reation.

Dexmedetomidine Lidocaine Spinal neurons Apoptosisinfl am Matory reaction

·實(shí)驗(yàn)研究·

315000 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科