哺乳期過量的內(nèi)源性大麻素干預(yù)導(dǎo)致成年鼠胰島素抵抗

高嘯 許騰 廖丹 胡軍?

哺乳期過量的內(nèi)源性大麻素干預(yù)導(dǎo)致成年鼠胰島素抵抗

高嘯 許騰 廖丹 胡軍?

目的 評估長期使用內(nèi)源性大麻素（AEA）對成年鼠的體重、附睪脂肪組織和代謝相關(guān)參數(shù)的影響。方法 雄性鼠從哺乳期全程口服豆油乳化的AEA 20μg/g。斷奶后每10d對其攝食和體重進(jìn)行記錄。成年后行葡萄糖-胰島素耐受測試。隨后，處死小鼠得到其附睪脂肪，并對其血漿中的胰島素、瘦素、非酯化脂肪酸、甘油三酯和膽固醇進(jìn)行測定。結(jié)果 哺乳期AEA處理組的小鼠在成年后表現(xiàn)出比較對照組較高的攝食量、較重的體重和較多的附睪脂肪。對附睪脂肪組織的CBR1蛋白的測定中，AEA處理組比對照組小鼠增高約1.5倍。AEA處理組小鼠外周循環(huán)中有較高的葡萄糖、胰島素、瘦素、甘油三酯、膽固醇和非酯化脂肪酸。且AEA處理組小鼠表現(xiàn)出一系列顯著的胰島素抵抗的指標(biāo)。結(jié)論 在小鼠哺乳期使用AEA處理后其成年小鼠的體重、脂肪積累和對代謝產(chǎn)生干擾。

內(nèi)源性大麻素 超重 胰島素抵抗 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng) 脂肪組織

超重和肥胖是能量攝入和能量消耗的平衡失調(diào)造成的，這一現(xiàn)象甚至可以追溯到嬰兒期的高風(fēng)險(xiǎn)因素所導(dǎo)致的成年之后的疾病的高發(fā)［1］。最近研究表明，能量的平衡受控于復(fù)雜的中樞系統(tǒng)和外周系統(tǒng)的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的調(diào)控，且內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在能量平衡的過程中以及對肥胖的進(jìn)展中發(fā)揮了極其重要的作用［2］。2014年3月至8月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，探討哺乳期高濃度內(nèi)源性大麻素的干預(yù)對成年后的代謝影響。

1 材料與方法

1.1 材料 CD-1小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；內(nèi)源性大麻素（AEA）購于Sigma公司。

1.2 方法 （1）CD-1小鼠飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房內(nèi)，保持適度的溫度和濕度以及12h：12h的晝夜時(shí)間比。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中給予正常飲食4Kcal/g［3］。小鼠分兩組，對照組：哺乳期＜21d，給予口服1μl/（g·d）豆油。AEA處理組小鼠：哺乳期＜21d，給予口服1μl/（g·d）豆油，并按照小鼠體重給予AEA 20μg/g，21d后斷奶并將其與母鼠分離單獨(dú)飼養(yǎng)至150d。在此期間對其進(jìn)行體重、攝食、基礎(chǔ)代謝率、葡萄糖耐受和胰島素敏感性測試。在實(shí)驗(yàn)結(jié)150d取血標(biāo)本進(jìn)行代謝標(biāo)志物的檢測。

1.3 West blot檢測CB1R在附睪中的表達(dá) 取對照組和AEA處理組小鼠附睪脂肪組織，使用RIPA裂解緩沖液，12% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，BSA封閉PVDF膜后使用CB1R多克隆與之結(jié)合，再使用HRP-抗兔IgG二抗雜交，使用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測。同時(shí)以B-actin作為內(nèi)參。

1.4 （1）葡萄糖和胰島素耐受的檢測：小鼠禁食6h后給予葡萄糖溶液，按照體重給予含葡萄糖1.5mg/g，在15min、30min、60min、90min和120min分別收集尾部血液評估葡萄糖水平；禁食6h后，腹腔注射胰島素0.75U/kg后，在15min、30min、60min、90min和120min分別收集尾部血液評估葡萄糖水平。（2）血漿葡萄糖、血脂和激素水平檢測：使用RD公司ELISA夾心法檢測血漿中瘦素含量。使用Linco Research檢測血漿中胰島素含量。葡萄糖、甘油三酯和膽固醇使用DIALAB公司試劑盒檢測。非酯化脂肪酸使用Wako Chemicals試劑盒檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件。數(shù)據(jù)以（x±s）表示，使用Mann-Withney U 檢驗(yàn)或ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AEA處理小鼠在哺乳期前后體重的變化 新生小鼠口服AEA后在哺乳期內(nèi)與未經(jīng)AEA處理組小鼠比較，其體重略有升高，但是其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1A。而在哺乳期結(jié)束后至150d的動(dòng)態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)，AEA處理組小鼠體重的增長遠(yuǎn)高于正常飼養(yǎng)小鼠，在90d和150d的測量數(shù)據(jù)顯示，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。在第150d時(shí)處死小鼠，取其附睪脂肪組織稱重，并計(jì)算附睪脂肪指數(shù)：附睪脂肪組織與體重的比值，結(jié)果顯示AEA處理組小鼠附睪脂肪組織重量（1.965±0.176）g 高于未處理組vs（1.135±0.185）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A。附睪脂肪指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，AEA處理組達(dá)3.5%，未處理組2.4%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B。

圖1 A哺乳期兩組小鼠體重不同時(shí)間點(diǎn)的比較；B哺乳期后兩組小鼠體重不同時(shí)間點(diǎn)的比較，120d和150d時(shí)，AEA處理組小鼠體重明顯高于未處理組（?P＜0.05）。

圖2 A 150d時(shí) AEA處理組小鼠附睪脂肪組織重量高于對照組小鼠附睪脂肪組織（P＜0.05）；B 150d時(shí) AEA處理組小鼠附睪脂肪指數(shù)高于對照組小鼠附睪脂肪指數(shù)（?P＜0.05）。

2.2 附睪脂肪組織CB1R的檢測 通過western blot 檢測兩組小鼠附睪脂肪組織中CB1R的表達(dá)情況，并將對CB1R和內(nèi)參B-actin條帶進(jìn)行灰度掃描。結(jié)果顯示AEA處理組CB1R表達(dá)量顯著高于未處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3A AEA處理組與未處理組間CB1R含量的比較，AEA處理組CB1R顯著高于未處理組，（P＜0.05）；B western blot鑒定AEA處理組與未處理組附睪脂肪組織中CB1R的表達(dá)。

2.3 葡萄糖耐量和胰島素耐受試驗(yàn) 對兩組小鼠分別進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠血液中葡萄糖的增加量隨著時(shí)間的延長逐漸升高，20min時(shí)達(dá)到峰值，30min后逐漸下降，120min時(shí)仍高于給予葡萄糖時(shí)的血葡萄糖濃度，兩組小鼠血葡萄糖濃度比較顯示，AEA處理組小鼠血糖濃度在15～120min，各時(shí)間點(diǎn)均高于未處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4A。而給予胰島素注射后，AEA處理組小鼠的血葡萄糖濃度在60min仍呈現(xiàn)出上升趨勢，而未處理組小鼠血糖下降的程度隨著時(shí)間的延長逐漸升高。見圖4B。

圖4A AEA處理組和未處理組小鼠葡萄糖耐量的比較，AEA處理組小鼠血糖在15～120min各時(shí)段升高值均高于未處理組；B胰島素耐受實(shí)驗(yàn)，同時(shí)給予葡萄糖和胰島素后60min，AEA處理組小鼠清除葡萄糖的能力低于未處理組

2.4 AEA處理對血中各代謝指標(biāo)的影響 在150d時(shí)檢測小鼠各項(xiàng)代謝指標(biāo)，結(jié)果顯示，AEA處理組小鼠甘油三酯、膽固醇、非酯化脂肪酸、血糖、胰島素和瘦素的含量均高于未處理組小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 AEA處理組和未處理組小鼠血漿各代謝指標(biāo)的比較（x±s）

3 討論

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)主要由大麻受體I和大麻受體II組成，其是內(nèi)源性的配體被稱之為內(nèi)源性大麻素。研究最為廣泛的兩種內(nèi)源性大麻素AEA和2-AG。I型大麻素受體主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和少數(shù)外周組織，如肝臟、肌肉、脂肪組織，其可以被AEA活化［4～6］。II型大麻素受體主要表達(dá)在免疫細(xì)胞和造血細(xì)胞中，其可以被2-AG激活。最近有報(bào)道，II型大麻素受體在某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟、胰腺中亦有表達(dá)［7，8］。但I(xiàn)型大麻素受體在對飲食控制和能量平衡上仍發(fā)揮主要作用［9］。因此活化下丘腦中的I型大麻素受體可以增加食欲［10，11］，并促使脂質(zhì)在脂肪細(xì)胞中的累積［12］，并導(dǎo)致脂肪肝［5］。有研究使用I型大麻素受體的拮抗劑AM-25，可以改善過量內(nèi)源性大麻素造成的代謝特征［13］。在隨后的研究中，哺乳期間母乳中高濃度的內(nèi)源性大麻素同樣可以造成脂質(zhì)的代謝異常［14］。

本資料中，作者使用過量的AEA處理哺乳期的小鼠，在對其成年后的觀察結(jié)果顯示，AEA處理組的小鼠體重增加、附睪脂肪組織累積并且產(chǎn)生胰島素抵抗。因此推論其幼體的干預(yù)是發(fā)育階段較為關(guān)鍵的時(shí)段，從而對個(gè)體成年后產(chǎn)生影響，而CB1R在這個(gè)干預(yù)的過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明在動(dòng)物肥胖模型中也有內(nèi)源性大麻素的升高的現(xiàn)象［5，15，16］，當(dāng)然在對人體的研究過程中也存在類似的想象，體內(nèi)過度活化的大麻素系統(tǒng)導(dǎo)致機(jī)體能量失衡［17～19］。而本資料顯示，AEA處理組的小鼠食量高于未處理組，其能量消耗卻較未處理組低，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中作者使用CB1R拮抗劑，明顯能夠降低小鼠食欲以及體重減輕，這與現(xiàn)有報(bào)道一致［20，21］。

肥胖所導(dǎo)致的一系列代謝癥狀如，甘油三酯、非酯化脂肪酸等的升高從而導(dǎo)致外周組織對胰島素耐受，進(jìn)而發(fā)展為2型糖尿?。?2］。而本資料中AEA處理組的小鼠所表現(xiàn)出的附睪脂肪組織增加、高血糖、高血脂及胰島素抵抗。與報(bào)道一致。且許多研究結(jié)果證實(shí)高血脂及脂肪的異位沉積與胰島素抵抗是相互促進(jìn)的［23，24］，這個(gè)現(xiàn)象在本次實(shí)驗(yàn)中也有所體現(xiàn)。本資料中哺乳期的高水平的AEA干預(yù)導(dǎo)致CB1R水平升高，進(jìn)而使得脂肪沉積，與現(xiàn)有報(bào)道較為一致［12］。

綜上所述，哺乳期使用CB1R的激動(dòng)劑AEA可以對成年后的機(jī)體代謝產(chǎn)生影響。也為早期2型糖尿病的預(yù)測及預(yù)防提供一個(gè)新型的思路。

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Objective To evaluate long-term effects of AEA treatment during lactation on body weight，epididymal fat accumulation and related metabolic parameters during adulthood. Method Male mice pups were orally treated with a solution of AEA（20 μg/g body weight in soy oil）or vehicle during the whole lactation period. After weaning，food intake and body weight were recorded every 10 days. Adult animals were subjected to glucose and insulin tolerance tests. Subsequently，animals were sacrifi ced and epididymal fat pads were extracted. Circulating levels of plasma insulin，leptin，non-sterifi ed fatty acids（NEFA），triglyceride and cholesterol were also evaluated. Results AEA-treated mice during lactation showed a signifi cant increase in accumulated food intake，body weight and epididymal fat during adulthood when compared to control mice. When evaluating CB1R protein expression in epididymal fat，the AEA-treated group showed a 150 % increase in expression compared to the control mice. This group also displayed signifi cantly higher levels of circulating glucose，insulin，leptin，triglycerides，cholesterol and NEFA. Moreover，a marked state of insulin resistance was an important fi nding in the AEA-treated group. Conclusion This study showed that overweight，accumulation of visceral fat and associated metabolic disturbances，such as a higher lipid profi le and insulin resistance，can be programmed by a treatment with the endocannabinoid AEA during lactation in adult mice.

Anandamide Overweight Insulin resistance Endocannabinoid system Adipose tissue

430077 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院內(nèi)分泌科