miR-21 miR-205聯(lián)合檢測對非小細胞肺癌的診斷價值

陳弘磊 王偉? 李芳瓊 劉琴 趙桂枝

miR-21 miR-205聯(lián)合檢測對非小細胞肺癌的診斷價值

陳弘磊 王偉? 李芳瓊 劉琴 趙桂枝

目的 探討聯(lián)合檢測血液中microRNA-205（miR-205）和microRNA-21（miR-21）對非小細胞肺癌的診斷價值。方法 收集27例非小細胞肺癌患者術(shù)前及術(shù)后血清，并收集29例健康志愿者血清作為對照。應(yīng)用實時熒光定量PCR 法檢測以上標本中miR-205和miR-21 的表達水平，并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，評估m(xù)iR-205和miR-21聯(lián)合檢測對非小細胞肺癌的診斷價值。結(jié)果 非小細胞肺癌患者術(shù)前血清中miR-205和miR-21的表達水平均高于健康人群（P< 0.05），其中23例非小細胞肺癌患者術(shù)后血清中miR-205的表達水平較術(shù)前明顯降低（P＜0.01），術(shù)前與術(shù)后miR-21表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。而術(shù)前血漿中miR-205和miR-21的表達水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期存在相關(guān)性（P<0.05）。miR-205和miR-21 的受試者（ROC）曲線下面積為0.968，非小細胞肺癌患者和健康人群的敏感度和特異度分別為96.3%和89.7%。結(jié)論 血清miR-205和miR-21作為新的生物學指標，兩者聯(lián)合檢測對非小細胞肺癌的診斷和預(yù)后監(jiān)測有一定價值。

非小細胞肺癌 miR-21 miR-205 聯(lián)合檢測

肺癌是一種全球范圍內(nèi)常見的癌癥，出現(xiàn)臨床表現(xiàn)時已經(jīng)是晚期，故有較高的致死率［1］。約75%的肺癌患者在確診時已經(jīng)是晚期或癌細胞已經(jīng)轉(zhuǎn)移，因此肺癌患者5年生存率＜15%［2］。miRNA在血清/血漿中可以穩(wěn)定存在，表達量不受各種保存條件、保存時間的影響；且miRNA的表達無年齡、性別差異，具有腫瘤特異性［3］。因此，血清/血漿中miRNAs可能成為一種新的非侵入性腫瘤標志物。2013年10月至2015年至5月作者通過實驗研究，探討聯(lián)合檢測血液中miR-205、miR-21對非小細胞肺癌的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 樣本 采集EDTA抗凝血漿樣本，健康對照組29例，男15例，女14例；年齡（46.3±11.2）歲。肺癌組27例，男16例，女11例；年齡（49.6±9.7）歲。病理診斷均為非小細胞肺癌，術(shù)前均未進行過化療、放療，1例術(shù)后脫落。肺癌患者術(shù)前、術(shù)后3d分別采集血漿。

1.2 試劑及儀器 血漿miRNA提取采用miRcute miRNA Isolation Kit。反轉(zhuǎn)錄試劑盒采用TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit。探針由自行設(shè)計并合成；反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物、PCR擴增引物由自行設(shè)計合成。cel-miR-39購自QIAGEN。BioRad CFX實時熒光定量PCR儀。

1.3 血漿miRNA的提取及cDNA制備 使用miRcute miRNA Isolation Kit提取血漿miRNA，使用TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 PCR反應(yīng) miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，按照下面組分進行PCR反應(yīng)。循環(huán)參數(shù)設(shè)置：95℃10min預(yù)變性，然后95℃15s 和60℃1min退火延伸40個循環(huán)。熒光通道檢測選擇FAM。單點熒光檢測在60℃。反應(yīng)體系為20μl，包括檢測試劑混合液（18.5μl）、DSC-Taq DNA聚合酶（0.2μl）、cDNA（1.3μl）。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS軟件。計算術(shù)前術(shù)后ΔmiR-21、ΔmiR-205的差值xi=Ct（術(shù)后ΔmiRNA）-Ct（術(shù)前ΔmiRNA），然后計算差值的平均數(shù)和標準差，并計算T0，并查表得t0.05。若T0＜t0.05，則術(shù)前術(shù)后無顯著差異；若T0＞t0.05，則術(shù)前術(shù)后差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組術(shù)前與術(shù)后miR-21、miR-205檢測結(jié)果比較 miR-21術(shù)后與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學意義，miR-205術(shù)后與術(shù)前比較差異有統(tǒng)計學意義。見圖1、圖2、表1。

2.2 兩組術(shù)前、術(shù)后miR-21、miR-205比較 兩組術(shù)前比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），可用于肺癌的判定；而兩組術(shù)后比較，miR-21差異有統(tǒng)計學意義，miR-205差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

圖1 miR-21在術(shù)前與術(shù)后的表達差異

圖2 miR-205在術(shù)前與術(shù)后的表達差異

表1 肺癌組術(shù)前與術(shù)后miR-21、miR-205比較

表2 miR-21、miR-205與正常健康組t-test結(jié)果比較

2.3 ROC曲線和cut-off值 從圖3及表3中可知，曲線下面積為0.968，表明miR-21和miR-205聯(lián)檢對肺癌的判別有意義（P＜0.001）。根據(jù)ROC曲線坐標，選擇敏感度+特異性最大值-1.435作為cut-off值，此時靈敏度為0.963，特異性為0.897。比較Ct計算公式為：Ct（-ΔmiR-21）×0.578 + Ct（-ΔmiR-205）×0.550，若比較Ct ＞ -1.435，則為肺癌；比較Ct ＜ -1.435，則為健康。

圖3 ΔmiR-21、-ΔmiR-205ROC曲線

表3 曲線下面積

3 討論

微小RNA（miRNAs）是一類核苷酸序列高度保守、長度為21～23nt的非編碼單鏈RNA，主要參與轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控，介導(dǎo)基因沉默。人類miRNA編碼基因有700多個結(jié)合位點，而將近1/3基因的表達調(diào)控均有miRNA的參與，涉及細胞分化、增殖與凋亡等生命活動的多個進程。miRNA的表達異常能夠引發(fā)多種疾病，甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［4］。研究表明，大量的miRNA位于與腫瘤相關(guān)的基因區(qū)、雜合性丟失區(qū)與擴增區(qū)［5］，且在較多惡性腫瘤（如肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等）組織中均有異常表達，提示腫瘤發(fā)生可能與miRNA有密切關(guān)聯(lián)［6］。

miR-21是miRNA家族中成員之一，成熟的miR-21主要通過與靶mRNA的3'UTP完全或不完全的特異性配對從而影響mRNA的降解，或通過與靶mRNA序列互不配對結(jié)合而阻斷其翻譯過程，最終在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達［7］。進而調(diào)節(jié)一系列機體重要的生理過程，包括細胞的增殖、分化與凋亡等。近年來對miR-21與腫瘤的大量研究表明，miR-21在多種腫瘤組織中均有異常表達，典型的有肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等［8］；研究顯示miR-21擁有抗凋亡作用，相當于癌基因功能。有研究表明，在非小細胞肺癌患者的血清中，miR-146b、miR-221、let-7a、miR-155、miR-17-5p、miR-27a、miR-106a的表達量顯著下降，而miR-29c的表達量則顯著升高［9］。miR-21、miR-210在NSCLC表達譜中通常表現(xiàn)為顯著下調(diào)［10］。Wang 等［11］認為，與健康組比較，非小細胞肺癌患者血清中的miR-21顯著提高。miR-21的高表達水平和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)分期相關(guān)。

miR-205是miRNA家族中與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的另一成員，核苷酸序列高度保守，位于人第一號染色體LOC642587位點第二內(nèi)含子中［12］。miR-205在各種腫瘤中的表達水平并不一致，有研究報道，在前列腺癌和乳腺癌等腫瘤組織中miR-205表達明顯下降［13］，而在肺癌組織中表達顯著上調(diào)。Markou等應(yīng)用PCR技術(shù)對非小細胞肺癌患者研究中，檢測到腫瘤細胞中miR-205高表達，但表達量與生存率無關(guān)［14］。

本資料結(jié)果表明，非小細胞肺癌患者術(shù)前miR-21、miR-205均明顯升高，采用ROC曲線評估，當cut-off值取-1.435時，靈敏度為96.3%，特異性為89.7%，具有極其良好的對臨床非小細胞肺癌的診斷價值。 肺癌患者術(shù)前與術(shù)后血漿miR-21差異無統(tǒng)計學意義，而miR-205差異有統(tǒng)計學意義，肺癌患者術(shù)前與術(shù)后miR-21與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，而miR-205術(shù)前差異有統(tǒng)計學意義，術(shù)后差異無統(tǒng)計學意義。表明血漿miR-21在肺癌術(shù)后3d并未立即下降，而miR-205則會立即下降至正常水平，因此miR-205可能為非小細胞肺癌的一個相關(guān)的腫瘤指標，可能比其他miR更加靈敏地反映腫瘤的變化。綜上所述，聯(lián)合檢測miR-21、miR205能更有效提高非小細胞肺癌的檢出率，為術(shù)后的治療效果提供更可靠的依據(jù)，有望為腫瘤診斷、治療及預(yù)后過程提供一種新方法。

1 Jemal A， Siegel R， Xu J， et al. Cancer statistics，2010. CA： a cancer journal for clinicians， 2010， 60（5）： 277～300.

2 Aberle DR， Berg CD， Black WC， et al. The National Lung Screening Trial： overview and study design. Radiology ，2011，258：243～253.

3 Heegaard N H H， Schetter A J， Welsh J A， et al. Circulating micro-RNA expression profiles in early stage nonsmall cell lung cancer. International Journal of Cancer， 2012， 130（6）： 1378～1386.

4 SM H. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion in Genetics & Development， 2006， 16：103～105.

5 Calin G A.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004，101（9）： 2999～3004.

6 Chen X， Ba Y， Ma L， et al. Characterization of microRNAs in serum： a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell research，2008，18（10）： 997～1006.

7 Volinia S. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006，103（7）： 2257～2261.

8 Lui W O. Patterns of known and novel small RNAS in human cervical cancer. Cancer Research， 2010，67：671～675.

9 Yu L， Todd N W， Xing L， et al. Early detection of lung adenocarcinoma in sputum by a panel of microRNA markers. International Journal of Cancer， 2010， 127（12）： 2870～2878.

10 Chen X， Hu Z， Wang W， et al. Identification of ten serum microRNAs from a genome-wide serum microRNA expression profile as novel noninvasive biomarkers for nonsmall cell lung cancer diagnosis. International Journal of Cancer， 2012， 130（7）： 1620～1628.

11 Wang Z X， Bian H B， Wang J R， et al. Prognostic significance of serum miRNA-21 expression in human non-small cell lung cancer. Journal of surgical oncology， 2011， 104（7）： 847～851.

12 Landgraf P. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell， 2007，129（7）： 1401～1414.

13 Majid S.MicroRNA-205-directed transcriptional activation of tumor suppressor genes in prostate cancer. Cancer， 2010，116（24）：5637～5649.

14 Athina Markou， Emily GTsaroucha， Loukas Kaklamanis，et al.Prognostic value of mature microRNA-21 and microRNA-205 overexpression in non-small cell lung cancer by quantitative real-time RT-PCR. Clinical Chemistry， 2008， 54（10）： 1696～1704.

Objective To explore the diagnostic value of plasma microRNA-205（miR-205）and microRNA-21（miR-21） in Non-small Cell Lung Cancer. Methods The preoperative plasma specimens from 29 patients with Non-small Cell Lung Cancer and their postoperative （at day 7 after operation） plasma specimens （only 26 cases among them） were collected. At the same time，the plasma specimens from 33 healthy volunteers were used as the controls. The expression of miR-205 and miR-21 in these samples was measured by real-time fl uorescence quantitative-PCR，and its relationship with the clinical characteristics of patients with Non-small Cell Lung Cancer was analyzed. Results The expression level of miR-205 and miR-21 in preoperative plasma from the patients with Non-small Cell Lung Cancer was higher than that from healthy volunteers （P<0.05）. As compared with the preoperative plasma，the expression of miR-205 in postoperative plasma from 23 cases was decreased remarkably （P＜0.01）.however，the expression level of miR-21 in postoperative plasma group and preoperative plasma group didn't signifi cantly differ （P＞0.05）. The expression of miR-205 and miR-21 in preoperative plasma had a signifi cant impact on lymphatic metastasis and Duke's stage （P<0.05）. For discriminating Non-small Cell Lung Cancer patients from healthy volunteers，the area under the receiver operating characteristic curve was 0.968，and the sensitivity and specifi city were 96.3% and 89.7%，respectively. Conclusion Plasma miR-205 and miR-21，as new biomarkers，the combined detection of them may help the diagnosis of non-small Cell Lung Cancer

Non-small Cell Lung Cancer MicroRNAs Diagnosis Plasma MicroRNA-205 MicroRNA-21

·基礎(chǔ)研究·

浙江省公益技術(shù)研究社會發(fā)展項目（2013C33199）

310000 浙江中醫(yī)藥大學（陳弘磊）

310012 浙江省立同德醫(yī)院（王偉 李芳瓊 劉琴趙桂枝）