核受體共激活因子NCOA5單克隆抗體的制備及其在乳腺癌中的表達(dá)研究

張偉剛 謝芳 何揚(yáng) 錢海鑫?

核受體共激活因子NCOA5單克隆抗體的制備及其在乳腺癌中的表達(dá)研究

張偉剛 謝芳 何揚(yáng) 錢海鑫?

目的 探討核受體共激活因子NCOA5單克隆抗體在診斷人乳腺癌中的應(yīng)用。方法 應(yīng)用小鼠雜交瘤技術(shù)制備能夠識(shí)別NCOA5蛋白的單克隆抗體，利用該抗體采用免疫組化檢測(cè)100例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中NCOA5的表達(dá)。結(jié)果 成功制備能夠特異識(shí)別野生型NCOA5的單克隆抗體8B11，用于乳腺癌標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤的增大，NCOA5的陽性表達(dá)率升高（P=0.008）；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，NCOA5的陽性表達(dá)率升高（P=0.042）；隨著腫瘤TNM分期的增加，NCOA5的陽性表達(dá)率逐漸上升（P=0.028）；NCOA5在ER陰性標(biāo)本中陽性表達(dá)率顯著升高（P=0.006）；NCOA5在PR陰性標(biāo)本中陽性表達(dá)率升高（P=0.025）；NCOA5表達(dá)與年齡、組織學(xué)分級(jí)、HER-2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 利用雜交瘤技術(shù)成功制備一株效價(jià)高、特異性好單克隆抗體8B11；NCOA5在乳腺癌中陽性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及ER、PR的表達(dá)水平相關(guān)，可為乳腺癌的診斷及治療提供一定依據(jù)。

NCOA5 單克隆抗體 特異性 乳腺癌

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，世界范圍的女性腫瘤患者中，發(fā)病率23%，病死率14%［1］。研究表明，長(zhǎng)期暴露于內(nèi)源性激素，是乳腺癌發(fā)生的重要病因［2］，其中雌激素受體ERα的表達(dá)水平是決定乳腺癌治療方式和評(píng)價(jià)預(yù)后的重要指標(biāo)［3］。核受體共激活因子5（NCOA5），能在配體調(diào)節(jié)的情況下與雌激素受體ERα和ERβ形成復(fù)合物，并增強(qiáng)ERα轉(zhuǎn)錄活性［4］。還能作為其他轉(zhuǎn)錄因子的共調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用［5～7］。2014年3月至2015年3月作者通過雜交瘤技術(shù)［8］制備一株識(shí)別NCOA5的單克隆抗體，并將該抗體應(yīng)用于檢測(cè)NCOA5在乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá)，分析其與相關(guān)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET-41a及 Ni-NTA鎳離子純化柱購自美國Novagon公司［9］，克隆用大腸桿菌TOP10及表達(dá)用BL21（DE3）由蘇州大學(xué)唐仲英血液研究中心提供；骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、肝癌細(xì)胞系HepG2為蘇州大學(xué)唐仲英血液研究中心保存；6～8周齡BALB/ c小鼠購自蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；弗氏佐劑、HAT、PEG購于 SIGMA 公司；胎牛血清購自Gibco公司；DMEM、RPMI1640高糖培養(yǎng)基購自Thermo Fisher公司；商品化抗NCOA5多抗購自美國abcam公司。

1.2 單克隆抗體的制備與鑒定 通過檢索NCBI Gene Bank 公布的人類基因NCOA5序列設(shè)計(jì)合成NCOA5 C端的引物，利用PCR擴(kuò)增NCOA5 C端基因片段，連接表達(dá)質(zhì)粒pET41a進(jìn)行原核表達(dá)，通過Ni-NTA柱純化重組蛋白并免疫小鼠。取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0細(xì)胞經(jīng)由PEG融合，間接法ELISA篩選穩(wěn)定分泌抗NCOA5抗體的雜交瘤細(xì)胞，誘生腹水法收集抗體并使用ProteinG親和層析法純化，使用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）、免疫組化（Immunohistochemistry）方法驗(yàn)證單克隆抗體識(shí)別NCOA5的敏感性及特異性。

1.3 臨床資料 選取2007年1月至2012年12月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院及第二醫(yī)院普外科病理資料完整的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌手術(shù)切除標(biāo)本100例行免疫組化檢測(cè)，術(shù)前均未接受放化療或內(nèi)分泌治療，其中男2例，女98例；年齡28～88歲，中位年齡50.5歲。按2003年WHO組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)［10］，其中I級(jí)34例、Ⅱ級(jí)39例、Ⅲ級(jí)27例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例。根據(jù)TNM分期，I期20例、Ⅱa期41例、Ⅱb期30例、＞Ⅲa期9例。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) 每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡高倍視野綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測(cè)定，由兩位資深病理專家評(píng)估。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：不著色0分、黃色1分、棕黃色2分、黃褐色3分。陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 陽性細(xì)胞數(shù)＜ 5%：0分。6%～20%：1分。21%～50%：2分?！?0%：3分。兩種評(píng)分相乘：0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+）、4～6分為陽性（++）、9分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fishers精確概率檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體的制備 通過PCR成功擴(kuò)增NCOA5-C-ter基因片段，經(jīng)酶切、連接構(gòu)建pET-41a/NCOA5-C-ter重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3），成功表達(dá)可溶性的pET-41a/NCOA5-C-ter重組蛋白用于免疫小鼠。細(xì)胞融合后，雜交瘤細(xì)胞分泌的上清液通過間接法ELISA篩選挑選出陽性克隆，再通過有限稀釋法最終得到一株可識(shí)別NCOA5重組蛋白，同時(shí)不識(shí)別pET-41a載體蛋白的穩(wěn)定表達(dá)的雜交瘤細(xì)胞株8B11，經(jīng)過培養(yǎng)擴(kuò)增后注射至小鼠腹腔誘生腹水，大量表達(dá)抗體并收集純化，經(jīng)計(jì)算：抗體濃度為1.50mg/ ml，行間接法ELISA檢測(cè)8B11最高效價(jià)為1：32000。

2.2 Western Blot檢測(cè)抗體特異性 選擇乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及肝癌細(xì)胞系HepG2制備蛋白裂解液，分別使用8B11（1：20000）或商品化抗NCOA5多抗（1：2000）作為一抗行Western Blot顯示：8B11能識(shí)別MCF-7和HepG2細(xì)胞中的蛋白，目的條帶清晰，大小約65kDa，與抗NCOA5多抗所識(shí)別的條帶一致；抗NCOA5多抗額外識(shí)別HepG2中位于43kDa的條帶，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］，為突變型的NCOA5即SNCOA5，而8B11不能識(shí)別該蛋白；8B11能夠識(shí)別作為免疫原的pET-41a/NCOA5-C-ter重組蛋白，而多抗不能，結(jié)果表明8B11能夠特異性識(shí)別野生型NCOA5，其識(shí)別的抗原表位與商品化抗NCOA5多抗不同。

2.3 免疫組化鑒定抗體特異性 選擇病理診斷明確的浸潤性乳腺癌及同側(cè)正常乳腺組織5對(duì)制片完成免疫組化，其典型表現(xiàn)為：8B11組中乳腺癌細(xì)胞核顯示強(qiáng)陽性，為棕黃色或褐色顆粒，境界清晰，周圍間質(zhì)細(xì)胞僅被蘇木素染色，對(duì)照的鼠IgG組內(nèi)乳腺癌細(xì)胞未見陽性染色；8B11組中乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞為陰性或個(gè)別細(xì)胞核弱陽性，對(duì)照的鼠IgG組內(nèi)乳腺癌細(xì)胞未見陽性染色。結(jié)果表明8B11能夠特異性識(shí)別組織切片中定位于細(xì)胞核的NCOA5。

2.4 NCOA5在乳腺癌中的表達(dá) 100例浸潤性乳腺癌標(biāo)本經(jīng)8B11行免疫組化，結(jié)果提示NCOA5定位于細(xì)胞核，其中2例細(xì)胞核與細(xì)胞漿同時(shí)存在弱陽性，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判讀，陰性49例、陽性51例，其中弱陽性（+）37例，中等強(qiáng)度陽性（++）11例，強(qiáng)陽性（+++）3例。見表1。

表1 NCOA5蛋白在浸潤性乳腺癌中的表達(dá)及與臨床病理關(guān)系［n（%）］

3 討論

NCOA5作為重要的核受體共激活因子，在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并參與目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前NCOA5的商業(yè)化抗體較少，不能滿足不同研究需要。文獻(xiàn)報(bào)道［9］，NCOA5在細(xì)胞存在野生型（579個(gè)氨基酸）和突變型（SNCOA5，406個(gè)氨基酸）兩種形式，后者區(qū)別在于其C末端突變導(dǎo)致翻譯提前終止。為獲得能特異性識(shí)別野生型或突變型NCOA5的單抗以及滿足抗原免疫原性的要求，作者選擇表達(dá)NCOA5 C端260～579位的氨基酸作為免疫原，通過雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體8B11，并利用Western Blot和免疫組化進(jìn)行驗(yàn)證。在Western Blot實(shí)驗(yàn)中，8B11能識(shí)別大小約65kDa的抗原蛋白，條帶特異，而完整的NCOA5蛋白分子量為65536Da，因而推斷8B11所識(shí)別的蛋白為NCOA5，為進(jìn)一步證明這點(diǎn)，作者購買商品化的抗NCOA5多抗進(jìn)行對(duì)照，多抗也能識(shí)別位于65kDa處的特異性條帶，表明8B11對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的NCOA5具有良好的親和力與特異性。另外，商業(yè)化多抗額外識(shí)別肝癌細(xì)胞系HepG2中約43kDa處的特異性條帶，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［10］，推測(cè)為突變型NCOA5（SNCOA5），即其第七內(nèi)顯子上的23個(gè)核苷酸移碼插入第七外顯子造成蛋白質(zhì)表達(dá)提前終止的截短突變體。8B11未能識(shí)別該突變體，推測(cè)其抗原表位與多抗不同，僅識(shí)別野生型NCOA5。另外，8B11可用于免疫組化實(shí)驗(yàn)，并顯示NCOA5定位于細(xì)胞核，與報(bào)道一致，結(jié)合之前WesternBlot結(jié)果，表明8B11能特異性識(shí)別細(xì)胞核NCOA5。

NCOA5作為轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。已有研究顯示肝癌及食管癌中NCOA5表達(dá)下調(diào)［7，11］，此外其他腫瘤中尚未見相關(guān)報(bào)道。本資料首次發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中的NCOA5表達(dá)，且5對(duì)乳腺癌標(biāo)本均表現(xiàn)為NCOA5高表達(dá)，而對(duì)應(yīng)的乳腺導(dǎo)管組織中NCOA5低表達(dá)或陰性。由于8B11僅識(shí)別野生型NCOA5，不受SNCOA5的影響，和商品化多抗比較，在利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)NCOA5的表達(dá)時(shí)更有意義。為進(jìn)一步研究NCOA5與乳腺癌的關(guān)系，利用免疫組化檢測(cè)浸潤性乳腺癌臨床標(biāo)本中NCOA5的表達(dá)，結(jié)果提示NCOA5乳腺癌表達(dá)陽性率51%，且不同組織標(biāo)本中表現(xiàn)出強(qiáng)度、染色細(xì)胞數(shù)量的差異。在與傳統(tǒng)的乳腺癌分型指標(biāo)如年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和組織學(xué)分級(jí)等指標(biāo)比較后發(fā)現(xiàn)NCOA5陽性表達(dá)在腫瘤＞2cm及存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中明顯升高，與其一致的是隨著TNM分期的升高，NCOA5的陽性率呈上升趨勢(shì)。在乳腺癌的臨床病理特征中，較大的腫瘤意味著較差的預(yù)后［12］，同時(shí)也增加腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)［13］，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更被認(rèn)為是預(yù)后不良的信號(hào)，大量病例研究表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的患者5年生存率＞90%，而腋淋巴結(jié)陽性的患者5年生存率＜70%［14］。表明NCOA5具有評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后的潛能，其陽性表達(dá)可能提示不良預(yù)后。

ER、PR、HER2作為經(jīng)典的評(píng)價(jià)乳腺癌的指標(biāo)，其表達(dá)水平的高低對(duì)于乳腺癌的治療和預(yù)后有重要影響，通過將NCOA5的表達(dá)與上述三種受體的比較，作者發(fā)現(xiàn)NCOA5在預(yù)后較差的ER、PR陰性的乳腺癌標(biāo)本中陽性率顯著升高，達(dá)70%左右，類似的情況在核受體共激活因子中也有報(bào)道，例如通過檢測(cè)乳腺癌標(biāo)本，研究者發(fā)現(xiàn)ER表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致其共激活因子AIB1的mRNA水平升高［15］，而在ER陰性乳腺癌患者中，AIB1過表達(dá)意味著不良預(yù)后［16］。研究顯示NCOA5能作為其他轉(zhuǎn)錄因子的共調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。在神經(jīng)瘤細(xì)胞中NCOA5作為視黃酸相關(guān)孤兒核受體α（RORα）的共調(diào)解因子參與其對(duì)芳香化酶基因CYP19A1表達(dá)的調(diào)控［6］，而后者正是體內(nèi)合成雌激素的重要酶。此外NCOA5能夠作為共調(diào)節(jié)因子與孤兒核受體Rev-ERbα結(jié)合［4］，Rev-ERbα編碼基因位于染色體17q21，與HER2位于同一區(qū)域，而該區(qū)域經(jīng)常在乳腺癌中異常擴(kuò)增，導(dǎo)致Rev-ERbα和HER2共同在乳腺癌中高表達(dá)［17］。而Rev-ERbα與另外兩種基因異常擴(kuò)增可以作為ER、PR陰性乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)［18］。由此，NCOA5可能與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮作用，而不依賴于ER途經(jīng)影響乳腺癌的生物學(xué)行為，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

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Objective To produce NCOA5 monoclonal antibody and analyze the infl uence of NCOA5 on clinical and pathological parameters by detecting its expression in breast cancer specimens. Methods The monoclonal antibody recognizing NCOA5 protein was produced using hybridoma technique. NCOA5 expression level in breast cancer specimens was detected by immunohistochemistry using monoclonal antibody and the relationship between NCOA5 and clinicopathological parameters was analyzed. Results Mab 8B11 which specially reacted with NCOA5 was identifi ed，the titer and the specifi city was favourable. Immunohistochemistry of breast cancer specimens showed the positive expression rate of NCOA5 correlates with larger tumor size，lymph node metastasis，late TNM stage，negative expression of ER or PR，with statistically signifi cant difference，but has no relationship with age，histologic grade and HER2 status. Conclusion The monoclonal antibody 8B11 specifi cally recognizing endogenous NCOA5 protein was produced. The positive expression rate of NCOA5 in breast cancer correlates with larger tumor size，lymph node metastasis，late TNM stage，negative expression of ER or PR.

NCOA5 monoclonal antibody specifi city Breast cancer

215006 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科（張偉剛 錢海鑫）

215006 蘇州大學(xué)血液工程中心（何揚(yáng)）病理室（謝芳）