醇酶法制大豆油廢液中異黃酮的純化及其抗腫瘤作用研究

穆　瑩,張曉南,徐　漸,張宏偉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

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醇酶法制大豆油廢液中異黃酮的純化及其抗腫瘤作用研究

穆瑩,張曉南,徐漸,張宏偉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

用有機(jī)溶劑萃取和樹脂吸附純化醇酶法制大豆油廢液中的異黃酮,用高效液相色譜檢測(cè)純化的異黃酮的純度。以人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為模型,檢測(cè)純化的大豆異黃酮對(duì)MCF-7增殖的影響。結(jié)果表明,萃取法粗提的最佳萃取溶劑為乙酸乙酯與正丁醇(1∶1)的混合液,異黃酮提取率為70.47%,純度為26.45%;樹脂吸附純化的最佳條件為:樹脂型號(hào),LSA-8;上樣濃度,0.8 mg/mL;上樣流速,0.5 BV/h;洗脫液,75%的乙醇;洗脫流速,6 BV/h;洗脫體積,1.5倍上樣體積,異黃酮提取率為83.28%,純度為71.45%。抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明,大豆異黃酮濃度達(dá)到100 mg/L時(shí),能顯著(p<0.01)抑制MCF-7細(xì)胞的增殖,其作用有一定的劑量依賴性。

大豆異黃酮,純化,抗腫瘤,MCF-7細(xì)胞

大豆異黃酮(soybean isoflavone)是大豆生長(zhǎng)過程中形成的次生代謝產(chǎn)物,它是一類具有多酚結(jié)構(gòu)的混合物的統(tǒng)稱[1-4]。大豆異黃酮是大豆中有效活性物質(zhì)之一,它表現(xiàn)弱的雌激素雙向調(diào)節(jié)作用,具有抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)等多種生理功能[5-8]。有機(jī)溶劑萃取和樹脂吸附純化法是常用的生物活性物質(zhì)提取的方法,其分離純化過程較簡(jiǎn)單,效果較好,并且一般不會(huì)影響分離物的生物活性[9-10]。大豆在用醇酶法制大豆油后,其副產(chǎn)物往往被作為廢物直接丟棄,但這些副產(chǎn)物中含有較豐富的大豆異黃酮,如能合理回收利用則能變廢為寶,有效合理的利用大豆資源。本研究以醇酶法制大豆油副產(chǎn)物為原料,通過有機(jī)溶劑萃取及樹脂吸附法提取大豆異黃酮,并且以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為細(xì)胞模型,研究大豆異黃酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

醇酶法制大豆油副產(chǎn)物(本實(shí)驗(yàn)室保存):大豆用醇酶法提取大豆油后的廢液,其來源工藝如下:

其中下劃線標(biāo)記的上清液即本實(shí)驗(yàn)的原材料。

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7美國(guó)ATCC細(xì)胞庫;DMEM/F12培養(yǎng)基,細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑美國(guó)Gibco公司;乙腈(色譜純),甲醇(色譜純),乙醇(色譜純),磷酸(分析純),二甲基亞砜(分析純),鹽酸(分析純)和萃取用正丁醇,丙酮,乙酸乙酯天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;大豆苷,大豆黃苷,大豆異黃酮,大豆素,大豆黃素,染料木素標(biāo)準(zhǔn)品TEDIA公司。

高效液相色譜儀Agilent 1100,Agilient Technologies;色譜柱ODS3 C18,4.6×250 mm,5μm,Phenomenex;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1000,東京理化;CASY 細(xì)胞分析儀德國(guó);CO-150型CO2培養(yǎng)箱日本三洋;各型號(hào)大孔樹脂國(guó)產(chǎn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立參照國(guó)標(biāo)GB/T 23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法》[11]。其方法與色譜條件如下:分別取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素對(duì)照品各4 mg,分別置于10 mL容量瓶,加入50%二甲基亞砜至接近刻度,超聲處理30 min后用二甲基亞砜定容制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度均為400 mg/L。

8.0、16.0、24.0、32.0、40.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制:分別吸取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素六種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中,加入等體積的水后,再加入50%二甲基亞砜溶液定容。

色譜條件色譜柱:ODS3 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:流動(dòng)相A:乙腈(色譜純);流動(dòng)相B:磷酸水溶液(pH3.0,0.45 μm膜過濾)。A,B流動(dòng)相用前均超聲30 min脫氣。洗脫條件:見表1。流速:1.0 mL/min;波長(zhǎng):260 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:30 ℃。

表1　梯度洗脫條件

1.2.2萃取法初步純化大豆異黃酮本實(shí)驗(yàn)以醇酶法生產(chǎn)大豆油的副產(chǎn)物為原材料,以有機(jī)溶劑萃取法對(duì)原材料中的大豆異黃酮進(jìn)行粗提。所選有機(jī)溶劑為正丁醇,丙酮和乙酸乙酯。萃取方法如下:取醇酶法制大豆油后的上清醇液200 mL,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇,濃縮液用6 mol/L的鹽酸調(diào)pH至4.5,冷藏72 h,3600 r/min離心15 min。取上清加水至總體積為200 mL,此即為大豆異黃酮原料液。此原料液一部分真空干燥用于液相色譜檢測(cè),另一部分用于后續(xù)分離純化。

取200 mL上述原料液,加200 mL萃取溶劑,25 ℃震蕩后靜置萃取,分離萃取上清。大豆異黃酮富集在上清中。萃取3次,合并3次萃取上清的體積,真空干燥,稱重。液相色譜檢測(cè)萃取產(chǎn)物中大豆異黃酮含量,計(jì)算大豆異黃酮的提取率和純度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[12]。

大豆異黃酮提取率(%)={[純化后樣液中大豆異黃酮的含量(mg/g)]/[原料液中大豆異黃酮的含量(mg/g)]}×100

大豆異黃酮純度(%)=[純化后樣液中大豆異黃酮的質(zhì)量(mg)/純化干燥品總質(zhì)量(mg)]×100

1.2.3樹脂吸附法精制大豆異黃酮本實(shí)驗(yàn)將萃取后干燥的異黃酮樣品用離子水溶解,配制成0.6 mg/mL的濃度,在pH為7.0的條件下,35 ℃對(duì)樣品溶液進(jìn)行靜態(tài)吸附24 h,然后用90%乙醇靜態(tài)洗脫,以樹脂的吸附量、吸附率、大豆異黃酮純度和提取率為考察指標(biāo),考察LSA-8、P2002-6、DM130、ADS-22、D100等5種型號(hào)的樹脂對(duì)大豆異黃酮純化效果的影響。

樹脂吸附率(%)={[初始溶液中大豆異黃酮含量(mg)-樹脂吸附后溶液中大豆異黃酮含量(mg)]/初始溶液中大豆異黃酮含量(mg)}×100

樹脂吸附量(mg大豆異黃酮/g干樹脂)=[初始溶液中大豆異黃酮含量(mg)-樹脂吸附飽和后溶液中大豆異黃酮含量(mg)]/樹脂干重(g)

樹脂解吸率(%)={洗脫液中大豆異黃酮含量(mg)/[初始溶液中大豆異黃酮含量(mg)-樹脂吸附后溶液中大豆異黃酮含量(mg)]}×100

選擇好樹脂后,本實(shí)驗(yàn)以樹脂對(duì)大豆異黃酮的吸附率、解吸率為考察指標(biāo),從樣品上樣濃度、上樣流速、洗脫液中乙醇濃度、洗脫流速、洗脫體積等方面優(yōu)化大豆異黃酮的純化條件。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí),先固定其他因素。HPLC檢測(cè)純化產(chǎn)物中大豆異黃酮含量,計(jì)算大豆異黃酮的提取率和純度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的樣品濃度為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL;樣品流速為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 BV/h;洗脫液中乙醇濃度為60%、65%、70%、75%、80%、85%和90%;洗脫流速為2、4、6、8、10 BV/h;洗脫體積為上樣體積的1、1.5、2、2.5倍。

1.2.4大豆異黃酮抗腫瘤活性分析將純化的大豆異黃酮干燥品用DMEM/F12培養(yǎng)液溶解,分別配置成含大豆異黃酮濃度為0、10、100、200、300 mg/L的DMEM/F12培養(yǎng)液待用。將MCF-7細(xì)胞以1×105/mL培養(yǎng)液的密度接種至六孔板中,6孔板中的隨機(jī)5個(gè)孔分別標(biāo)記1、2、3、4和5。待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%左右匯合度時(shí),去掉培養(yǎng)液,細(xì)胞用D-Hanks液洗細(xì)胞3遍,然后在標(biāo)記數(shù)字的空中按數(shù)字順序分別添加含大豆異黃酮濃度為0、10、100、200、300 mg/L的DMEM/F12培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞樣品用CASY細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞活力(經(jīng)制樣處理后活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比)。每組均設(shè)3個(gè)平行。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用單因素方差分析組間差異,結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2　結(jié)果與分析

2.1大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及原液中大豆異黃酮含量檢測(cè)

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與原料液中大豆異黃酮含量檢測(cè)按國(guó)標(biāo)要求配制各組分濃度為8～40 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品,通過高效液相色譜建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,如表2和圖1所示,在標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍內(nèi),經(jīng)重復(fù)進(jìn)樣,R2均在0.9999,在此范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)高(R2≥0.9999),線性范圍較廣,可以用來進(jìn)行分析。

表2　大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1　混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(24.0 mg/L)Fig.1　The chromatogram of mixed standard product(24.0 mg/L)注:圖中峰1～6分別為大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素的峰圖,圖2同。

將原料液烘干品按國(guó)標(biāo)要求稀釋,高效液相色譜檢測(cè)其大豆異黃酮的含量(圖2),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果表明,樣品原液中大豆異黃酮的總含量為0.4135 mg/mL,其中絕大部分為大豆苷和染料木苷。

圖2　樣品色譜圖Fig.2　The chromatogram of sample

2.2萃取法初步純化大豆異黃酮

實(shí)驗(yàn)通過前期預(yù)備實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用乙酸乙酯、正丁醇和丙酮對(duì)原料液進(jìn)行等體積萃取效果均不理想,正丁醇萃取純度高但提取率低,而乙酸乙酯則反之,故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)正丁醇和乙酸乙酯的混合溶劑來萃取大豆異黃酮,以純度×提取率為檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果如圖3所示,正丁醇和乙酸乙酯的體積比為1∶3時(shí),大豆異黃酮純度為12.39%,提取率為75.83%,綜合指標(biāo)為939.53;正丁醇和乙酸乙酯的體積比為3∶1時(shí),大豆異黃酮純度為30.18%,提取率為55.12%,綜合指標(biāo)為1663.52;而正丁醇和乙酸乙酯的體積比為1∶1時(shí),大豆異黃酮純度為26.45%,提取率為70.47%,綜合指標(biāo)為1863.93,明顯高于其他比例組合的綜合指標(biāo)。所以本實(shí)驗(yàn)選用正丁醇和乙酸乙酯體積比為1∶1的混合溶劑作為萃取溶劑對(duì)原料液中大豆異黃酮進(jìn)行萃取。

圖3　不同比例的正丁醇和乙酸乙酯混合溶劑萃取大豆異黃酮的效果Fig.3　The result of extraction of soybean isoflavoneby the mixed solvents of different volume ratio of butyl alcohol and ethyl acetate

大豆異黃酮可溶于丙酮、乙酸乙酯、正丁醇溶液中,而皂甙類物質(zhì)難溶于丙酮等有機(jī)溶劑,多糖、單糖及小分子蛋白質(zhì)也難溶于乙酸乙酯和正丁醇等溶劑,利用此性質(zhì)采用溶劑萃取法可以初步純化大豆異黃酮[13]。袁建[14]等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以氯仿、苯、乙醚作為萃取劑時(shí),大豆異黃酮萃取效率較低;以正丁醇萃取時(shí)萃取率高,但萃取液中雜質(zhì)較多;而以乙酸乙酯萃取時(shí)萃取率稍低,但萃取液中雜質(zhì)較少。本實(shí)驗(yàn)選用體積比為1∶1的正丁醇和乙酸乙酯作為萃取劑,主要是考慮了大豆異黃酮的萃取率,但同時(shí)在一定程度上又兼顧了純度。

2.3樹脂吸附法精制大豆異黃酮

2.3.1吸附樹脂的選擇實(shí)驗(yàn)從LSA-8、P2002-6、DM130、ADS-22、D100等5種型號(hào)的樹脂中進(jìn)行選擇,以樹脂的吸附量、吸附率、純化后大豆異黃酮純度和提取率為考察指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,LSA-8型號(hào)的樹脂在各個(gè)指標(biāo)上均顯著優(yōu)于其余四種型號(hào)的樹脂。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇LSA-8型號(hào)的樹脂對(duì)大豆異黃酮進(jìn)行分離純化。

圖4　不同樹脂對(duì)大豆異黃酮的吸附效果 Fig.4　The result of extraction of different resins for soybean isoflavone注:A:不同樹脂對(duì)大豆異黃酮的吸附量;B:不同樹脂對(duì)大豆異黃酮的吸附率;C:不同樹脂吸附純化后,大豆異黃酮的純度;D:不同樹脂吸附純化后,大豆異黃酮的提取率。

2.3.2上樣濃度及上樣流速對(duì)大豆異黃酮純化的影響以不同上樣濃度和流速為因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察上樣濃度和流速對(duì)LSA-8吸附能力的影響。圖4A結(jié)果表明,上樣濃度為0.4～0.8 mg/mL時(shí),隨上樣濃度的增加,LSA-8對(duì)大豆異黃酮的吸附變化不明顯;上樣濃度在0.8～1.2 mg/mL時(shí),隨上樣濃度的增加,LSA-8對(duì)大豆異黃酮的吸附顯著下降,故最佳上樣濃度應(yīng)為0.8 mg/mL。圖4B結(jié)果表明,上樣流速在0.1～0.5 BV/h時(shí),隨上樣流速的加快,LSA-8對(duì)大豆異黃酮的吸附變化不明顯;上樣流速在0.5～0.9 BV/h時(shí),隨上樣流速的增加,LSA-8對(duì)大豆異黃酮的吸附顯著下降,故最佳上樣流速應(yīng)為0.5 BV/h。綜合上述結(jié)果,在上樣濃度為0.8 mg/mL,流速為0.5 BV/h時(shí),LSA-8樹脂對(duì)大豆異黃酮的吸附效果最好。

圖5　上樣條件對(duì)LSA-8樹脂吸附大豆異黃酮的影響Fig.5　The affect of the conditions of the sample on adsorption rate of LSA-8 resin for soybean isoflavone注:A:上樣濃度對(duì)LSA-8吸附大豆異黃酮的影響;B:上樣流速對(duì)LSA-8吸附大豆異黃酮的影響。

2.3.2洗脫液中乙醇濃度、洗脫流速及洗脫體積對(duì)大豆異黃酮純化的影響以洗脫液中不同乙醇濃度、不同洗脫流速及不同洗脫體積為因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察洗脫液中乙醇濃度、洗脫流速和洗脫體積對(duì)LSA-8解吸能力的影響。圖5A結(jié)果表明,乙醇濃度在60%～75%時(shí),隨乙醇濃度的增加,LSA-8的解吸率逐漸上升;乙醇濃度在75%～90%時(shí),隨乙醇濃度的增加,LSA-8的解吸率逐漸降低,故洗脫液的最佳乙醇濃度應(yīng)為75%。圖5B結(jié)果表明,洗脫流速在2～6 BV/h時(shí),隨洗脫流速的增加,LSA-8的解吸率明顯上升;洗脫流速在6～10 BV/h時(shí),隨洗脫流速的增加,LSA-8的解吸率沒有明顯的上升,故洗脫的最佳流速應(yīng)為6 BV/h。圖5C結(jié)果表明,洗脫體積為上樣體積的1～1.5倍時(shí),隨洗脫液的增加,大豆異黃酮的洗脫量也增加;洗脫體積為上樣體積的1.5～2.5倍時(shí),隨洗脫液體積的增加,大豆異黃酮的洗脫量基本保持不變,故最佳洗脫體積應(yīng)為上樣液體積的1.5倍。綜合上述結(jié)果,在洗脫液乙醇濃度為75%,洗脫流速為6 BV/h及洗脫體積為上樣液體積的1.5倍時(shí),LSA-8樹脂對(duì)大豆異黃酮的解吸效果最好。

表3　樹脂吸附法純化大豆異黃酮的純度和提取率

圖6　不同洗脫條件對(duì)LSA-8樹脂對(duì)大豆異黃酮解吸的影響Fig.6　The affect of different elution conditions on desorption rate of LSA-8 resin for soybean isoflavone注:A:洗脫液中乙醇濃度對(duì)LSA-8樹脂解吸的影響;B:洗脫流速對(duì)LSA-8樹脂解吸的影響;C:洗脫體積對(duì)LSA-8樹脂解吸的影響。

綜合樹脂吸附法結(jié)果,選用最優(yōu)條件對(duì)萃取法粗提的產(chǎn)物進(jìn)行純化,取粗提后的產(chǎn)物1 g,用離子水溶解,在最優(yōu)條件下對(duì)其進(jìn)行純化。結(jié)果如表3所示,在此條件下,純化回收大豆異黃酮提取率為83.71%,純度為72.09%。

大孔樹脂是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的有機(jī)高分子聚合物,應(yīng)用大孔樹脂對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離具有吸附快、解吸率高、吸附容量大、洗脫率高等優(yōu)點(diǎn)。目前,對(duì)于用大孔樹脂柱層析分離純化大豆異黃酮的報(bào)道也比較多。蔡力[15]等的研究表明,用D4006大孔樹脂純化后,大豆異黃酮純度為30.58%;牛新春[16]等選用ADS21型大孔樹脂純化大豆異黃酮,在最優(yōu)條件下得到大豆異黃酮純度為42.70%;井樂剛[17]等用D4006大孔樹脂純化大豆異黃酮純度,制得純度70%以上大豆異黃酮產(chǎn)品;潘廖明[18]等的研究表明,LSA-8型大孔吸附樹脂對(duì)大豆異黃酮具有較好吸附特性。該樹脂對(duì)大豆異黃酮的動(dòng)態(tài)最大吸附量為204.6 mg/g干樹脂,純化后大豆異黃酮含量為57.0%。本研究結(jié)果表明,在LSA-8、P2002-6、DM130、ADS-22和D100 5種樹脂中,LSA-8樹脂分離純化大豆異黃酮效果最好,其最優(yōu)條件下得到的異黃酮產(chǎn)物中異黃酮純度為72.09%,顯著高于上述報(bào)告結(jié)果,且提取率為83.71%,也較理想。

圖7　不同濃度的大豆異黃酮對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響Fig.6　The affect of different concentrations of soy isoflavones on the proliferation of MCF-7 cells注:柱形圖中,上標(biāo)不同小寫字母表示差異極顯著(p<0.01);相同小寫字母表示差異不顯著(p>0.05),A:不同濃度大豆異黃酮處理后細(xì)胞數(shù)的變化;B:不同濃度大豆異黃酮處理后細(xì)胞活力的變化。

綜合上述結(jié)果,醇酶法制大豆油副產(chǎn)物中大豆異黃酮的分離純化的最佳條件及結(jié)果如下:萃取法粗提的最佳萃取溶劑為乙酸乙酯與正丁醇(體積比1∶1)的混合液,萃取后大豆異黃酮純度為26.45%,提取率為70.47%;樹脂吸附法純化的最佳條件為:樹脂型號(hào),LSA-8,上樣濃度,0.8 mg/mL,上樣流速,0.5 BV/h,洗脫液,75%的乙醇,洗脫流速,6 BV/h,洗脫體積,1.5倍上樣體積,該條件下,異黃酮純度為72.09%,提取率為83.71%。

2.4大豆異黃酮抗腫瘤活性

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了添加不同濃度的大豆異黃酮對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如圖7所示,添加大豆異黃酮濃度為10 mg/L時(shí),與空白組細(xì)胞比較,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力無顯著差異(p>0.05),這說明低濃度的大豆異黃酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的增殖沒有抑制效果;添加大豆異黃酮濃度為100、200、300 mg/L時(shí),與空白組細(xì)胞比較,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力均顯著下降(p<0.01),且添加濃度越高,下降越明顯,這說明在濃度≥100 mg/L時(shí),大豆異黃酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的增殖有顯著的抑制效果,且其效果有濃度依賴性。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,大豆異黃酮能通過抑制癌細(xì)胞的增殖來發(fā)揮其抗癌作用[19-22]。本實(shí)驗(yàn)用MCF-7細(xì)胞驗(yàn)證了大豆異黃酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的抑制增殖作用。

3　結(jié)論

萃取法粗提的最佳萃取溶劑為乙酸乙酯與正丁醇(體積比1∶1)的混合液,萃取后大豆異黃酮純度為26.45%,提取率為70.47%;樹脂吸附純化的最佳條件為:樹脂型號(hào),LSA-8;上樣濃度,0.8 mg/mL;上樣流速,0.5 BV/h;洗脫液,75%的乙醇;洗脫流速,6 BV/h;洗脫體積,1.5倍上樣體積,異黃酮提取率為83.28%,純度為71.45%?？鼓[瘤實(shí)驗(yàn)表明,大豆異黃酮濃度達(dá)到100 mg/L時(shí),能顯著(p<0.01)抑制MCF-7細(xì)胞的增殖,其作用有一定的劑量依賴性。

[1]Xi YD,Ding J,Han J,et al. The Effect of Soybean Isoflavone on the Dysregulation of NMDA Receptor Signaling Pathway Induced byβ-Amyloid Peptides 1-42 in Rats[J]. Cellular and Molecular Neurobiology,2015,35(4):555-562.

[2]Roghani M,Mahdavi MRV,Jalali-Nadoushan MR,et al. Chronic Administration of Daidzein,a Soybean Isoflavone,Improves Endothelial Dysfunction and Attenuates Oxidative Stress in Streptozotocin-induced Diabetic Rats[J]. Phytotherapy Research,2013,27(1):112-117.

[3]Takasugi M,Shimada K,Yamada K,et al. Effects of Soybean Isoflavones on the Release of Chemical Mediators from Rat Peritoneal Exudate Cells by Allergic ReactioninVitro[J]. Food Science and Technology Research,2014,20(3):725-730.

[4]Wang Q,Ge X,Tian X,et al. Soy isoflavone:the multipurpose phytochemical(Review)[J]. Biomed Rep,2013,1(5):697-701.

[5]Ding BJ,Ma WW,He LL,et al. Soybean isoflavone alleviatesβ-amyloid 1-42 induced inflammatory response to improve learning and memory ability by down regulation of Toll-like receptor 4 expression and nuclear factor-κB activity in rats[J]. International Journal of Developmental Neuroscience,2011,29(5):537-542.

[6]Lee YK,Park OJ. Soybean isoflavone genistein regulates apoptosis through NF-κB dependent and independent pathways[J]. Experimental and Toxicologic Pathology,2013,65(1-2):1-6.

[7]Bao ZS,Hong L,Guan Y,et al. Inhibition of airway inflammation,hyperresponsive-ness and remodeling by soy isoflavone in a murine model of allergic asthma[J]. Int. Immunopharmacol.,2011,11(8):899-906.

[8]Xi YD,Li XY,Ding J,et al. Soy isoflavone alleviates Abeta1-42-induced impairment of learning and memory ability through the regulation of RAGE/LRP-1 in neuronal and vascular tissue[J]. Curr Neurovasc Res,2013,10(2):144-156.

[9]Cao YF,Xing HB,Yang QW,et al. Separation of Soybean Isoflavone Aglycone Homologues by Ionic Liquid-Based Extraction[J]. J. Agric. Food Chem.,2012,60(13):3432-3440.

[10]張佳秀,侯俊財(cái),鄒艷楠,等.大孔樹脂對(duì)酶解大豆肽脫鹽效果影響極其最佳條件研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(3):203-206.

[11]Baglia ML,Gu K,Zhang X,et al. Soy isoflavone intake and bone mineral density in breast cancer survivors[J]. Cancer Causes Control,2015,26(4):571-80.

[12]李雪玲.大豆異黃酮的提取分離技術(shù)研究[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[13]蘇小紅.Ab-8型大孔吸附樹脂分離純化大豆異黃酮的研究.[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[14]袁建,鞠興榮.大豆異黃酮分離與精制工藝研究[J].食品科學(xué),2002,23(8):118-121.

[15]蔡立,郁建平,占建波.豆粕中大豆異黃酮提取純化工藝研究[J].食品科學(xué),2008,29(4):185-188.

[16]牛新春,張守勤,王長(zhǎng)征,等.大孔樹脂對(duì)豆粕中異黃酮吸附特性的研究[J]. 食品研究與開發(fā),2007,28(4):36-39.

[17]井樂剛,張永忠.用大孔樹脂從大豆乳清中純化大豆異黃酮的一種有效方法[J].化工學(xué)報(bào),2006,57(5):1209-1214.

[18]潘廖明.大豆異黃酮提取分離技術(shù)及檢測(cè)方法研究[D].成都:四川大學(xué),2003.

[19]Yang X,Belosay A,Hartman JA,et al. Dietary soy isoflavones increase metastasis to lungs in an experimental model of breast cancer with bone micro-tumors[J]. Clin Exp Metastasis,2015,32(4):323-333.

[20]孫權(quán),徐俊萍,許惠仙,等.大豆異黃酮抗腫瘤作用的研究[J].食品科技,2009,34(8):60-62.

[21]Hejazi E,Nasrollahzadeh J,Fatemi R,et al. Effects of Combined Soy Isoflavone Extract and Docetaxel Treatment on Murine 4T1 Breast Tumor Model[J]. Avicenna J Med Biotechnol,2015,7(1):16-21.

[22]Liu Y,Hilakivi-Clarke L,Zhang Y,et al. Isoflavones in soy flour diet have different effects on whole-genome expression patterns than purified isoflavone mix in human MCF-7 breast tumors in ovariectomized athymic nude mice[J]. Mol Nutr Food Res,2015,27. doi:10.1002/mnfr.201500028.[Epub ahead of print].

Extraction of soybean isoflavone from byproducts of enzyme-assisted alcohol leaching soybean oil and its activity of anticancer

MU Ying,ZHANG Xiao-nan,XU Jian,ZHANG Hong-wei

(Food Science College of northeast agricultural university,Harbin,Heilongjiang,150030)

The isoflavone was purificated from byproducts of enzyme-assisted alcohol leaching soybean oil by organic solvent extraction and resin adsorption. The purity of isoflavone was investigated by high performance liquid chromatography(HPLC). The human breast cancer cell line MCF-7 was used as the model cells and the affect of soybean isoflavone on the proliferation of MCF-7 cells were studied. The result showed that the optimum extraction solvent for purification of soybean isoflavone was ethyl acetate and n-butyl alcohol mixture(1∶1)and the extraction rate and purity of isoflavone were 70.47% and 26.45%,respectively. The optimum conditions of resin adsorption for extraction of isoflavone were as follows:the adsorption resin was LSA-8,the concentration and flow rate of the sample were 0.8 mg/mL and 0.5 BV/h,respectively,the eluent solution was 75% ethanol and the flow rate and volume of eluent solution were 6 BV/h and 1.5 times of the sample volume,respectively. The extraction rate and purity of soybean isoflavone under the optimal condition of resin adsorption extraction were 83.28% and 71.45%,respectively. The MCF-7 cell experiments suggested that when the concentration of soybean isoflavone was up to 100 mg/L,it could significantly inhibit the proliferation of human breast cancer cell. And the anticancer function of soybean isoflavone was concentration-dependent.

soybean isoflavone;purification;anticancer;MCF-7 cells

2015-05-15

穆瑩(1982-)，女，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)員，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail:my1982123456@163.com。

TS229

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000