海蜇生殖腺酶解肽的抗氧化活性和ACE抑制活性研究

石曉梅,孫美玲,車麗輝,付穎寰

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034;2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116034;3.大連工業(yè)大學(xué)輕工與化學(xué)工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

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海蜇生殖腺酶解肽的抗氧化活性和ACE抑制活性研究

石曉梅1,2,孫美玲1,2,車麗輝1,2,付穎寰2,3

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034;2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116034;3.大連工業(yè)大學(xué)輕工與化學(xué)工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

海蜇,生殖腺,肽,抗氧化,ACE

高血壓是最常見(jiàn)的心血管疾病之一,發(fā)病率高且易引起其他并發(fā)癥,嚴(yán)重危害著人類健康[1]。在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE,EC 3.4.15.1)對(duì)調(diào)節(jié)血壓起著關(guān)鍵作用[2],因此,抑制ACE的活性是有效治療高血壓的手段之一。目前多用化學(xué)合成的ACE抑制劑治療高血壓,而這類藥物往往會(huì)引起咳嗽、血管神經(jīng)性水腫等副作用[3]。從天然蛋白源中開(kāi)發(fā)ACE抑制肽來(lái)代替化學(xué)合成抑制劑已成為這一研究領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。

活性氧(ROS)是生物氧化代謝的必然產(chǎn)物,包括各種不穩(wěn)定的自由基,如超氧自由基,羥基自由基,過(guò)氧自由基,烷氧自由基等,其介導(dǎo)的氧化反應(yīng)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不利影響,如氧化細(xì)胞內(nèi)的生物大分子,從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。自由基與許多疾病和衰老有關(guān),如關(guān)節(jié)炎、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等[4]。因此,應(yīng)該嚴(yán)格控制ROS的生成量,此時(shí)就需要補(bǔ)充抗氧化劑來(lái)維持這一平衡來(lái)保護(hù)細(xì)胞[5]。此外,許多研究表明過(guò)量的ROS已經(jīng)成為一個(gè)可能誘發(fā)和加重高血壓的途徑[6]。功能食品的開(kāi)發(fā)將成為一種低成本、無(wú)副作用的預(yù)防與治療手段[7]。

海蜇(Rhopilema esculentum Kishinouye)是近海域大型的營(yíng)浮游暖水性水母類動(dòng)物,營(yíng)養(yǎng)豐富,味美可口,具有重要的藥用價(jià)值,如擴(kuò)張血管,降血壓作用等[8]。最近的許多研究表明海洋動(dòng)物副產(chǎn)物的酶解物具有抗氧化或ACE抑制活性,如蝦夷扇貝生殖腺[9],海膽生殖腺[10]]等。本文采用外源酶水解海蜇生殖腺,研究其水解產(chǎn)物的抗氧化性和ACE抑制活性,以此來(lái)提高海蜇生殖腺的附加值,也為后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

海蜇生殖腺遼寧省營(yíng)口市榮發(fā)參蜇有限公司。

Angiotensin Ⅰ-Converting Enzyme(from rabbit lung,ACE)、N-Hippuryl-His-Leu hydrate(98%,HHL)、98% Hippuric acid(Hip)、2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH,98%)、乙腈SIGMA公司,色譜純;三氟乙酸(TFA)天津市光復(fù)精密化工研究所,色譜純;木瓜蛋白酶、胰蛋白酶上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;中性蛋白酶廣西南寧龐博生物工程有限公司;Alcalase 2.4 L酶諾維信有限公司。

E2695高效液相色譜儀美國(guó)Waters公司;8050超濾攪拌器Milipore公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1超臨界CO2萃取脫脂 收集新鮮海蜇生殖腺,經(jīng)冷凍干燥后粉碎,置于萃取釜中,用超臨界CO2流體抽提脫脂。萃取釜溫度35 ℃,壓力30 MPa;分離釜溫度55 ℃,壓力8～10 MPa;CO2流量維持在18～20 L/h范圍內(nèi)。冷卻泵溫度為1 ℃,萃取1.5～2.0 h。脫脂后,取萃取釜中脫脂粉做為后續(xù)酶解的原料。

1.2.2氨基酸組成測(cè)定 按照大連依利特Elite-AAK氨基酸分析系統(tǒng),采用高效液相色譜進(jìn)行氨基酸分析。

總氨基酸組成測(cè)定樣品的處理方法:于5 mL的安醅瓶中,準(zhǔn)確稱取25 mg 樣品,加入3 mL鹽酸(6 mol/L)。用酒精噴燈封口,放入110 ℃烘箱中恒溫水解24 h。將水解后的樣品在80 ℃水浴中蒸干之后,用衍生緩沖液定容至25 mL,經(jīng)0.45 μm 微孔膜過(guò)濾后備用。為了測(cè)定樣品中色氨酸含量,同時(shí)做堿水解實(shí)驗(yàn)。

游離氨基酸組成測(cè)定樣品的處理方法:樣品∶去離子水為1∶9勻漿,在85 ℃水浴中提取30 min。離心取上清并定容到100 mL。取5 mL加入45 mL丙酮,振蕩均勻,靜置片刻,10000 rpm離心15 min。取上清5 mL,用衍生緩沖液定容至25 mL,0.45 μm 微孔膜過(guò)濾后,備用。

樣品的柱前衍生化:于25 mL 的小容量瓶中加入5 mL 樣品溶液、2.5 mL衍生化溶液,60 ℃水浴中暗反應(yīng)1 h。冷卻至室溫,用平衡緩沖溶液定容,靜置約15 min,經(jīng)0.45 μm微孔膜過(guò)濾后,用氨基酸分析柱(大連,依利特)進(jìn)行HPLC分析。

1.2.3酶解蛋白酶的選取及酶解條件參照實(shí)驗(yàn)室前期研究[9,10]。稱取海蜇性腺凍干粉溶于一定體積的去離子水中,在蛋白酶最適溫度水浴中預(yù)熱10 min,調(diào)節(jié)pH為蛋白酶的最適pH,加入蛋白酶開(kāi)始反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)滴加標(biāo)準(zhǔn)堿溶液或酸溶液,維持初始pH,水解3 h后,沸水浴滅酶10 min,4 ℃,10000 r/min離心20 min,取上清,得到海蜇生殖腺蛋白水解產(chǎn)物(JGPH),冷凍干燥。

表1　四種蛋白酶的水解條件

1.2.4水解度水解度定義為水解過(guò)程中斷裂肽鍵數(shù)與底物中肽鍵總數(shù)的百分比,本實(shí)驗(yàn)水解度的測(cè)定采用pH-stat 法[10],其計(jì)算公式如下:

式中:DH-水解度,%;B-保持pH不變所消耗的堿(NaOH)的體積,mL;Nb-堿的當(dāng)量濃度,mol/L;Mp-底物中蛋白總量,g;htot-底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù),mmol/g,本研究中htot以7.5 計(jì)[10];α-水解過(guò)程中α-氨基的解離度,計(jì)算公式如下:

1.2.5分子量分布測(cè)定將四種酶解液凍干粉配制成相同濃度,用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后,采用HPLC(依利特,P 230),凝膠色譜柱Superdex Peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm,GE)測(cè)定分子量分布。進(jìn)樣量40 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm;流動(dòng)相為30%乙腈:70%水(含有0.5% TFA);流速為0.4 mL/min。分別選用Cytochrome C(12500 u),Aprotinin(6512 u),Vitamin B12(1355 u),氧化型谷胱甘肽(613 u),還原型谷胱甘肽(307 u),gly-gly-gly(189 u),Vitamin C(176 u)和L-羥脯氨酸(131 u)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)凝膠過(guò)濾色譜理論,分子量的對(duì)數(shù)lgMr(y)與保留時(shí)間Rt(x)呈線性關(guān)系,得到分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-0.0799x+5.8616(R2=0.9882)。

1.2.6DPPH自由基清除率參照姚翔等[11]方法,樣品組以2 mL樣品溶液,加入2 mL 0.04 g/L DPPH無(wú)水乙醇溶液,振蕩均勻,避光反應(yīng)20 min后,3500 rpm離心10 min,517 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)s;空白組以2 mL無(wú)水乙醇代替DPPH溶液,其吸光值為Ab;對(duì)照組以2 mL去離子水代替樣品溶液,其吸光值為Ac。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下

1.2.7ACE抑制活性測(cè)定依據(jù)Cushman等[12]方法的原理,參考Liu等[13]的方法。反應(yīng)體系為pH 8.3,含有0.3 mol/L NaCl,0.1 M硼酸的緩沖液。于1.5 mL離心管中,取50 μL,5 mmol/L HHL,加入20 μL樣品溶液,混合均勻,37±0.5 ℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min,然后加入20 μL,0.1 U/mL ACE,充分混勻。37 ℃恒溫水浴保溫60 min后,加入10 μL,0.2 mol/L HCl中止反應(yīng)。同時(shí)用20 μL水代替樣品作為空白對(duì)照組。反應(yīng)液離心后用HPLC(Waters)檢測(cè)Hip 生成量。

色譜條件:Ghall 12S05-2546 C18柱(250 mm×4.6 mm);乙腈:水(含0.05% TFA)=25∶75,等梯度洗脫;流速0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm;進(jìn)樣量10 μL。ACE抑制率計(jì)算公式如下:

式中:A樣品-加入抑制劑組中馬尿酸的峰面積;A對(duì)照-空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積。

1.2.8超濾膜分離中性蛋白酶水解液利用超濾膜將中性蛋白酶制備的JGPH混合物上清液進(jìn)行超濾分級(jí),使其先后通過(guò)截留分子量為3000 u和1000 u的超濾膜,實(shí)現(xiàn)分段截留,壓力控制在0.1～0.2 MPa范圍內(nèi)。得到JGPH-P1(大于3000 u)、P2(1000～3000 u)、P3(小于1000 u)不同分子量等級(jí)的三部分,低溫冷凍干燥。

1.2.9電子自旋共振(ESR)技術(shù)檢測(cè)不同分子量組分的自由基清除能力

1.2.9.1DPPH自由基清除能力200 μmol/L的DPPH,95%乙醇溶液,與不同濃度的樣品混合,暗反應(yīng)30 min后,立即吸入毛細(xì)血管,放入諧振腔掃描檢測(cè)。用去離子水代替樣品作空白對(duì)照。掃描條件如下:中心磁場(chǎng)強(qiáng)度3418.78 G;微波功率6.23 mW;微波頻率9.44 GHZ;放大倍數(shù)1.0×105;調(diào)制幅度1.0 G;調(diào)制頻率100 kHz;時(shí)間常數(shù)163.84 ms;轉(zhuǎn)化時(shí)間80 ms。

式中h0、hs分別代表空白對(duì)照和加入樣品后圖譜中最高峰的峰高。

式中h0、hs分別代表空白對(duì)照和加入樣品后圖譜中第二峰的峰高。

式中h0、hs分別代表空白對(duì)照和加入樣品后圖譜中第一峰的峰高。

1.2.10統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所得數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)之間兩兩比較的Student-Newman-Keuls檢驗(yàn),p<0.05時(shí)具有顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1氨基酸組成分析

氨基酸的組成會(huì)影響食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,表2是海蜇生殖腺的總氨基酸組成及游離氨基酸組成測(cè)定結(jié)果?？偘被岷陀坞x氨基酸都含有人體必需氨基酸,分別占各自總體的38.83%和40.72%。其中芳香族氨基酸和疏水氨基酸分別占總氨基酸的12.82%和34.26%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道疏水性氨基酸具有顯著的自由基清除能力[14],而且疏水性氨基酸和芳香族氨基酸對(duì)ACE抑制活性有重要作用[15],這說(shuō)明海蜇生殖腺蛋白可作為制備抗氧化肽和ACE抑制肽的原料。

2.2四種蛋白酶水解度比較分析

按照表1的條件進(jìn)行酶解,四種蛋白酶水解海蜇生殖腺脫脂粉的水解度曲線如圖1所示。由圖可見(jiàn),隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),水解度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在酶解時(shí)間為3 h時(shí)Alcalase堿性蛋白酶的水解度最大,為21.04%;中性蛋白酶次之,為14.68%。因DH影響著肽鏈的長(zhǎng)度和末端氨基酸的種類,所以需要結(jié)合后面的活性測(cè)定選擇合適的蛋白酶作為制備海蜇生殖腺多肽的工具酶。

表2　海蜇生殖腺氨基酸組成

注:a為人體必需氨基酸,b為芳香族氨基酸,c為疏水性氨基酸。

圖1　四種蛋白酶水解度變化曲線Fig.1　Kinetic curves of the proteolysis of jellyfish gonad by various proteases

2.3四種蛋白酶的水解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布

經(jīng)HPLC法對(duì)海蜇生殖腺水解產(chǎn)物進(jìn)行分子量分布測(cè)定,結(jié)果如圖2所示。通過(guò)分子量標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖可知,海蜇生殖腺經(jīng)四種蛋白酶水解的水解產(chǎn)物分子量分布變化不大,主要分布在150～3000 u范圍內(nèi)。由圖2可知,胰蛋白酶和中性蛋白酶的水解產(chǎn)物的分子量較木瓜蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物的分布范圍較小,主要集中在150～500 u,分別占水解產(chǎn)物的64.63%和73.15%。

圖2　四種蛋白酶的水解產(chǎn)物的分子量分布曲線Fig.2　Molecular weight distributions of JGHPs derived from the four proteases

2.4四種蛋白酶水解產(chǎn)物的活性分析

將四種蛋白酶水解產(chǎn)物配制成10 mg/mL,測(cè)定其ACE抑制率和DPPH自由基清除率,結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出,中性蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制率和DPPH自由基清除率均高于其他三種蛋白酶,分別為68.03%(5 mg/mL,p<0.05)和56.84%(2 mg/mL,p<0.05)。結(jié)合酶解水解度和水解產(chǎn)物分子量分布分析,雖然Alcalase堿性蛋白酶的DH最大,但是其產(chǎn)物活性均低于中性蛋白酶;而胰蛋白酶的產(chǎn)物分子量雖小,但是其水解速度較慢,活性也低;只有中性蛋白酶可同時(shí)兼顧水解度與產(chǎn)物活性,故而選擇中性蛋白酶作為制備海蜇生殖腺肽的工具酶。

圖3　四種蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制活性和DPPH清除活性分析Fig.3　ACE inhibitory activity and DPPH scavenging activities of JGHPs derived from the four proteases

2.5中性蛋白酶水解產(chǎn)物超濾組分的活性測(cè)定

中性蛋白酶水解液依次經(jīng)截留分子量為3000 u和1000 u的超濾膜分離,冷凍干燥后,配制成10 mg/mL溶液測(cè)定DPPH清除率(ESR法)和ACE抑制率,測(cè)定結(jié)果如圖4和圖5所示。由圖4可見(jiàn),組分JGPH-P3的DPPH清除率高于其他兩個(gè)組分,為67.53%(2.5 mg/mL,p<0.05)。且JGPH-P3的ACE抑制率高達(dá)87.35%(2 mg/mL,p<0.05),高于其他兩個(gè)組分,其IC50為1.06 mg/mL。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,活性高的ACE抑制肽和抗氧化肽的活性與分子量大小密切相關(guān),分子量小的肽活性通常高[16],故可選用JGPH-P3進(jìn)行后續(xù)的分離純化高活性的ACE抑制肽和抗氧化肽。

圖4　超濾分離組分的DPPH自由基清除能力Fig.4　DPPH scavenging capacity of peptide fractions obtained by ultrafiltration

圖5　濾分離組分的ACE抑制活性Fig.5　ACE inhibitory activity of peptide fractions obtained by ultrafiltration

2.6海蜇生殖腺酶解肽的自由基清除能力

圖6　JGPH-P3的DPPH·清除率 Fig.6　DPPH· scavenging activity of JGPH-P3

圖7　JGPH-P3的·OH清除率 Fig.7　·OH scavenging activity of JGPH-P3

圖8 JGPH-P3的清除率Fig.· scavenging activity of JGPH-P3

3　結(jié)論

3.1選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶分別對(duì)海蜇生殖腺脫脂粉其進(jìn)行水解,以酶解產(chǎn)物的水解度、DPPH清除活性和ACE抑制活性為指標(biāo),選定中性蛋白酶為制備海蜇生殖腺活性肽的工具酶。

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Antioxidative and ACE-inhibitory Activity of Enzymatic Hydrolysates of Jellyfish Rhopilema esculentum Kishinouye Gonad

Shi Xiao-mei1,2,Sun Mei-ling1,2,Che Li-hui1,2,Fu Ying-huan2,3

(1.School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.National Engineering Research Center of Seafood,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;3. School of Light Industry and Chemical Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

To obtain antioxidant peptides and antihypertensive peptides from jellyfish Rhopilema esculentum Kishinouye gonad protein hydrolysate(JGPH),trypsin,papain,Alcalase and Neutrase were employed for enzymatic hydrolysis. Then degree of hydrolysis,antioxidant activities and antihypertensive activities of their hydrolysates were investigated using both 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging assay and angiotensin-I-converting enzyme(ACE)inhibition assay. JGPH was ultrafiltrated using ultrafiltration membranes(molecular weight cut-offs of 1000 and 3000 u)to give three components JGPH-P1-3 which molecular weight distributions were>3000 u,1000-3000 u and<1000 u,then antioxidant activities and antihypertensive activities of three components were investigated. The results revealed that degree of hydrolysis,DPPH radical scavenging activity and ACE-inhibitory activity of JGPH prepared by Neutrase were highest,and Neutrase was selected as the tool enzyme. JGPH-P3 has the highest DPPH radical scavenging activity and ACE-inhibitory activity(IC50=1.06 mg/mL).And its DPPH radical scavenging activity(IC50=0.38 mg/mL),hydroxyl radical scavenging activity(IC50=0.63 mg/mL)and superoxide anion radical scavenging activity(IC50=0.59 mg/mL)were investigated by using electron spin resonance measurement(ESR). Thus,molecular weight less than 1000 u of of JGPH prepared by Neutrase exhibited high antioxidant activities and antihypertensive activities.

jellyfish;gonad;peptides;antioxidant;ACE

2015-04-07

石曉梅(1988-),女,碩士,研究方向:食品中活性組分開(kāi)發(fā),E-mail:595618465@qq.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31501431);遼寧省優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LJQ2013058);中式烹飪水產(chǎn)調(diào)理食品開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化(2014BAD04B09);國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心組建項(xiàng)目(2012FU125X03);海洋食品和農(nóng)產(chǎn)品加工工程研究中心(遼教發(fā)[2011]191號(hào))。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000